Высушенные восстановленные везикулы для фармацевтического применения

Высушенные восстановленные везикулы для фармацевтического применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение имеет отношение к композициям высушенных восстановленных везикул (DRV) и к их лекарственным формам на водной основе, которые содержат один или несколько терапевтических средств (например, гидрофильный белок). В особенности, оно имеет отношение к везикулам DRV, включающим, по меньшей, один липид и средство, стимулирующее слияние, которые после восстановления образуют большие многослойные липосомы, инкапсулирующие в водной фазе активное средство.

Известно, что липосомы, применяемые в качестве переносчиков биологических и терапевтических активных соединений, способствуют доставке этих соединений в организм. Липосомы обычно включают замкнутую липидную каплю, которая имеет внутреннее пространство, в котором соединение обычно содержится в водной среде. В некоторых воплощениях соединение химически связано с липидным компонентом или просто содержится внутри водного внутреннего компартмента липосомы. Существуют различные типы липосом: мультивезикулярные липосомы (MVL) с множеством неконцентрических внутренних камер с водой внутри каждой липосомной частицы; многослойные везикулы (MLV), имеющие серии практически сферических оболочек, сформированных из липидных бислоев, перемежающихся с водными слоями, и имеющие диаметр, варьирующий вплоть до 5 мкм или крупнее; крупные однослойные везикулы (LUV), диметр которых варьирует от 600 нм до 1 мкм или крупнее, имеющие липидный бислой, окружающий большую, неструктурированную водную фазу; и маленькие однослойные везикулы (SUV), структура которых похожа на структуру везикул LUV, за исключением того, что их диаметр меньше примерно 0,2 мкм.

В этой области техники хорошо известны разнообразные способы получения липосом, некоторые из них описаны в издании «Liposome Technology», 2-ое издание, в G.Gregoriadis, CRC Press Inc., Boca Raton (1993). Основные трудности в технологии получения липосом заключаются в том, каким способом обеспечить высокий уровень нагрузки липосом активным средством и как сделать эту нагрузку стабильной при использовании и хранении. Другая трудность заключается в том, как подобрать скорость освобождения активного средства для специфических целей липосомной композиции. Хотя инкапсулирование биологического материала в липосомы потенциально важно для доставки лекарственных средств у людей, в промышленных масштабах получение материала, заключенного внутри везикул, часто бывает затруднительным.

Для того чтобы избежать нежелательных побочных эффектов, таких как эмболия, описанная для крупных липосом, большинство фармацевтических способов парентерального применения сфокусированы на маленьких липосомах. К тому же, вероятно, не так затруднительно производить стабильный продукт, применяя маленькие липосомы.

Существует несколько известных способов получения материала, заключенного в MLV, как в небольших масштабах, так и в промышленных масштабах (Rao, "Preparation of Liposomes on the Industrial Scale. Problems And Perspectives," in Liposome Technology 2nd Edition in G.Gregoriadis, CRC Press Inc., Boca Raton, pp 49-65 (1993)). В большинстве случаев, к тонкой липидной пленке, образовавшейся на стенках контейнера после удаления органического растворителя, добавляют водный раствор вещества, которое предполагают заключить внутрь липосом, и контейнер взбалтывают. В результате происходит инкапсулирование активного средства внутрь MLV. Основной недостаток такого способа заключается в неравномерности процесса инкапсулирования, и часто возникающего низкого или невоспроизводимого инкапсулирования биологического средства внутрь липосом в дополнение к деградации биологического средства и нестабильности суспензии липосом при хранении.

С помощью способа, описанного в патенте ЕР 0678017, многослойные везикулы (FATMLV) получают с помощью замораживания-оттаивания. Способ получения везикул FATMLV требует, чтобы замораживание и оттаивание проводили в присутствии того вещества, которое предполагается инкапсулировать. Однако если подвергать чувствительные вещества, такие как белки, столь грубой физической процедуре, то это приведет к инактивации или деградации материала. К тому же, многократные циклы замораживания и оттаивания не подходят для крупномасштабного производства и требуют высоких затрат для технического воплощения.

Известно, что липосомы и их содержимое могут быть относительно нестабильны в водной дисперсии. Следовательно, в нескольких способах получения усилия были сосредоточены на продлении короткого срока хранения липосомальной композиции с помощью дегидратации.

Усовершенствование пассивного инкапсулирования активного средства липосомами и хранения липосом, включающих активное средство, было достигнуто при применении способа дегидратации-регидратации (патенты ЕР 0485143, WO 90/03795, ЕР 0678017 и ссылки в этих патентах), в котором заранее полученные липосомы добавляют к водному раствору, содержащему активное средство, или их смешивают с лиофилизированным белком, затем следует дегидратация смеси и последующая регидратация смеси в водной среде. Когда раствор высушивают до состояния высоковязкой липидной смеси, отдельные липосомы сливаются с образованием везикул MLV, которые инкапсулируют активное средство между ламеллами. В процессе регидратации, образуются липидные везикулы, в которые заключено вещество. Этот способ приводит к довольно низкой эффективности включения в зависимости от лекарственного средства, которое намереваются инкапсулировать, из-за нестабильности липосом, из-за утечки активного средства или физической инактивации или деградации инкапсулированного вещества.

Известно, что добавление сахара, в качестве консерванта (например, в качестве наполнителя), перед дегидратацией и образованием сухого липидного порошка может предохранить липосомы, полученные с помощью лиофилизации. Наполнители описаны в патентах ЕР 0678017, WO 90/03795, WO 97/42936, WO 92/02208, ЕР 190315 и в издании Liposomes 2nd edition, A Practical Approach, edited by Vladimir P.Torchilin and Volkmar Weissig, Oxford University Press (2002). Их применяют для защиты везикулы от повреждения и утечки активного средства в процессе лиофилизации и для того, чтобы избежать слияния маленьких однослойных везикул до крупных многослойных структур.

В патенте WO 97/42936 описан способ получения лиофилизированных везикул MLV, в которые заключена композиция амфифильного лекарственного средства в дополнение к сорбитолу, примененному в качестве средства, стабилизирующего мембрану.

В патенте WO 90/03795 описано применение криопротекторов, таких как сахара (например, сахароза, маннитол, лактоза, трегалоза, мальтоза), и, по меньшей мере, одного белка (например, альбумина, желатина или казеина) при проведении высушивания липосомальных препаратов для защиты дегидратируемого продукта от повреждения в процессе лиофилизации и последующего восстановления, для сохранения целостности бислоя липосом (например, наблюдали незначительное слияние или агрегацию или не наблюдали их совсем) и для того, чтобы избежать утечки липосом. Если не добавлять каких-либо лиопротекторов, то липосомы после высушивания и регидратации полностью сжимаются и образуют везикулы MLV, содержимое которых в значительной степени потеряно и крупный размер которых не допускает правильного распределения при системных применениях.

Ozer et al. описал применение криопротекторов, таких как полиспирты и сахариды и белки или аминокислоты, для сохранения структуры и целостности мембранных бислоев и для предотвращения слияния везикул и агрегирования при дегидратации и замораживании (Ozer, Y. et al. (1988) Influence of Freezing and Freeze-drying on the Stability of Liposomes Dispersed in Aqeous Media. Acta Pharm. Technol. 34: 129-139).

Патент ЕР 0560138 раскрывает высушенные реконструированные липосомы для включения липофильных веществ, таких как нифедипин, и способы получения этих липосом, включающих фосфолипид, антиоксиданты, криопротектор и стабилизатор рН. Однако раскрытые способы наносят вред активным соединениям, таким как белки. Криопротекторы, такие как редуцирующие сахара (например, глюкоза), модифицируют белки с помощью химической реакции и приводят к образованию небольших везикул, например, со средним диаметром, равным от 40 до 200 нм.

В патенте США US 5,290,563 раскрыт способ инкапсулирования гетерогенных соединений, таких как белковые аллергены и/или экстракты аллергенов, внутрь липосом, включающих, по меньшей мере, один ионный липид, без добавления криопротекторов. Присутствие таких гетерогенных веществ стабилизирует липосомы.

Согласно Kim et al. липосомы следует получать с помощью выпаривания органических растворителей из хлороформ-эфирных сферул, суспендированных в воде (Kim, S. et al. (1983) Preparation of multivesicular liposomes. Biochim. Biophys. Acta 728: 339-348).

Согласно Cruz et al. и ссылкам, приведенным в этой работе, липосомы следует получать как системы-переносчики для белков. Раскрытые способы имеют такие же недостатки, как описаны выше, например, применение органических растворителей, приводит к низкой эффективности инкапсулирования или не может быть применено для крупномасштабного производства (Cruz, М. Е. et al. (1989) Liposomes as carrier systems for proteins: factors affecting protein encapsulation. Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer 417-426).

Патент WO 2007/067784, в целом, имеет отношение к липосомальным фармацевтическим композициям, которые содержат один или несколько гидрофобных терапевтических средств (например, лекарственных средств). Однако патент WO 2007/067784 не обращен к проблеме липосом, которые инкапсулируют белки. Фактически его идея заключается в применении криопротекторов, которые стабилизируют липидные мембраны и/или предотвращают образование везикул MLV после регидратации.

Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа получения инкапсулирующих белки липосом в сухой форме, которые могут быть регидратированы и которые можно применять для крупномасштабного производства.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении препаратов липосом, которые могут быть регидратированы, которые, будучи дегидратированы, могут храниться в течение продолжительного периода времени, и которые после восстановления превратятся в дисперсию многослойных везикул с активным веществом, инкапсулированным в водную фазу липосом.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы избежать необходимости в нескольких стадиях замораживания и оттаивания при производстве везикул MLV, инкапсулирующих активное средство, для того, чтобы предотвратить разрушение или инактивацию активного средства.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа дегидратации липосом и способа их хранения в виде высушенной в присутствии активного средства липидной лекарственной формы, эта высушенная липидная лекарственная форма затем может быть регидратирована с помощью добавления водного раствора для формирования многослойных липосом с высокой скоростью инкапсулирования активного средства, в результате чего восстановление высушенного продукта осуществляют удобным способом.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа крупномасштабного производства высушенных восстановленных везикул MLV, который представляет собой простой, реально осуществимый и экономичный способ.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении высушенных восстановленных везикул размером более чем 1 мкм для лечения заболеваний, например, заболеваний костей и/или суставов, таких как костно-хрящевые нарушения и остеоартрит.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа производства липосом, которые способны с высокой эффективностью включать гидрофильный белок, который исключает органические растворители или детергенты, который легко выполнить в крупном масштабе, который дает стабильный продукт при хранении без разрушения белка, который позволяет осуществить замедленное высвобождение белка и который обеспечивает липосомы, достаточно крупные для того, чтобы избежать быстрого выведения из места наложения.

В одном из аспектов, изобретение имеет отношение к высушенной фармацевтической композиции, которая включает лиофилизированные включающие активное средство везикулы, включающие

а) по меньшей мере, один липид, b) по меньшей мере, одно активное средство, с) средство, способствующее слиянию, и d) не включающие средство, стабилизирующее мембрану, в которой регидратация высушенной фармацевтической композиции приводит к образованию многослойных липосом, имеющих средний диаметр липосомы, равный более чем 1 мкм, эти липосомы инкапсулируют активное средство.

Высушенную фармацевтическую композицию в соответствии с изобретением можно стабильно хранить в течение длительного времени. Предпочтительно, высушенная фармацевтическая композиция изобретения представляет собой лиофилизированную композицию. Поскольку композиция в высушенной или в лиофилизированной форме стабильна, ее можно легко восстановить путем добавления водного раствора. Добавление водного раствора приводит к образованию многослойных липосом, имеющих средний диаметр липосомы, равный более чем 1 мкм, предпочтительно, равный примерно 1,5 мкм или крупнее. Эти многослойные липосомы инкапсулируют активное средство с высокой эффективностью инкапсулирования, равной, предпочтительно, по меньшей мере, 40%, в особенности, равной, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно равной, по меньшей мере, 55%, даже более предпочтительно равной, по меньшей мере, 60% и наиболее предпочтительно равной, по меньшей мере, 80%.

Композиция высушенной фармацевтической композиции изобретения включает, по меньшей мере, один липид, по меньшей мере, одно активное средство, по меньшей мере, средство, способствующее слиянию, и не включает средство, стабилизирующее мембрану. Предпочтительно, по меньшей мере, одно активное средство представляет собой белок, в особенности, гидрофильный белок или его активный фрагмент. Особенно предпочтительны те белки, которые представляют собой регенерирующее средство для кости и/или хряща, предпочтительно CD-RAP. Предпочтительные средства, способствующие слиянию, представляют собой щелочные аминокислоты, в особенности, аминокислоты, которые выбирают из аргинина, гистидина, лизина или цитрулина. Дополнительно, было обнаружено, что выгодно обеспечивать высушенную фармацевтическую композицию, не содержащую средство, стабилизирующее мембрану, т.е. в особенности, в отсутствие защитного сахара, спиртовой формы сахаров или гликозида. Дополнительно, в некоторых предпочтительных воплощениях изобретения, композиция также включает неорганический или органический анион, такой как сукцинат, фумарат, цитрат, малат, фосфат, ацетат или хлорид.

Высушенная фармацевтическая композиция предпочтительно представляет собой стерильную композицию.

Без заключения в липосомы, происходит быстрое выведение даже крупных белков из места введения, например, происходит выведение из синовиальной жидкости через синовиальную мембрану и, следовательно, они не доступны в достаточной мере для индукции регенерации поврежденных тканей, таких как хрящ или кость. Для того чтобы продлить локальное время удержания активного средства, такого как фактор роста, в месте нанесения, например, в диске или в его окружении и/или внутри суставного сочленения, авторы изобретения способны обеспечить липосомную композицию белка, например, крупные многослойные везикулы (MLV), включающие гидрофильный белок, такой как CD-RAP или BMP, с высокой степенью инкапсулирования и контролируемым выходом белка.

Авторы изобретения обеспечивают парентеральную фармацевтическую композицию, включающую композицию лиофилизированных липосом с белком, которые устойчивы к разрушению при долговременном хранении и которые могут быть восстановлены с образованием крупных многослойных липосом, включающих гидрофильный белок. Высушенные восстановленные везикулы, примененные в этом документе, представляют собой, например, сухие гранулированные изделия, которые при добавлении водной среды диспергируют с образованием композиции многослойных липосом, включающих биологический активный компонент. Преимущественно, при применении высушенных липосом в соответствии с изобретением избегают проблем со стабильностью, таких как агрегирование или окисление активного средства. К тому же, достигают высокой эффективности инкапсулирования гидрофильных ингредиентов, таких как белки, подобные регенерирующим средствам для костей и/или хряща, включая BMP и/или CD/RAP. В отличие от известного уровня техники, авторы изобретения теперь способны обеспечить стабильную фармацевтическую композицию с минимальным изменением активного средства, формирующую стабильную лиофилизированную лепешку, которая может быть легко и быстро восстановлена с помощью водной среды с воспроизводимым включением инкапсулирования активного средства, с усовершенствованной стабильностью при хранении и значительным увеличением в распределении по размерам многослойных липосом при регидратации.

Регидратированные липосомы изобретения обладают пролонгированной устойчивостью in situ после инъекции, например, в синовиальную жидкость, внутрисуставное пространство, в межпозвоночный диск или окружение межпозвонкового диска и, таким образом, преодолевают ограничения современного уровня техники в области лечения заболевания суставов. Белок обладает непосредственным действием из-за присутствия активного средства вне липосомы и замедляющим или повышающим устойчивость влиянием на деградацию липосом. Присутствие активного средства в течение длительного времени обеспечивает возможность длительного полезного влияния на клетки, такие как хрящеобразующие и синовиальные клетки, на образование протеогликанов, обеспечивая, таким образом, регенерирующее действие, или замедляет прогрессирование болезни с помощью активного средства. При введении конечной композиции настоящего изобретения в пораженный сустав (например, в костно-суставное сочленение) конечная композиция может обеспечивать защитное действие на структуры сустава, и противовоспалительное и/или регенерирующее действие, опосредуемое активным соединением, смазывающий эффект липосомы, эффект дополнительной вязкости и/или эффект замещения синовиальной жидкости.

Также в объем охраны настоящего изобретения входит способ получения высушенной липосомной композиции, которая после регидратации водным раствором образует многослойные липосомы со средним диаметром липосомы, равным более чем 1 мкм, инкапсулирующие активные соединения, включающий стадии а) гидратации липида, липидной смеси или липидной пленки в отсутствие органического растворителя, b) образования небольших однослойных везикул, предпочтительно, со средним диаметром от 50 до 200 нм, с) добавления водного раствора активного средства, d) добавления средства, способствующего слиянию, и, необязательно, неорганического или органического аниона после, перед или вместе со стадией с), и е) дегидратации указанной липидной дисперсии без добавления средства, стабилизирующего мембрану.

Небольшие однослойные везикулы, полученные на стадии b), предпочтительно имеют средний диаметр, равный, по меньшей мере, 50 нм, в особенности, равный, по меньшей мере, 60 нм и более предпочтительно равный, по меньшей мере, 70 нм, и имеют максимальный диаметр, равный предпочтительно 200 нм, в особенности, 150 нм, и более предпочтительно 120 нм.

Особое преимущество способа настоящего изобретения заключается в том, что после стадий b) и с) может быть проведено стерилизующее фильтрование. Таким образом, может быть обеспечена стерильная высушенная фармацевтическая композиция.

После получения на стадии а) и d) лекарственные формы можно хранить, например, при пониженном давлении при 4°С, предпочтительно при комнатной температуре.

В зависимости от размера липосом MLV и в зависимости от термочувствительности многих активных соединений, таких как белки, стерилизующее фильтрование или терминальная стерилизация такого известного фармацевтического препарата не осуществима. Эти трудности преодолевают с помощью способа асептического производства в соответствии с изобретением.

Следовательно, изобретение дополнительно обеспечивает способ получения пригодной для введения липосомной композиции, включающей многослойные липосомы со средним диаметром липосомы, равным более чем 1 мкм, инкапсулирующие активные соединения, включающий стадии а) гидратации липида, липидной смеси или липидной пленки в отсутствие органического растворителя, b) образования небольших однослойных везикул предпочтительно со средним диаметром от 50 и 200 нм, с) добавления водного раствора активного средства, d) после, перед или вместе со стадией с) добавления средства, способствующего слиянию, и необязательно неорганического или органического аниона, е) дегидратации указанной липидной дисперсии без добавления средства, стабилизирующего мембрану, f) регидратации водным раствором и образования многослойных везикул, имеющих средний диаметр липосомы, равный более чем 1 мкм, инкапсулирующих активное средство, в котором стадию стерилизующего фильтрования проводят после стадии b) и/или с).

В особенности, можно получить стерильную композицию, включающую липосомы MLV, применяя стерильный водный раствор на стадии f).

Также охвачено обеспечение набора, включающего высушенную фармацевтическую композицию, такую как описана в этом документе, и, в особенности, в п.1, и водный раствор для регидратации высушенной фармацевтической композиции.

Если желательна лиофилизация, то в известном уровне техники описаны лиопротекторы. Дисахариды, такие как сахароза, лактоза и трегалоза представляют собой наиболее предпочтительные лиопротекторы. Следует избегать моносахаридов, таких как глюкоза или сорбитол, или экспиентов с низкой молекулярной массой, таких как аминокислоты и неорганические соли, из-за низкой температуры их фазового перехода и температуры разрушения в замороженном состоянии (Liposomes 2^nd edition, A Practical Approach, edited by Vladimir P. Torchilin and Volkmar Weissig, Oxford University Press, page 157 (2002)). Однако авторы изобретения обнаружили, что применение щелочных аминокислот, например, аргинина в качестве наполнителей не защищает везикулы в процессе лиофилизации, но, удивительно, стимулирует процесс слияния, который важен для получения многослойных везикул с диаметром, равным 1 мкм и крупнее. В дополнение к этому эффекту, применение этих аминокислот удивительным образом способствует стабилизации белка, входящего в состав композиции, в процессе лиофилизации. Сочетание этих двух эффектов - с одной стороны, дестабилизация липидных мембран и, с другой стороны, стабилизация лекарственных средств - до настоящего времени было совершенно не известно.

В отличие от известного уровня техники липосомы, такие как MVL, описанные например, в работе Кима и соавт. (Kim, S. et al. (1983) Preparation of multivesicular liposomes. Biochim. Biophys. Acta 728: 339-348), преимущество липосом настоящего изобретения заключается в том, что исключены органические растворители, такие как хлороформ. Препараты липосом изобретения предпочтительно свободны от органических растворителей и, в особенности, содержат органический растворитель в количестве менее чем 2% (по масс.), предпочтительно менее чем 1% (по масс.), более предпочтительно менее чем 0,1% (по масс.) и наиболее предпочтительно 0%. Дополнительно, изобретение обеспечивает способ для создания крупномасштабного производства для получения высушенных восстановленных везикул, в котором при регидратации происходит формирование везикул MLV для фармацевтических приложений.

Преимущество способа изобретения заключается в том, что можно избежать дополнительных стадий очистки липосом, которые представляют собой описанные в известном уровне техники способы удаления материала, не захваченного в водную внутреннюю полость липосомы или между липосомными оболочками. То, что часть невключенного белка предпочтительно присоединена к поверхности липосом нековалентно, представляет собой серьезное преимущество, поскольку создается возможность для первоначального быстрого освобождения активного средства, например, свободного белка, при введении фармацевтической композиции субъекту, который в ней нуждается.

Высокая степень включения белка (например, CD-RAP) в везикулы MLV, при применении способа настоящего изобретения, по сравнению с низкой эффективностью инкапсулирования везикул MLV, произведенных с помощью способов известного уровня техники, представляет собой дополнительное преимущество способа настоящего изобретения. Кроме того, при применении способа настоящего изобретения происходит формирование многослойных липосом вместо крупных однослойных липосом, которые получают при применении способов известного уровня техники, таких как восстановление лиофилизированного липидного порошка с помощью раствора белка.

Термин «многослойные везикулы (везикулы MLV)» означает липосомы, содержащие множество липидных бислоев, формирующих две или несколько оболочек, в особенности двухфазные многослойные липидные везикулы. Двухфазные липидные везикулы включают множество расположенных на определенном расстоянии липидных бислоев, включающих компонент, формирующий липосому, и, необязательно, биологическое активное средство. Липидные везикулы включают периферические компартменты с водным раствором между липидными бислоями и компартмент центральной внутренней полости, включающие водный раствор, необязательно включающий активные соединения.

Термины «инкапсулирование, захват или окружение» применены в этом документе для описания расположения веществ, в особенности, гидрофильных веществ, в водной внутренней полости или между двумя соседними оболочками липосомы. Количество материала, включенного во внутреннее пространство липосомы, может быть определено с помощью способов, известных в известном уровне техники, таких как очистка с помощью центрифугирования, описанного в издании «Liposomes» 2^nd edition, A Practical Approach, edited by P. Torchilin and Volkmar Weissig, Oxford University Press (2002), диализа, описаного в издании «Liposomes», A Practical Approach edited by R. R. C. New, IRL Press (1990), или тех способов, которые будут описаны в разделе «Примеры» изобретения.

Под термином «без добавления средства, стабилизирующего мембрану» следует понимать, что не было добавлено никаких веществ или что никакие вещества не присутствовали в количестве, достаточном для ингибирования слияние липосомных фрагментов или везикул, например, достаточном для ингибирования образования многослойных везикул. Примеры средств, стабилизирующих мембраны, представляют собой защищающие сахара, сахарные спирты или гликозиды в концентрации, достаточной для осуществления защиты на внешней и/или внутренней поверхностях. При концентрации сахара, такого как трегалоза, равной 50 мМ, везикулы обычно имеют такой же размер как перед дегидратацией. При концентрации сахара, например, при концентрации трегалозы, равной 125 мМ или выше, практически отсутствует заметная структурная разница между везикулами до или после дегидратации. Однако небольшие количества такого средства, стабилизирующего мембрану, могут быть охвачены, если они не ингибируют слияние липосом при высушивании, например, при образовании везикул MLV. Средство, стабилизирующее мембраны, предпочтительно присутствует в композиции изобретения в количестве, равном <5% (масс./объем), предпочтительно <2.5% (масс./объем), более предпочтительно <1% (масс./объем), даже более предпочтительно <0,1% (масс./объем) и наиболее предпочтительно 0% (масс./объем).

Термины «активное средство, биологическое активное средство или биологическое активное соединение» означают любое средство, которое имеет терапевтический, биологический, фармакологический, фармацевтический (например, лечит, контролирует, улучшает, предупреждает, задерживает начало болезни, снижает риск развития одного или несколько заболеваний, нарушений или состояний или их симптомов) и/или косметический эффект. Терапевтический эффект может быть местным или системным и может быть объективным или субъективным. Предпочтительно активное средство представляет собой белок, в особенности, гидрофильный белок, более предпочтительно белок регенерации кости и/или хряща.

Термин «средство, стабилизирующее мембрану» означает средство, которое при добавлении в определенной концентрации или в определенном диапазоне концентраций, защищает липосомы от разрушения или утечки активного средства, инкапсулированного при высушивании. Оно может быть защищающим сахаром, сахарным спиртом или гликозидом, в особенности, моно- или дисахаридом или аминогликозидом. Защитные сахара и гликозиды включают экспиенты, такие как трегалоза, мальтоза, сахароза, глюкоза, лактоза, дектран, стрептомицин и дигидрострептомицин.

Термин «средство, способствующее слиянию» означает средство, которое стимулирует или делает возможным слияние липидных агрегатов в везикулы MLV. К тому же, средство, способствующее слиянию, предпочтительно означает эксипиент или компонент, который стабилизирует нативную структуру активного средства, например, белка. Дополнительно, средство, способствующее слиянию, предпочтительно, не защищает везикулы SUV при высушивании или от разрушения липидных бислоев везикул SUV, например, путем формирования кристаллов льда. Средство, способствующее слиянию, может быть аморфным или частично кристаллическим веществом или буферным веществом, которое приводит к фрагментации, разрыву или раскрытию липидных мембран, при применении такого способа дегидратации, как сублимационная сушка, делая возможным инкапсулирование активного средства в процессе формирования везикул MLV с помощью последующей регидратация. Такие вещества включают аминокислоты, в особенности, щелочные аминокислоты и, предпочтительно, аргинин, гистидин, цитрулин, лизин и соответствующие соли, такие как фосфат, сульфат или хлорид или их смеси. Предпочтительно, средство, способствующее слиянию, добавляют в количестве, достаточном для создания изотонических условий после регидратации высушенной липосомной композиции (высушенные восстановленные везикулы, DRV). К тому же, средство, способствующее слиянию, предпочтительно не имеет вредного воздействия (например, окисления) на активное средство, например, на белок, который намереваются инкапсулировать.

Термин «дегенеративное заболевание межпозвонкового диска (DDD)» представляет собой хронический процесс, который частично характеризуется прогрессирующей потерей протеогликана и снижением количества воды в студенистом ядре, что может начать проявляться во множестве заболеваний, таких как идиопатическая боль в нижнем отделе спины, выпячивание межпозвонкового диска, разрушение внутренних межпозвонковых дисков или растрескивание межпозвонковых дисков, радикулопатия, спинальный стеноз, воспаление седалищного нерва, индуцированное грыжей студенистого ядра, воспаление седалищного нерва, идиопатический сколиоз и/или миелопатия. Степень деформации межпозвонкового диска может быть оценена с помощью анализа результатов предоперационной MRI.

Для целей настоящего изобретения, термин «трансдискально» включает, но не ограничивается, инъекцией в межпозвонковый диск, в особенности, в студенистое ядро (NP) межпозвонкового диска, который включает интактный диск, дегенеративный диск на разных стадиях, грыжу межпозвонкового диска, разорвавшийся межпозвонковый диск, расслоившийся межпозвонковый диск или растрескавшийся межпозвонковый диск. Если объем, который намереваются ввести, может оказать давление на NP, то, по меньшей мере, часть NP может быть удалена перед инъекцией или нанесением имплантата для позвоночного столба. В некоторых случаях объем удаленного материала равен примерно объему, который намереваются внести, ±20%. Термин «трансдискально» также включает инъекцию в фиброзное кольцо (AF) дегенерирующего межпозвонкового диска, как описано выше для NP. В случаях, когда наносят материал-носитель более крупного размера, может понадобиться частичное или полное удаление диска перед нанесением фармацевтической композиции в соответствии с изобретением. Это дополнительно включает обеспечение имплантата в место, расположенное снаружи, но близко расположенное к стенке AF или к концевой пластинке примыкающего тела позвонка, так можно избежать прокола AF и, следовательно, потенциальной нагрузки на диск.

Термин «липид», так как он применен в этом документе, предназначен для обозначения любого вещества, которое может быть применено для получения липидных бислоев. Типичные липиды включают гликолипиды, лецитин, фосфолипиды, церамиды и их смеси.

Подходящие липиды, гидрогенизированные или нет, присутствующие индивидуально или в смесях, в соответствии с настоящим изобретением включают нейтральные или положительно заряженные липиды, такие как нейтральные лецитины или фосфолипиды. Примеры липидов представляют собой фосфатидилхолин (PC), яичный фосфатидилхолин (ЕРС), фосфатидилсерин (PS), холестерин (Chol), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), сфингомиелин (SM), диолеилфосфатидилхолин (DOPC), диолеилфосфатидилглицерин (DOPG), дилауроилфосфатидилхолин (DLPC), фосфатидилглицерин (PG), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), ганглиозиды, церамиды, фосфатидилинозитол (PI), фосфатные кислоты (РА), дицетилфосфат (DcP), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), ганглиозид и другие гликолипиды, стеариламин, дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), и другие синтетические или полусинтетические липиды. Фосфолипиды могут быть нейтральными липидами, полученными из яичных желтков, сои или от других животных или растений, таких как лецитин желтка, лецитин сои и им подобные. Липосомная композиция обычно представляет собой смесь, состоящую, по меньшей мере, из одного, более предпочтительно, по меньшей мере, из двух липидов, таких как холестерин и фосфатидилхолин, и более предпочтительно из трех или большего числа липидов.

В дополнительном предпочтительном воплощении липиды включают менее чем 20, 15, 10, 8, 5, 3, 1 весовых процентов (% по масс.) ненасыщенных липидов по отношению к общему содержанию липидов. Предпочтительно липиды представляют собой насыщенные нейтральные липиды.

Ненасыщенные и/или нейтральные липиды представляют собой предпочтительные липиды в соответствии с настоящим изобретением для увеличения стабильности образовавшихся липосом и для усовершенствования замедленного высвобождения для фармацевтического применения для целей изобретения, описанных в рамках описания изобретения. Ненасыщенные липиды имеют очень низкую температуру фазового перехода. Поскольку липиды будут в жидкокристаллической фазе в ходе всех фаз получения, то, например, обработка дисперсии или регидратация липосом проходит намного легче и быстрее. Если температура окружающей среды будет близка к температуре фазового перехода или совпадает с температурой фазового перехода липидов, то в результате произойдет значительная потеря включаемого соединения.

Предпочтительно, парентеральные фармацевтические композиции; описанные выше, включают два липида, предпочтительно два нейтральных липида, более предпочтительно фосфатидилхолин (PC) и холестерин (Chol). Предпочтительно, отношение массовых процентов двух липидов (например, PC:Chol), рассчитанное по отношению к общему содержанию липидов, может быть от примерно 2 до примерно 7, от примерно 2 до примерно 6, от примерно 2 до примерно 5, от примерно 3 до примерно 7, от примерно 3 до примерно 6, от примерно 3 до примерно 5, от примерно 2,7 до примерно 5,4, от примерно 2,8 до примерно 5,2, от примерно 2,8 до примерно 4,2, от примерно 2,8 до примерно 3,2 (например, 3,4 или 5).

Хотя описано, что нейтральные липиды часто приводят к образованию агрегатов везикул MLV, для везикул MLV настоящего изобретения никакого агрегирования не наблюдали.

Предпочтительно смесь липидов представляет собой смесь заряженных липидов. Примеры катионных липидов включают диоктадецилдиметиламмония хлорид (DOPAC), N-(2,3-диолеилокси)пропил-N,N,N-триметиламмония (DOTMA), дидодециламмония бромид (DDAB), 1,2-диолеоилокси-3-триметиламмония пропан (DOTAP), 3-N-(N',N',-диметиламиноэтан)-карбамол холестерин (DC-Chol), 1,2-димиристоилоксипропил-3-диметилгидроксиэтил аммония (DMRIE), 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанамин трифторацетат (DOSPA) и им подобные.