Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированная эмульсионная

Вакцина ассоциированная против ньюкаслской болезни птиц, инфекционного бронхита кур, синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита птиц инактивированная эмульсионная

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, касается ассоциированной вакцины инактивированной эмульсионной, которая может быть использована для специфической профилактики болезней птиц, индуцируемых вирусами ньюкаслской болезни (МБ) птиц, инфекционного бронхита кур (ИБК), синдрома снижения яйценоскости - 76 (ССЯ-76), инфекционной бурсальной болезни (ИББ) и реовирусного теносиновита (РВТ) птиц.

Мировая тенденция второй половины XX века в птицеводстве - это эпоха превращения домашних мелкотоварных хозяйств в крупномасштабное высокопродуктивное производство. Такая ситуация породила уникальные изменения биоэкологической ниши, окружающей выращиваемое поголовье и, в частности, привела к чрезвычайно спрессованной во времени трансформации спектра вирусных инфекций, повсеместно поражающих домашнюю птицу. За этот период появились вновь, антигенно обновились или существенно усилили вирулентность более десяти возбудителей, став причиной весьма опасных инфекционных болезней птиц. Среди хорошо известных, например, вирусов МБ или болезни Марека (БМ) особое место заняли возбудители ИБК, ИББ, ССЯ-76 и РВТ. Именно эти этиологические агенты, действуя порознь, или, как правило, в ассоциации наносят катастрофический с экономической точки зрения ущерб промышленному птицеводству. При этом ущерб становится более ощутимым, когда эти заболевания поражают племенное ядро или стада кур-несушек (1, 2).

Эффективность предупреждения указанных заболеваний во всем мире связывают главным образом с применением живых и инактивированных вакцин. При этом вакцинопрофилактика до последнего времени остается единственным фундаментально проработанным методическим приемом для эффективного противостояния инфекционным болезням при крупномасштабном выращивании птицы.

Однако каждый тип вакцин, используемых для специфической профилактики вышеуказанных заболеваний у птиц, имеет преимущества и недостатки. Преимущество живых вакцин состоит в технологичности и в возможности использования массовых методов применения при вакцинации. К недостаткам живых вакцин относятся формирование нестабильной иммунной реакции у птиц, развитие различного рода осложнений, таких как повышенная реактогенность, развитие иммуносупрессии, а иногда и гибели птиц при воздействии неблагоприятных условий содержания и наличия сопутствующих инфекций, а также возможны проблемы воспроизводства, длительная персистенция и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду.

В промышленном птицеводстве широкое применение нашли сорбированные на гидроокиси алюминия (ГОА) или масляные на основе эмульсии обратного типа инактивированные вакцины, обладающие существенными преимуществами по сравнению с живыми вакцинными препаратами. Прежде всего следует отметить их высокую безопасность и безвредность; возможность стандартизации дозированного введения специфического антигена, стабильность основных биологических свойств, возможность создания системного, напряженного и продолжительного иммунологического эффекта (3).

Известна вакцина против НБ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 8,0 lg ЭИД₅₀/см³ и титром гемагглютинирующей активности (ГА-активность) в экстраэмбриональной жидкости не ниже 1:256, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении (4, 5).

Известна вакцина против ИБК инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма 4/91 вируса ИБК, полученного в 9÷11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 5,0 lg ЭИД₅₀ /см³ и депонированного в ЕСАСС под № V93070612, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0
Масляный адъювант	до 100,0 (6÷8)

Известна вакцина против ССЯ-76 птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "БИСС №113" (авторское наименование) вируса ССЯ-76 птиц, полученного в 9÷11-суточных утиных эмбрионах (УЭ) или 9÷11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 6,0 lg ЭИД₅₀/0,2 см³ и ГА-активностью не ниже 1:4096, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0÷40,0
Масляный адъювант	до 100,0 (9, 10)

Известна вакцина против ИББ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигеный материал из штамма "БГ" (авторское наименование) вируса ИББ птиц, полученного в 9÷11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 4,5 lg ЭИД₅₀/0,2 см³, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0÷50,0
Масляный адъювант	до 100,0 (11, 12)

Известна вакцина против ИББ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "К-58" (авторское наименование) вируса ИББ птиц, полученного в 9÷11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 5,25 lg ЭИД₅₀/0,2 см³, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0÷50,0
Масляный адъювант	до 100,0 (13)

Известна вакцина против РВТ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая в качестве активного вещества авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "S 1133" реовируса птиц, полученного в культуре клеток фибробластов эмбрионов SPF-кур (ФЭК) с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,0 lg ТЦД₅₀/см³, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении (14÷17).

Применение моновалентных инактивированных вакцин в птицеводстве ограничено необходимостью одновременной вакцинации против нескольких инфекций в короткий промежуток времени (как правило, в пределах 80÷100-суточного возраста), коротким производственным сроком использования птицы, а также ограниченного мышечного пространства для одновременной инъекции нескольких препаратов. Кроме того, многократное повторение индивидуального способа вакцинации сказывается на затратах труда, растягивает сроки образования иммунитета у птиц, способствует возникновению стрессовых явлений и осложнений.

Указанные недостатки частично устранены разработкой и применением в птицеводстве ассоциированных инактивированных вакцин, имеющих в составе разнообразное количественное и качественное соотношение антигенов.

Известна вакцина ассоциированная против НБ птиц и ИБК инактивированная эмульсионная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц и из штамма "Н-52" вируса ИБК, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и масляный адъювант в эффективном соотношении (18).

Известна вакцина ассоциированная против ССЯ-76 птиц и ИБК инактивированная эмульсионная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц и из штамма "Н-52" вируса ИБК, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и масляный адъювант в эффективном соотношении (19).

Известна вакцина ассоциированная против ССЯ-76 птиц, ИБК и ИББ кур инактивированная эмульсионная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц, из штамма "Н-52" вируса ИБК и из штамма "БГ" вируса ИББ, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и масляный адъювант в эффективном соотношении (20).

Известна вакцина ассоциированная против ИБК, НБ, ИББ и ССЯ-76 птиц инактивированная эмульсионная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма "Чапаевский" вируса ИБК, из штамма "Ла Сота" вируса НБ, из штамма "Д-78" или из штамма "Винтерфилд 2512" вируса ИББ и из штамма "В 8/78" вируса ССЯ-76 птиц, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и масляный адъювант в эффективном соотношении (21).

Наиболее близкой к предложенному изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина ассоциированная против НБ птиц, ИБК, ИББ, ССЯ-76 и РВТ птиц инактивированная эмульсионная, содержащая смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «Ла Сота» вируса НБ птиц, из штамма "Чапаевский" вируса ИБК, из штамма «Д-78» или из штамма «Винтерфилд-2512» вируса ИББ, из штамма «В 8/78» вируса ССЯ-76 и из штамма "S 1133 " вируса РВТ, полученных культивированием в чувствительных биологических системах, и масляный адъювант в эффективном соотношении (2, 22. 23).

Общим существенным недостатком известных ассоциированных инактивированных вакцин, в том числе вакцины-прототипа, является их недостаточно высокая эффективность вследствие:

1) низкой концентрации специфических антигенных компонентов в прививном объеме и их сложных взаимодействий в составе вакцины,

2) несоответствия антигенного профиля используемых в составе вакцины специфических антигенов эпизоотической обстановке.

Кроме того, соавторы вакцины-прототипа рекомендовали для профилактики НБ птиц дополнительно применять живую вакцину, а для профилактики ИБК сначала живую, а затем инактивированную или одновременно применять обе.

Известно также, что при изготовлении ассоциированных инактивированных вакцин с валентностью выше трех происходит значительное взаимное разведение содержащихся в них антигенных компонентов. В результате снижается их концентрация в прививном объеме препарата. При этом возможность повышения концентрации вирусов при помощи культивирования ограничена. В связи с этим одним из наиболее важных технологических показателей является определение минимальной концентрации антигенов и их оптимального соотношения в прививном объеме вакцины, что обеспечивало бы формирование напряженного иммунитета у кур. Немаловажным в производстве эмульсионных вакцин является выбор адъюванта, который обеспечивал бы стабильность вакцинной эмульсии, индукцию и персистенцию высоких титров антител у привитых птиц при отсутствии побочных эффектов в местах своего введения, а также удобство применения вакцины в производственных условиях. Поэтому проблема получения высокоэффективной ассоциированной вакцины инактивированной эмульсионной против основных возбудителей вирусных заболеваний птиц продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований по созданию искомого препарата.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении вакцины ассоциированной инактивированной эмульсионной, создающей эффективную защиту восприимчивых птиц от заражения возбудителями НБ, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ. Основными показателями эффективности применения препарата являются защита племенных стад кур от НБ, ИБК и ССЯ-76, а также создание ранней защиты цыплят с помощью материнского иммунитета от ИББ и РВТ.

Технический результат от использования предложенного изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин инактивированных эмульсионных против возбудителей НБ птиц, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ птиц, циркулирующих на территории Российской Федерации. Технический результат достигнут благодаря определению минимальной концентрации каждого антигена в прививном объеме препарата, минимальной инфекционной активности вирусов, входящих в состав предлагаемой вакцины, до инактивации и оптимальному соотношению антигенных компонентов в вакцине, а

также благодаря нахождению эффективного, удобного в технологическом плане и безопасного адъюванта.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины ассоциированной против НБ птиц, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ птиц инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Согласно изобретению предлагаемая вакцина содержит в качестве активного вещества смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «Ла Сота» вируса НБ птиц, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 10,3 lg ЭИД₅₀/см³, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма «Н-52» вируса ИБК, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,2 lg ЭИД₅₀/см³, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "БИСС №113" вируса ССЯ-76, полученного в 11÷12-суточных ЭУ с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,5 lg ЭИД₅₀/см³, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "К-58" или из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 5,5 lg ЭИД₅₀/см³, и из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,5 lg ТЦД₅₀/см³, взятых в объемном соотношении 0,5:2,0:0,5:1,0:1,0 соответственно и в количествах, обеспечивающих протективную иммуногенную активность каждого антигена в организме птицы после введения ей целевого препарата.

В качестве целевой добавки предлагаемая вакцина содержит масляный адъювант марки Montanide ISA-70 VG производства "Seppic" (Франция, стандарт ИСО 9001).

В предлагаемой вакцине активное вещество и целевая добавка объединены в соотношении, мас.%: 30,0÷70,0 соответственно.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина ассоциированная против НБ птиц, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РВТ птиц инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество.

3. В качестве активного вещества смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, сем. Paramyxoridae, подсемейства Paramyxoridae, рода Avulavirus, серотипа 1, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Н-52" вируса ИБК, сем. Coronoviridae, рода Coronavirus, серотипа Массачусетс, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц, сем. Adenoviridae, рода Aviadenovirus, серотипа 3, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "БИСС №113-ДЕП", из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "К-58" или штамма "БГ" вируса ИББ птиц, сем. Birnaviridae, рода Avibimavirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "К-58 №122-ДЕП" или "БГ" №102 ДЕП соответственно, и из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц, сем. Reoviridae, рода Orthoreovirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "1133-ДЕП", взятых в объемном соотношении 0,5:2,0:0,5:1,0:1,0 соответственно и в количествах, обеспечивающих протективную иммунногенную активность каждого антигена в организме птиц после введения им целевого препарата.

4. Целевая добавка.

5. В качестве целевой добавки масляный адъювант.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина ассоциированная против НБ птиц, ИБК, ССЯ-76, ИББ и РТВ птиц инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество.

3. Целевая добавка.

По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, сем. Paramyxoviridae, подсем. Paramyxovirinae, рода Avulavirus, серотипа 1, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Н-52" вируса ИБК, сем. Coronoviridae, рода Coronavirus, серотипа Массачусетс, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц, сем. Adenoviridae, рода Aviadenovirus, серотипа 3, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "БИСС №113-ДЕП", из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "К-58" или штамма "БГ" вируса ИББ птиц, сем. Birnaviridae, рода Avibirnavirus. коллекция ФГУ "ВГНКИ" "К-58 №122-ДЕП" или "БГ" 102 ДЕП соответственно, и из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц, сем. Reoviridae рода Orthoreovirus, коллекция ФГУ "ВГНКИ" "1133-ДЕП", взятых в объемном соотношении 0,5:2,0:0,5:1,0:1,0 соответственно и в количествах, обеспечивающих иммуногенную активность каждого антигена в организме птицы после введения ей целевого препарата.

Предлагаемое изобретение характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 10,3 lg ЭИД₅₀/см³ в количестве, мас.%: 3,0÷6,0.

2. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма " Н-52" вируса ИБК, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью не ниже 7,2 lg ЭИД₅₀/см³, в количестве, мас.%: 6,0÷12,0.

3. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц, полученного в 11÷12-суточных УЭ с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,5 lg ЭИД₅₀/см³, в количестве, мас.%: 3,0÷6,0.

4. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "К-58" или из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, полученного в 9÷11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 5,5 lg ЭИД₅₀/см³, в количестве 6,0 мас.%.

5. Авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "1133" вируса РТВ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,5 lg ТЦД₅₀/см³, в количестве 6,0 мас.%.

6. Масляный адъювант в количестве не менее 70,0 мас.%.

7. Смесь из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 10,3 lg ЭИД₅₀/см³, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "Н-52" вируса ИБК, полученного 9÷12-суточных эмбрионах SPF- кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,2 lg ЭИД₅₀/см³, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц, полученного в 11÷12-суточных УЭ с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,5 lg ЭИД₅₀/см³, из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "К-58" или из штамма "БГ" вируса ИББ птиц, полученного в 9÷11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 5,5 lg ЭИД₅₀/см³, и из авирулентного очищенного антигенного материала из штамма "1133" вируса РВТ птиц, полученного в культуре клеток ФЭК с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,5 lg ТЦД₅₀/см³, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал из штамма "Ла Сота"
вируса НБ птиц	3,0÷6,0
Антигенный материал из штамма "Н-52"
вируса ИБК	6,0÷12,0
Антигенный материал из штамма "БИСС №113"
вируса ССЯ-76 птиц	3,0÷6,0
Антигенный материал из штамма "К-58"
или из штамма "БГ" вируса ИББ птиц	6,0
Антигенный материал из штамма "1133"
вируса РВТ птиц	6,0
Масляный адъювант	до 100,0

Входящие в предлагаемую вакцину штаммы вирусов известны и являются производственными при изготовлении моновакцин (1÷11).

В результате проведенных исследований авторы определили важнейшие технологические показатели, позволившие создать препарат, в котором отсутствует конкуренция между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, а его иммуногенные свойства были сравнимы с таковыми после применения монопрепаратов. Высокий иммунологический эффект в отношении специфических антигенов, входящих в состав вакцины, был достигнут двумя способами: изменением объемного соотношения антигенов, а также с помощью концентрирования методом ультрафильтрации.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения достигается за счет того, что для инактивации вирусосодержащих материалов используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины и повысить качество антигенных материалов.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого изобретения в части повышения антигенной и иммуногенной активности целевого продукта достигается также за счет использования в его составе масляного адъюванта Montanide ISA-70 VG производства фирмы " SEPPIC" (Франция, стандарт ИСО 9001).

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлено графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент НБ птиц предлагаемой вакцины;

фиг.2 - графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент ИБК предлагаемой вакцины;

фиг.3 - графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент ССЯ-76 птиц предлагаемой вакцины;

фиг.4 - графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент ИББ птиц предлагаемой вакцины;

фиг.5 - графическое изображение динамики образования поствакцинальных антител на антигенный компонент РВТ птиц предлагаемой вакцины.

Используемый для изготовления предлагаемой вакцины штамм "Ла Сота" вируса НБ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Вирус НБ птиц штамма "Ла Сота" относится к сем. Paramyxoviridae, подсем. Paramyxovirinae, роду Avulavirus, серотипу 1 и обладает одноцепочечным несегментированным РНК-геномом негативной полярности, состоящим более чем из 15000 нуклеотидов. Сферические, покрытые оболочкой, вирионы имеют диаметр 150 нм и более с характерными поверхностными выступами длиной 8 нм. Есть филаментозные формы диаметром 60÷100 нм и варьирующей длины до нескольких микрометров. Нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии, РНП 12÷17 нм, длину до 1 мкм и жестко упорядоченную структуру. Встречаются вирионы, содержащие несколько нуклеокапсидов.

Антигенные свойства

Антигенная структура стабильна: 5÷7 полипептидов с молекулярной массой 35÷200 килодальтон, один или более поверхностных антигенов; один нуклеокапсидный антиген. Реплицируются в цитоплазме. Обладают геммаглютинирующими свойствами. Некоторые члены семейства имеют нейраминидазу и РНК-зависимую РНК-полимеразу. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител. Титр гемагглютининов в экстраэмбриональной жидкости при культивировании в эмбрионах кур не ниже 1:256.

Биотехнологические характеристики

Вирус НБ проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность, культивируется в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур. Инфекционная активность в лиофилизованном виде не ниже 8,0 lg ЭИД₅₀/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "Ла Сота" вируса НБ птиц чувствителен к эфиру, инактивируется при рН 3,0. Лиофилизованный вирус хранится при температуре минус 2÷40°С в течение 12 месяцев.

Дополнительные признаки и свойства

Свободен от бактериальной и грибной контаминации. Сохраняет инфекционную активность при температуре минус 20÷40°С в течение 12 месяцев, а в лиофилизованном виде при титровании в эмбрионах или в трахеальной органной культуре эмбрионов кур не ниже 6,5 lg ЭИД₅₀/см³.

Для получения антигенного материала из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц в качестве чувствительной биологической системы культивирования используют преимущественно 9÷12-суточные эмбрионы SPF-кур. Полученный вирусосодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса НБ птиц используют АЭЭИ, который добавляют в очищенную вирусосодержащую суспензию до концентрации (%): 0,05÷0,1. Инактивацию вируса проводят при температуре (37±0,5)°С и рН в пределах 7,0÷7,6 в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную суспензию антигена добавляют 1 М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Полученный антиген подвергают контролю на антигенную активность, авирулентность, стерильность и рН.

Для изготовления предлагаемой вакцины используют авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "Ла Сота" вируса НБ птиц, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 9,0 lg ЭИД₅₀/см³ и ГА-активностью не ниже 1:512, в количестве, мас.%: 3,0-6,0.

Штамм " Н-52" вируса ИБК относится к сем. Coronaviridae, роду Coronavirus, серотипу Массачусетс, реизолирован в 1994 году из голландской коммерческой живой вакцины против ИБК и депонирован 28.12.1984 г.в коллекцию штаммов микроорганизмов ВНИИВИП.

Используемый для изготовления предлагаемой вакцины штамм "Н-52" вируса ИБК характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм "Н-52" вируса ИБК является РНК-содержащим вирусом. Вирус ИБК полиморфен, но в основном круглой формы. Вирионы состоят из нуклеокапсидоспиральной симметрии и липопротеидной оболочки, образующие подобие солнечной короны. Геном вируса представлен односпиральной молекулой РНК с молекулярной массой 6,5÷11 МД. Вирионная РНК обладает инфекционностью. Геном состоит из 27÷33 тыс. нуклеотидов. Гены структурных белков расположены в 3-концевой области гена. Вирионы вируса ИБК содержат три основных вирусоспецифических протеина: гликопротеин шипиков (S), гликопротеин мембраны (М) и протеин нуклеокапсида (N). Дополнительно четвертый протеин (малый мембранный протеин (SM)) ассоциирует с мембранной оболочкой. S-протеин состоит из двух или трех копий: каждая в свою очередь представлена двумя гликополипептидами S1 и S2. Антигемагглютирующие и вируснейтрализующие антитела индуцируются белком S1.

Антигенные свойства

Вирус ИБК в организме птиц индуцирует образование вирусоспецифических антител. Наиболее высокие титры антител обнаруживают различными серологическими методами через 28 дней после вакцинации.

Биотехнические характеристики

Штамм "Н-52" вируса ИБК репродуцируется в 10÷11-суточных эмбрионах SPF-кур. Инфекционная активность вируса составляет 7,0 lg ЭИД₅₀/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус ИБК слабо устойчив к физико-химическим воздействиям. Вирионы чувствительны к жирорастворителям, детергентам. Вирус ИБК погибает через 5 мин после нагревания до температуры 56°С и через 90 минут после нагревания до температуры 45°С. Вируссодержащий материал в виде аллантоисной жидкости остается активным в течение многих лет при хранении при температуре минус 30°С. На открытом воздухе вирус ИБК сохраняет жизнеспособность до 12 дней летом и до 56 дней зимой. Эпизоотические штаммы сравнительно более устойчивы к факторам внешней среды, чем вакцинные. Способность некоторых штаммов выживать при низких рН в присутствии пищеварительных ферментов и желчных солей может обуславливать их энтеротропность. Вирус ИБК чувствителен к эфиру, хлороформу, деоксихолату натрия и общепринятым дезинфектантам. Чувствительность к растворителям липидов является характерным признаком при дифференциации полевых изолятов вируса ИБК от некоторых других вирусов, вызывающих болезни птиц - аденовирусов, реовирусов. Антибиотики и сульфаниламиды не оказывают губительного действия на вирус.

Дополнительные признаки и свойства

Обладает антигенной активностью в составе инактивированной вакцины.

Для получения антигенного материала из штамма "Н-52" вируса ИБК в качестве чувствительной биологической системы культивирования используют преимущественно 9÷12-суточные эмбрионы SPF-кур. Полученный вирусосодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным способом.

Для инактивации вируса ИБК используют АЭЭИ, который добавляют в очищенную вирусосодержащую суспензию до концентрации (%): 0,3÷0,5. Инактивацию вируса проводят при температуре (25±0,5)°С и рН в пределах 7,4÷7,6 в течение 36 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную суспензию антигена добавляют 1 М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ. Полученный антиген подвергают контролю на антигенную активность, авирулентность, стерильность и рН.

Для изготовления предлагаемой вакцины используют авирулентный очищенный антигенный материал из штамма "Н-52" вируса ИБК, полученного в 9÷12-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью до инактивации не ниже 7,5 lg ЭИД₅₀/см³, в количестве, мас.%: 6,0÷12,0.

В случае если инфекционный титр вируса ИБК не удовлетворяет технологическим требованиям (7,55 lg ЭИД₅₀/см³), инактивированный антиген вируса можно сконцентрировать с помощью проточной ультрафильтрации. Для этого можно использовать установку для ультрафильтрации "Сартокон-мини".

Исходный вирус (авторское наименование изолята "БИСС №113") для получения штамма "БИСС №113" выделен из органов репродуктивной системы курицы с признаками острой формы ССЯ-76 в 1999 г. в Ульяновской области. Производственный штамм "БИСС №113" вируса ССЯ-76 получен путем проведения

4-х последовательных пассажей на развивающихся УЭ.

Полученный штамм депонирован 5 октября 2000 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения "Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ "ВГНКИ") под регистрационным наименованием "БИСС №113-ДЕП".

Используемый для изготовления предлагаемой вакцины штамм "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц характеризуется следующими признаками исвойствами. Морфологические признаки

Штамм "БИСС №113" вируса ССЯ-76 относится к семейству Adenoviridae, роду Aviadenovirus, к 3 серологической группе. При электронно-микроскопическом исследовании штамм "БИСС №113" представлен вирионами экосаэдрической формы, которые лишены суперкапсидной оболочки и не содержат липидов. Диаметр нуклеокапсида 70÷8 нм. Вирус ССЯ-76 птиц имеет 13 структурных полипептидов, 7 из которых соответствуют полипептидам аденовируса птиц типа 1.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм "БИСС №113" относится к 3 серологической группе птичьих аденовирусов. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в перекрестной реакции торможения гемагглютинации (РТГА) со специфическими сыворотками штаммов "В 8/78", ВГНКИ №98 "Б-93 " и "БИСС №113" вируса ССЯ-76 и с гетерологичными сыворотками к парамиксовирусу - 1 (ПМВ-1), вызывающему болезнь Ньюкасла, и ортомиксовирусам 5÷7 серотипов. Штамм "БИСС №113" был идентифицирован как вирус, аналогичный эталонному " В 8/78" и известному отечественному ВГНКИ №98 "Б 93" штаммам вируса ССЯ-76, и отнесен к аденовирусам птиц 3 серологической группы.

Через 14÷21 сутки после заражения 120-суточных кур вирусом штамма "БИСС №113" отмечают появление вируснейтрализующих (ВН-) и гемагглютинирующих (ГА-) антител. ГА-титр штамма достигает 18,0÷21,0 лог₂. Пробы экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) после расплодки штамма на УЭ исследовали в реакции гемагглютинации (РГА). Исследуемые пробы ЭЭЖ имели ГА-активность в разведении 1:32768÷1:262144.

Биотехнологические характеристики

Штамм "БИСС №113" хорошо размножается в 9÷11-суточных УЭ, зараженных в аллантоистную полость. Инфекционная активность штамма через 120 часов при температуре (37±0,5)°С достигает значения 6,75÷0,31 lg ЭИД₅₀/0,2 см³. Штамм хорошо размножается также в гусиных эмбрионах и культуре клеток утиных фибробластов, вызывая цитопатогенное действие (ЦПД). В то же время вирус ССЯ-76 вообще не культивируется в куриных эмбрионах. Штамм является генетически стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей.

Гемагглютинирующие свойства

Штамм "БИСС №113" обладает выраженными ГА-свойствами. Агглютинирует эритроциты кур и уток, вызывая образование среднезернистой РГА с предельным титром 21,0 лог₂.

Инфекционные свойства

Вирус ССЯ-76 штамма "БИСС №113" контагиозен для кур, уток и гусей при интраназальном, оральном и внутримышечном заражении. Начиная с 14 суток после введения вируса 120-суточным цыплятам, отмечают появление депигментированных лишенных скорлупы яиц. В течение 4 недель процент яиц с мягкой скорлупой и безскорлупных составляет около 30% и более.

Вирус не вызывает клинических признаков болезни при экспериментальном и естественном заражениях. Патологоанатомические изменения не выражены и определяются только гистологически по изменениям в репродуктивных органах.

Генотаксономическая характеристика

Сердцевина вириона содержит двухцепочечную молекулу ДНК и два внутренних белка. Масса нуклеиновой кислоты достигает 17,3% массы вириона.

Основная масса белков вируса ССЯ-76 птиц сосредоточена в капсидной оболочке вириона. На долю сердцевинных белков приходится до 20% всех протеинов вируса. Сердцевинный белок "1" с молекулярной массой 46×10³ г/моль легко отделяется от внутреннего нуклеотида, содержащего ДНК в комплексе с богатым аргинином сердцевинным белком "2".

Гексон, основание пептона и его нить (фибер) вируса ССЯ-76 штамма "БИСС №113" построены из полипептидов с молекулярными массами 120×10³, 70×10³ и 62×10³ г/моль соответственно.

Белковые структуры вируса ССЯ-76 штамма "БИСС №113" формируют несколько антигенов. В составе структурного вирусного антигена у них обнаружены типоспецифические, группоспецифические и подгруппоспецифические антигены. В составе структурного вирусного антигена выявлено три основных компонента, обозначенных А, В и С. Антиген А структурно тесно связан с гексоном, антиген Б - с пептоном, антиген С - с нитями вириона (фибера). Связанный с гексоном компонент А содержит группоспецифический антиген (а) и типоспецифический антиген (Е). Антигенный фактор, связанный с пептоном, назван антигеном β, а с нитью вириона (фибер) - антигеном "у".

С помощью ПЦР и секвенирования амплифицированных участков генома установлено, что аллантоистная жидкость от УЭ, зараженных вирусом ССЯ-76 штамма "БИСС №113", содержала геном вируса ССЯ-76.

Нуклеотидная последовательность амплифицированного консервативного фрагмента гена гексона штамма "БИСС №113" имела полную гомологию с референсными штаммами вируса ССЯ-76.

Физические свойства

Масса вириона составляет 252×10³ г/моль. Плавучая плотность 1,32÷1,35 г/см³ в градиенте CsCl. Константа седиментации зрелого вириона составляет 8^-10×10^-13÷9^-10×10^-13 c.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус ССЯ-76 штамма "БИСС №113" стабилен при рН пределах 6,0÷9,0. Устойчив к жирорастворителям. Инактивируется при 56°С.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - 100%.

Патогенность выражена.

Вирулентность выражена.

Контагиозность выражена.

Онкогенность отсутствует.

Свободен от контаминации бактериальной и грибковой флоры, микоплазмами и ГА-вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма "БИСС №113" вируса ССЯ-76 птиц в качестве чувствительной биологической системы культивирования используют 9÷11-суточные УЭ. Полученный вирусосодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса ССЯ-76 птиц исследуют АЭЭИ, который добавляют в очищенную вирусосодержащую суспензию до концентрации (%): 0,2÷0,3. Инактивацию вируса проводят при температуре (37±0,5)°С и рН 7,4÷7,6 в течение 48 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную сус