2444572 - Синтетаза жирных кислот, кодирующий ее полинуклеотид и их применение

Синтетаза жирных кислот, кодирующий ее полинуклеотид и их применение

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области биохимии. Описана синтетаза жирных кислот с последовательностью, приведенной в описании. Определена последовательность полинуклеотида, кодирующая указанную синтетазу. Представлен вектор, содержащий указанный полинуклеотид. Кроме того, описан трансформированный микробный организм, содержащий указанный вектор или полинуклеотид. Трансформированный микробный организм используется для продуцирования жирных кислот. Предложен способ получения липида или жирной кислоты, включающий культивирование клеток трансформанта с последующим выделением липида или жирной кислоты из указанных клеток. Описан способ оценки способности образования жирных кислот, основанный на измерении уровня экспрессии гена синтетазы жирных кислот, имеющего нуклеотидную последовательность указанного полинуклеотида. Также представлен способ селекции микробных липидпродуцирующих организмов, в основе которого лежит сравнение уровней экспрессии указанного гена в контрольном и тестируемом микробном организме. Изобретение позволяет получить жирные кислоты с высоким выходом продукта. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к гену, который кодирует синтетазу жирных кислот, и его использованию.

Уровень техники

Гены синтетаз жирных кислот, которые отвечают за синтез новых жирных кислот, у большинства организмов клонированы и тщательно изучены (например, непатентный документ 1: E. Schweizer et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 68, 501-517 (2004)).

Известно, что у некоторых бактерий, грибов и животных так называемые многофункциональные ферменты “I типа”, такие как представленные ниже, катализируют серии реакций синтеза жирных кислот.

Тип Ia: (Грибы) AC-ER-DH-MPT/ACP-KR-KR-KS-PPT, α₆β₆ (β+α: приблизительно 3950 аминокислот). (Бактерии) AC-ER-DH-MPT-ACP-KR-KS-PPT, α₆, структура, в которой субъединицы β и α синтетазы жирной кислоты (FAS) соединены «голова к хвосту» (α: приблизительно 3000 аминокислот).

Тип Ib: (Животные) KS-AT-DH-ER-KR-ACP-TE, α₂ (α: приблизительно 2500 аминокислот). Вышеуказанные аббревиатуры означают следующее:

AC: ац(ет)илтрансфераза

AT: малонил/ацетилтрансфераза

MPT: малонил/палмитоилтрансфераза

KS: кетоацилсинтаза

KR: кетоацилредуктаза

DH: дегидратаза

ER: еноилредуктаза

ACP: белок-переносчик ацильной группы

TE: тиоэстераза

PPT: палмитоил/палмитоилтрансфераза.

У дрожжей Saccharomyces cerevisiae (также сокращенных ниже, как “S. cerevisiae”), синтез новых жирных кислот выполняет синтетаза жирных кислот (α6β6-комплекс, состоящий из β- субъединиц, кодируемых геном FAS1, и α-субъединиц, кодируемых геном FAS2) до 18 атомов углерода (стеариновая кислота). Кроме того, ELO1, ELO2 и ELO3 известны как гены элонгазы жирных кислот. Предполагают, что ELO1 отвечает за увеличение длины от C12-C16 цепей до C16-C18, ELO2 отвечает за увеличение длины C16-C18 цепей до C22 и ELO3 отвечает за увеличение длины C18-C24 цепей до C26.

В то же время тот факт, что в вырабатывающем липиды грибе Mortierella alpina (ниже также сокращенного, как “M. alpina”) мутантная цепь, обладающая сниженной активностью удлинения жирных кислот от пальмитиновой кислоты до стеариновой кислоты, может быть получена посредством обработки мутагенами (патентный документ 1: Патентная заявка Японии, опубликованная под номером 2001-245687), заставляет предположить, что, по меньшей мере, различные ферменты отвечают за синтез вплоть до пальмитиновой кислоты и за синтез от пальмитиновой кислоты до стеариновой кислоты.

Однако у гриба, вырабатывающего липиды, такого как M. Alpina, гены синтетаз жирных кислот, которые отвечают за синтез новых жирных кислот, ранее не были клонированы.

Описание изобретения

В свете вышесказанного существует необходимость в идентификации ферментов, синтезирующих жирные кислоты, которые отвечают за синтез новых жирных кислот в грибах, продуцирующих жирные кислоты, таких как M. Alpine, и генов, которые кодируют данные ферменты.

Авторы провели обширные исследования, в результате которых они успешно клонировали ген синтетазы жирных кислот, отвечающий за синтез новых жирных кислот, в липидпродуцирующем грибе M. Alpine, и что, в конечном итоге, привело к настоящему изобретению. Таким образом, изобретение относится к следующим полинуклеотидам, белкам, экспрессирующим векторам, трансформантам, способам получения продуктов питания и других продуктов, с применением подобных трансформантов, продуктов питания и других продуктов, полученных данными способами, и способов оценки и селекции тестируемых липидпродуцирующих грибов.

(1) Полинуклеотид, выбранный из любого из следующих от (a) до (h):

(a) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности с положениями от 1 до 12486 SEQ ID NO:1;

(b) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 или ее части;

(d) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий белок, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, в которой одна или несколько аминокислот делетированы, замещены, встроены и/или добавлены и которая обладает активностью синтетазы жирных кислот;

(e) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий идентичностью 60% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, которая обладает активностью синтетазы жирных кислот;

(f) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, который гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности с положениями от 1 до 12486 SEQ ID NO:1, и который кодирует белок, обладающий активностью синтетазы жирных кислот;

(g) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, который гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 или ее части, и который кодирует белок, обладающий активностью синтетазы жирных кислот; и

(h) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, который гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности полинуклеотида, кодирующего белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и который кодирует белок, обладающий активностью синтетазы жирных кислот.

(2) Полинуклеотид по вышеуказанному (1), который выбран из любого из следующих от (i) до (m):

(i) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий белок, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, в которой от одной до десяти аминокислот делетированы, замещены, встроены и/или добавлены, и который обладает активностью синтетазы жирных кислот;

(j) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий идентичностью 90% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и который обладает активностью синтетазы жирных кислот;

(k) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, который гибридизуется при условиях высокой строгости с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности с положениями от 1 до 12486 SEQ ID NO:1, и который кодирует белок, обладающий активностью синтетазы жирных кислот;

(l) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, который гибридизуется при условиях высокой строгости с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 или ее части, и который кодирует белок, обладающий активностью синтетазы жирных кислот; и

(m) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, который гибридизуется при условиях высокой строгости с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности полинуклеотида, кодирующего белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, и который кодирует белок, обладающий активностью синтетазы жирных кислот.

(3) Полинуклеотид по вышеуказанному (1), включающий полинуклеотид, который состоит из нуклеотидной последовательности с положениями от 1 до 12486 SEQ ID NO:1.

(4) Полинуклеотид по вышеуказанному (1), включающий полинуклеотид, который состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1.

(5) Полинуклеотид по вышеуказанному (1), включающий полинуклеотид, который состоит из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2.

(6) Полинуклеотид по вышеуказанному (1), включающий полинуклеотид, который кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3.

(7) Полинуклеотид по любому из вышеуказанного (1)-(6), который представляет собой ДНК.

(8) Белок, кодируемый полинуклеотидом по любому из вышеуказанного (1)-(7).

(8a) Белок, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

(8b) Белок, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, в которой одна или несколько аминокислот делетированы, замещены, встроены и/или добавлены, и который обладает активностью синтетазы жирных кислот.

(8c) Белок, обладающий идентичностью 60% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и обладающий активностью синтетазы жирных кислот.

(9) Вектор, включающий полинуклеотид по любому из вышеуказанных (1)-(7).

(9a) Вектор по вышеуказанному (9), который включает экспрессирующую кассету, включающую следующие компоненты от (a) до (c):

(a) промотор, который можно транскрибировать в клетке-хозяине;

(b) полинуклеотид по любому из вышеуказанных (1)-(7), который соединен с промотором; и

(9b) Вектор по вышеуказанному (9), где клетка-хозяин является липидпродуцирующим грибом (например, M. alpina) или дрожжами (например, S. cerevisiae).

(10) Трансформированный организм, имеющий внедренный в него полинуклеотид, по любому из вышеуказанных (1)-(7).

(11) Трансформированный организм, имеющий внедренный в него вектор по вышеуказанному (9).

(12) Трансформированный организм по вышеуказанному (11), обладающий увеличенной способностью образования жирных кислот благодаря внедрению вектора по вышеуказанному (9).

(13) Трансформированный организм по любому из вышеуказанных (10)-(12), где организм является грибом, продуцирующим жирные кислоты.

(14) Трансформированный организм по вышеуказанному (13), где грибом, продуцирующим жирные кислоты, является Mortierella alpina.

(15) Способ получения липидов или жирных кислот с использованием трансформированного организма по любому из вышеуказанных (10)-(14).

(16) Способ получения пищевого продукта, лекарственного средства или промышленного материала с использованием трансформированного организма по любому из вышеуказанных (10)-(14).

(16a) Способ получения по вышеуказанному (16), где пищевой продукт является пищей, содержащей масла и жиры.

(17) Пищевой продукт, лекарственное средство или промышленный материал, полученный вышеуказанным способом (16).

(17a) Вышеуказанные пищевой продукт или промышленный материал (17), где пищевой продукт является пищевым продуктом, содержащим масла и жиры.

(18) Способ оценки способности образования жирных кислот тестируемыми липидпродуцирующими грибами, который включает использование праймера или зонда, сконструированных на основе нуклеотидной последовательности гена синтетазы жирных кислот, имеющего нуклеотидную последовательность с положениями от 1 до 12486 SEQ ID NO:1.

(18a) Способ селекции липидпродуцирующих грибов, обладающих увеличенной способностью образования жирных кислот, посредством вышеуказанного способа (18).

(18b) Способ получения масла и жира с использованием липид-продуцирующих грибов, отобранных вышеуказанным способом (18a).

(19) Способ оценки способности образования жирных кислот тестируемыми липидпродуцирующими грибами, включающий культивирование тестируемых липидпродуцирующих грибов и измерение уровня экспрессии гена синтетазы жирных кислот, имеющего нуклеотидную последовательность с положениями от 1 до 12486 SEQ ID NO:1.

(19a) Способ селекции липидпродуцирующих грибов, обладающих увеличенной способностью образования 16-углеродных жирных кислот, включающий оценивание тестируемых липидпродуцирующих грибов посредством вышеуказанного способа (19), и отбор липидпродуцирующих грибов, имеющих высокий уровень экспрессии гена синтетазы жирных кислот.

(19b) Способ получения масла и жира, включающий использование липидпродуцирующих грибов, отобранных вышеуказанным способом (19a).

(20) Способ селекции липидпродуцирующих грибов, включающий: культивирование контрольных липидпродуцирующих грибов и тестируемых липидпродуцирующих грибов, измерение уровня экспрессии гена синтетазы жирных кислот, имеющего нуклеотидную последовательность с положениями от 1 до 12486 SEQ ID NO:1 в каждом липидпродуцирующем грибе, и отбор тестируемых липидпродуцирующих грибов, которые экспрессируют ген в более высокой степени, чем контрольные липидпродуцирующие грибы.

(21) Способ селекции липидпродуцирующих грибов, включающий: культивирование контрольных липидпродуцирующих грибов и тестируемых липидпродуцирующих грибов, количественное определение вышеуказанного белка (8) в каждом липидпродуцирующем грибе, и выбор тестируемого липидпродуцирующего гриба, содержащего более высокое количество белка, чем контрольные липидпродуцирующие грибы. То есть способ селекции липидпродуцирующих грибов, включающий стадии культивирования множества липидпродуцирующих грибов, количественное определение вышеуказанного белка (8) в каждом липидпродуцирующем грибе, и выбор среди них тестируемого липидпродуцирующего гриба, содержащего большое количество белка.

Полинуклеотиды по изобретению, которые используют для трансформирования организмов, таких как липидпродуцирующие грибы (например, M. alpina) и дрожжи, пригодны для использования в производстве пищевых продуктов, косметики, лекарственных средств (например, препаратов наружного кожного применения), мыла и т.п.

Жирные кислоты можно эффективно получать посредством способа получения липидов или жирных кислот по изобретению. Кроме того, посредством применения нуклеотидов по изобретению для трансформирования дрожжей и других организмов можно получать липиды или жирные кислоты, имеющие высокое содержание 16-углеродных жирных кислот (например, пальмитиновая кислота, пальмитолеиновая кислота). Таким образом, настоящее изобретение является целесообразным для увеличения способности продуцирования подобных жирных кислот.

Посредством применения липидпродуцирующих грибов, которые были протестированы и отобраны с применением способов оценки и селекции липидпродуцирующих грибов по изобретению, можно эффективно производить масла и липиды необходимого состава (например, масла и липиды, имеющие высокое содержание 16-углеродных жирных кислот).

Краткое описание чертежей

На фиг.1 (от 1-1 до 1-5) представлен ряд аминокислотных последовательностей для известных белков FAS1 (от Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans и Aspergillus nidulans).

Лучший вариант выполнения изобретения

Как детально показано в описанных ниже примерах по изобретению, авторы впервые успешно клонировали полноразмерную кДНК синтетазы жирных кислот штамма 1S-4 M. alpina, который является липидпродуцирующим грибом. Кроме того, они получили основную последовательность геномной ДНК синтетазы жирных кислот штамма 1S-4 M. alpina (SEQ ID NO:2) и предполагаемую аминокислотную последовательность для данной синтетазы жирных кислот (SEQ ID NO:3). Данные ДНК и фермент могут быть получены с применением, например, технологий, указанных в нижеописанных примерах по изобретению, известных технологий генной инженерии и известных технологий синтеза. Полинуклеотиды синтетазы жирных кислот, представленные в настоящем изобретении, при использовании для трансформации организмов, таких как липидпродуцирующие грибы или дрожжи, целесообразны для производства масел и липидов с такими трансформированными липидпродуцирующими грибами (например, M. alpina) или дрожжами и для производства пищевых продуктов, лекарственных средств (например, препаратов наружного кожного применения), промышленных материалов (таких материалов, как для косметики, мыла) и т.п., для которых используют данные масла и липиды.

1. Полинуклеотиды по изобретению

Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к следующим полинуклеотидам:

(a) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности с положениями от 1 до 12486 из SEQ ID NO:1;

(d) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий белок, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, в которой одна или несколько аминокислот делетированы, замещены, встроены и/или добавлены и который обладает активностью синтетазы жирных кислот;

(e) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий идентичностью 60% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и обладающий активностью синтетазы жирных кислот;

Как используют в настоящем документе, термин “полинуклеотид” относится к ДНК или РНК.

Как используют в настоящем документе, “часть ДНК, состоящая из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2”, включает, например, часть нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2, относящейся к экзону.

“Полинуклеотид, который гибридизуется при строгих условиях” относится в настоящем документе к полинуклеотиду, который получен, например, посредством гибридизации колоний, гибридизации бляшек или гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда весь полинуклеотид или часть, состоящий из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности с позициями от 1 до 12486 SEQ ID NO:1 и нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2,

или полинуклеотид, состоящий из нуклеотидной последовательности, кодирующий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3. Применяемый способ гибридизации может быть способом, описанным, например, в Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol.3 (Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001) или в Ausubel: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987-1997).

Как используют в настоящем документе, “строгие условия” могут относиться к условиям низкой строгости, условиям средней строгости и условиям высокой строгости. “Условия низкой строгости” включают, например, 5× SSC, 5× раствор Денхарда, 0,5% SDS и 50% формамид при 32°C. “Условия средней строгости” включают, например, 5× SSC, 5× раствор Денхарда, 0,5% SDS и 50% формамид при 42°C. “Условия высокой строгости” включают, например, 5× SSC, 5× раствор Денхарда, 0,5% SDS и 50% формамид при 50°C. Предполагают, что в данных условиях ДНК, имеющую высокую гомологию, получают более эффективно при более высокой температуре. К строгим условиям гибридизации относятся множество факторов, включая температуру, концентрацию пробы, длину пробы, ионную силу, время и концентрацию солей, и специалисты в данной области могут, соответствующим образом, выбрать данные факторы для реализации соответствующих строгих условий.

Примером коммерческого набора, который можно использовать для гибридизации, является набор AlkPhos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia Biotech). В соответствии с протоколом, который входит в комплект набора, после инкубации с меченым зондом в течение ночи мембрану промывают первым отмывочным буфером, содержащим 0,1% (м/о) SDS, при 55°C, вслед за чем гибридизационную ДНК можно детектировать.

Другие полинуклеотиды, которые можно гибридизировать, включают ДНК, имеющую идентичность приблизительно 60% или выше, приблизительно 70% или выше, 71% или выше, 72% или выше, 73% или выше, 74% или выше, 75% или выше, 76% или выше, 77% или выше, 78% или выше, 79% или выше, 80% или выше, 81% или выше, 82% или выше, 83% или выше, 84% или выше, 85% или выше, 86% или выше, 87% или выше, 88% или выше, 89% или выше, 90% или выше, 91% или выше, 92% или выше, 93% или выше, 94% или выше, 95% или выше, 96% или выше, 97% или выше, 98% или выше, 99% или выше, 99,1% или выше, 99,2% или выше, 99,3% или выше, 99,4% или выше, 99,5% или выше, 99,6% или выше, 99,7% или выше, 99,8% или выше или 99,9% или выше с ДНК SEQ ID NO:1 (или нуклеотидной последовательностью с положениями от 1 до 12486 из SEQ ID NO:1), ДНК SEQ ID NO:2 или ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, что определяют посредством программного обеспечения поиска гомологии, такого как FASTA или BLAST, используя заданные по умолчанию параметры.

Идентичность между аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями можно определять, используя алгоритм BLAST от Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 872264-2268 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873 (1993)). Разработаны программы, названные BLASTN и BLASTX, основанные на алгоритме BLAST (Altschul SF, et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)). Если нуклеотидную последовательность анализируют, применяя BLASTN, устанавливают параметры, например, балл = 100 и длина слова = 12. Если нуклеотидную последовательность анализируют, применяя BLASTX, устанавливают параметры, например, балл = 50 и длина слова = 3. Если применяют программы BLAST и Gapped BLAST, используют параметры, заданные по умолчанию для соответствующей программы.

Вышеуказанные полинуклеотиды по изобретению можно получать посредством известных технологий генной инженерии или известных технологий синтеза.

2. Белки по изобретению и полинуклеотиды, которые кодируют данные белки

В другом аспекте изобретение относится к белкам, которых кодируют вышеуказанные полинуклеотиды от (a) до (h).

В еще одном аспекте изобретение относится к:

(a) белку, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3;

(b) белку, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, в которой одна или несколько аминокислоты аминокислот делетированы, замещены, встроены и/или добавлены, и который обладает активностью синтетазы жирных кислот.

(с) белку, имеющему идентичность 60% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и который обладает активностью синтетазы жирных кислот.

В еще одном другом аспекте изобретение относится к полинуклеотиду, который включает нуклеотидную последовательность, кодирующую вышеуказанный белок.

Вышеуказанный белок (b) или (c) является, как правило, вариантом природного белка с последовательностью SEQ ID NO:3 и может быть получен искусственно с использованием технологии сайтспецифического мутагенеза, описанной, например, в Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol.3 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); Ausubel, Current Protocols in Molecular biology (John Wiley & Sons, 1987-1997); Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985); или Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985).

В подробном обозначении “белок, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, в которой одна или несколько аминокислот делетированы, замещены, встроены и/или добавлены, и который обладает активностью синтетазы жирных кислот”, представлен белками, которые состоят из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 500, от 1 до 100, от 1 до 90, от 1 до 80, 1 до 70, от 1 до 60, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 39, от 1 до 38, от 1 до 37, от 1 до 36, от 1 до 35, от 1 до 34, от 1 до 33, от 1 до 32, от 1 до 31, от 1 до 30, от 1 до 29, от 1 до 28, от 1 до 27, от 1 до 26, от 1 до 25, от 1 до 24, от 1 до 23, от 1 до 22, от 1 до 21, от 1 до 20, от 1 до 19, от 1 до 18, от 1 до 17, от 1 до 16, от 1 до 15, от 1 до 14, от 1 до 13, от 1 до 12, от 1 до 11, от 1 до 10, от 1 до 9, от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6 (от 1 до нескольких), от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, 1 или 2, или 1 аминокислотный остаток в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3 делетирован, замещен, встроен и/или добавлен и который обладает активностью синтетазы жирных кислот. Меньшее количество вышеуказанных делетированных, замещенных, встроенных и/или добавленных аминокислотных остатков, как правило, более предпочтительно. Данные белки представлены белками, имеющими аминокислотную последовательность приблизительно с 60% или выше, приблизительно 70% или выше, 71% или выше, 72% или выше, 73% или выше, 74% или выше, 75% или выше, 76% или выше, 77% или выше, 78% или выше, 79% или выше, 80% или выше, 81% или выше, 82% или выше, 83% или выше, 84% или выше, 85% или выше, 86% или выше, 87% или выше, 88% или выше, 89% или выше, 90% или выше, 91% или выше, 92% или выше, 93% или выше, 94% или выше, 95% или выше, 96% или выше, 97% или выше, 98% или выше, 99% или выше, 99,1% или выше, 99,2% или выше, 99,3% или выше, 99,4% или выше, 99,5% или выше, 99,6% или выше, 99,7% или выше, 99,8% или выше или 99,9% или выше идентичностью аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и обладающими активностью синтетазы жирных кислот. Более высокая процентная идентичность, как правило, более предпочтительна. Активность синтетаз жирных кислот можно измерять, например, с помощью способа, описанного в James K Stoops et al., J.B.C. 253, 4464-4475 (1978).

Делеция, замена, инсерция и/или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков в аминокислотную последовательность белка по изобретению означает, что один или несколько аминокислотных остатков делетирован, замещен, встроен и/или добавлен в любое одно или несколько положений в той же последовательности. Любые два или более типов изменений среди делеций, замен, инсерций и/или добавлений могут происходить параллельно.

Примеры взаимозаменяемых аминокислотных остатков даны ниже. Взаимозаменяемыми являются аминокислотные остатки, относящиеся к одной группе.

Группа A: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норвалин, аланин, 2-аминомасляная кислота, метионин, o-метилсерин, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, циклогексилаланин;

Группа B: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, изоаспарагиновая кислота, изоглутаминовая кислота, 2-аминоадипиновая кислота, 2-аминооктандиовая кислота;

Группа C: аспарагин, глутамин;

Группа D: лизин, аргинин, орнитин, 2,4-диаминомасляная кислота, 2,3-диаминопропионовая кислота;

Группа E: пролин, 3-гидроксипролин, 4-гидроксипролин;

Группа F: серин, треонин, гомосерин; и

Группа G: фенилаланин, тирозин.

Белок по изобретению также можно получать посредством способа химического синтеза, такого как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонильный способ) или tBoc способ (трет-бутилоксикарбонильный способ). Кроме того, для химического синтеза можно использовать синтезатор пептидов, доступный, например, от Advanced ChemTech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive и Shimadzu Corporation.

3. Вектор по изобретению и трансформанты, в которые вводили вектор

В дополнительном аспекте изобретение относится к экспрессирующему вектору, который включает полинуклеотид по изобретению. Экспрессирующий вектор по изобретению включает один из следующих полинуклеотидов:

(d) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий белок, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, в которой одна или несколько аминокислот делетированы, замещены, встроены и/или добавлены, и который обладает активностью синтетазы жирных кислот;

(e) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий идентичностью 60% или более с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, и который обладает активностью синтетазы жирных кислот;

(g) полинуклеотид, включающий полинуклеотид, который гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 или его части, и который кодирует белок, обладающий активностью синтетазы жирных кислот; или

Вектор по изобретению, как правило, включает экспрессирующую кассету, включающую в качестве компонентов следующее: (i) промотор, который может транскрибироваться в клетке-хозяине; (ii) полинуклеотид, любой из вышеописанных от (a) до (h), который соединен с промотором; и (iii) сигнал, функционирующий внутри клетки-хозяина в связи с терминацией транскрипции и полиаденилированием молекулы РНК. Вектор, сконструированный таким образом, вводят в клетку-хозяина. Клетки-хозяева, пригодные для использования, в изобретении представлены липидпродуцирующими грибами и дрожжами.

Штаммы грибов, упомянутые, например, в Mycotaxon, Vol.XLIV, № 2, pp.257-265 (1992), можно использовать в качестве липидпродуцирующих грибов. Наглядные примеры включают микроорганизмы, относящиеся к виду Mortierella, такие как следующие микроорганизмы, относящиеся к подвиду Mortierella: Mortierella elongata IFO8570, Mortierella exigua IFO8571, Mortierella hygrophila IFO5941, и Mortierella alpina IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219,35, CBS224,37, CBS250,53, CBS343,66, CBS527,72, CBS528,72, CBS529,72, CBS608,70 и CBS754,68; и следующие микроорганизмы, относящиеся к подвиду Micromucor: Mortierella isabellina CBS194,28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308 и IFO7884, Mortierella nana IFO8190, Mortierella ramanniana IFO5426, IFO8186, CBS112,08, CBS212,72, IFO7825, IFO8184, IFO8185 и IFO8287, и Mortierella vinacea CBS236,82. Особенно предпочтительным является Mortierella alpina.

Наглядные примеры дрожжей включают Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953 и NBRC1954. Данные клетки-хозяева, которые трансформированы вектором по изобретению, способны очень эффективно вырабатывать, в частности, жирные кислоты, имеющие 16 атомов углерода.

Вектор, используемый для введения в липидпродуцирующие грибы, представлен, но не в качестве ограничивающего примера, pDura5 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004)).

Вектор, используемый для введения в дрожжи, может быть вектор с множеством копий (YEp вектор), вектор с одной копией (YCp вектор) или вектор с интеграцией в хромосому (YIp вектор). Примером известного YEp вектора является YEp24 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression (Academic Press, New York; 1983), 83), примером YCp вектора является YCp50 (M. D. Rose et al., Gene 60: 237 (1987)), и примером YIp вектора является YIp5 (K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1035 (1979)). Все из перечисленных являются легко доступными.

Для регуляции генной экспрессии в клетке-хозяине можно использовать любую комбинацию промоторов и терминаторов при условии, что они функционируют в клетке-хозяине. Например, при использовании липидпродуцирующих грибов можно использовать промотор гена гистона H4.1 или промотор гена глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы.

Примеры селективных маркеров, которые можно использовать во время трансформации, включают ауксотрофные маркеры (ura5, niaD), маркеры резистентности к лекарственным средствам (гигромицин, зеоцин), генетицинрезистентные гены (G418r), медь-резистентные гены (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 (1984)), и церуленинрезистентные гены (fas2m, PDR4) (соответственно Junji Inokoshi et al., Biochemistry, 64, 660 (1992) и Hussain et al., Gene, 101: 149 (1991)).

Для трансформации клетки-хозяина можно использовать общеизвестный способ. В случае липидпродуцирующих грибов примеры пригодных способов включают электропорацию (Mackenzie D.A., et al., Appl. Environ. Microbiol. 66, 4655-4661 (2000)) и способ бомбардировки частицами (способ описан в опубликованной патентной заявке Японии, № 2005-287403, под названием “Способ селекции липидпродуцирующих грибов”). В случае дрожжей наглядные, неограничивающие примеры пригодных способов включают электропорацию, сферопластный способ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978)), способ с ацетатом лития (J. Bacteriology, 153: 163 (1983)) и способы, описанные в Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978) и в Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual.

Более конкретно, в случае липидпродуцирующих грибов среду Чапека-Докса засевают клетками-хозяевами и культивируют в течение 2 недель при 28°C для формирования спор. Споры затем собирают и вводят в них ген посредством способа бомбардировки частицами (описанном в опубликованной патентной заявке Японии, № 2005-287403, под названием “Способ селекции липидпродуцирующих грибов”) или ему подобного способа. Следующим этапом споры, включающие внедренный ген, помещают в стандартную среду с агаром, содержащую антибиотик или что-либо подобное для использования в качестве селективного маркера, или, если используют ауксотрофный маркер, в среде с агаром отсутствует питательный субстрат, используемый в качестве маркера, для того чтобы получить трансформант. Альтернативно, в случае дрожжей, клетки-хозяева культивируют в стандартной питательной среде (например, среда YEPD, описанная в Genetic Engineering, Vo1.1 (Plenum Press, New York; 1979), p.117), так чтобы оптическая плотность среды при 600 нм (OD600) находилась между 1 и 6. Культивируемые клетки затем собирают центрифугированием, отмывают и подвергают предобработке ионами щелочных металлов, предпочтительно ионами лития в концентрации приблизительно от 1 до 2 M. Клетки оставляют приблизительно при 30°C в течение приблизительно 60 минут, затем клетки оставляют вместе с ДНК для внедрения (приблизительно от 1 до 20 мкг) приблизительно при 30°C в течение приблизительно 60 минут. Полиэтиленгликоль, предпочтительно полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу приблизительно 4000 дальтон, добавляют до конечной концентрации приблизительно от 20% до 50%. Клетки оставляют в состоянии покоя приблизительно при 30°C в течение приблизительно 30 минут, затем нагревают приблизительно при 42°C в течение приблизительно 5 минут. Предпочтительно, конечную клеточную суспензию отмывают стандартной питательной средой, добавляют предварительно установленное количество свежей стандартной питательной среды и оставляют приблизительно при 30°C в течение приблизительно 60 минут. Полученную в результате культуру засевают на стандартную среду с агаром, содержащую антибиотик или что-либо подобное для использования в качестве селективного маркера, или, если используют ауксотрофный маркер, в среде с агаром отсутствует питательный субстрат, используемый в качестве маркера, для того чтобы получить трансформант. Другие общеизвестные технологии клонирования можно найти, например, в Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol.3 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) и Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY).

4. Способ получения липидов или жирных кислот по изобретению

В еще одном дополнительном аспекте изобретение относится к способу получения липидов или жирных кислот с использованием вышеописанных трансформированных липидпродуцирующих грибов или дрожжей.

Как используют в настоящем документе, “липид” относится к простым липидам, содержащим, например, соединение, состоящее из жирной кислоты и спирта, соединенных эфирной связью (например, глицерид) или его аналогам (например, эфир холестерина), сложным липидам, дополнительно содержащим, например, фосфорную кислоту, аминокислоту или сахар, связанный с частью простого липида, и липидным производным, которые являются продуктами гидролиза липидов и не растворимы в воде.

“Масла и жиры” относятся в настоящем документе к эфирам глицерина и жирным кислотам (глицеридам).

“Жирные кислоты” относятся в настоящем документе к алифатическим монокарбоновым кислотам (карбоновые кислоты, имеющие единственную карбоксильную группу, в которой атомы углерода связаны друг с другом в виде цепи) с общей формулой RCOOH (R является алкильной группой). Жирные кислоты включают насыщенные жирные кислоты, не имеющие двойных связей в углеводородной цепи, и ненасыщенные жирные кислоты, которые содержат двойные связи.

Липид или жирную кислоту по изобретению можно выделить из клеток, трансформированных по настоящему изобретению, следующим способом. В случае трансформированного организма (например, липидпродуцирующих грибов или дрожжей) после завершения культивирования культивируемые клетки собирают общепринятым способом, таким как центрифугирование или фильтрация. Клетки тщательно промывают и предпочтительно высушивают. Высушивание можно выполнять посредством лиофилизации, высушиванием на воздухе или им подобн

Синтетаза жирных кислот, кодирующий ее полинуклеотид и их применение

Патент 2444572