Связывающее вещество патологического прионного белка и способ обнаружения патологического прионного белка

Связывающее вещество патологического прионного белка и способ обнаружения патологического прионного белка

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

[0001] Настоящее изобретение относится к связывающему веществу патогенной (патологической) изоформы прионного белка и к способу обнаружения патогенной (патологической) изоформы прионного белка.

Предшествующий уровень развития данной области

[0002] Так называемые «прионные заболевания» являются серьезной социальной проблемой. Примеры прионных заболеваний включают трансмиссивные губчатые заболевания головного мозга (энцефалопатии, ТГЭ), такие как скрейпи, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (БГЭ) и болезнь Крейцфельда-Якоба (БКЯ).

[0003] На основании различных данных стало ясно, что такие прионные заболевания вызываются инфекционными прионными белками (патогенная изоформа прионного белка) (PrP^Sc).

[0004] Для предотвращения распространения прионных заболеваний у людей и животных и для того, чтобы обеспечить безопасность лекарственных средств и пищи, предпринимались различные попытки обнаружить в образцах инфекционный прионный белок (патогенная изоформа прионного белка).

[0005] Однако в человеческом организме и организмах животных уже содержится неинфекционный прионный белок (нормальный прионный белок) (PrP^c), который не вызывает прионные заболевания. Удивительно, что обычный прионный белок имеет такую же аминокислотную последовательность (первичную структуру), что и патогенная изоформа прионного белка, и единственное различие между нормальной и патогенной изоформами прионных белков, имеющих одинаковую последовательность аминокислот, заключается в их более высокой структуре.

[0006] Обычно в случае обнаружения двух типов белков отдельно друг от друга можно использовать специфическое антитело, с помощью которого можно провести различие между данными двумя типами белка. Однако специфическое антитело, которое может отличить патогенную форму прионного белка от нормального патогенного белка, пока еще получено не было, вероятно, вследствие идентичности их последовательности аминокислот, как описано выше. То есть все еще нет возможности практического применения способа обнаружения инфекционного прионного белка (патогенной изоформы прионного белка), содержащегося в образце, с использованием специфического антитела.

[0007] Ввиду указанного способ обнаружения патогенной изоформы прионного белка ограничен, главным образом, следующими двумя типами способов.

[0008] Первый способ представляет способ, в котором образец, в котором, как предполагается, содержится патогенная изоформа прионного белка (инфекционный прионный белок), вводят в мозг тест-животных и тест-животных содержат в течение продолжительного периода времени для контроля нейропатологических изменений в образцах мозга, взятых у них.

[0009] Этот способ является надежным, но, к сожалению, является времязатратным и дорогостоящим. Соответственно такой способ используют только для калибровки других различных способов обнаружения, и он не стал общепринятым стандартным способом.

[0010] Другой способ представляет собой способ, в котором используется протеаза К. Известно, что нормальный прионный белок легко деградирует (т.е. является чувствительным) под действием протеазы К, но, с другой стороны, патогенная изоформа прионного белка трудно деградирует под действием (т.е. является устойчивой) протеазы К, возможно, из-за своей структуры более высокого порядка. Таким образом, патогенная изоформа прионного белка может быть обнаружена при использовании различия между нормальной и патогенной изоформами прионных белков в отношении чувствительности (устойчивости) к деградации протеазой К. Например, образец обрабатывают и не обрабатывают протеазой К, а затем анализируют с помощью, например, иммуноблоттинга с использованием поликлонального антитела. В том случае, если полосы белка обнаруживаются с помощью иммуноблоттинга в образце, не обработанном протеазой К, делают вывод, что полосы белка представляют собой патогенную изоформу прионного белка. С другой стороны, в том случае, когда полосы белка, обнаруживаемые с помощью иммуноблоттинга в образце, не обработанном протеазой К, исчезают (т.е. не обнаруживаются) при иммуноблоттинге образца, обработанного протеазой К, то делают вывод о том, что полосы белка относятся к нормальному прионному белку.

[0011] Этот способ с использованием протеазы К широко распространен в настоящее время, и были предложены его многочисленные варианты (см., например, патентные документы 1-3).

[0012] Однако при таком способе необходима ферментативная обработка и соответственно требуется время для проведения ферментативной реакции, и он осложнен тем, что необходимо создать условия, подходящие для ферментативной реакции. Таким образом, в принципе, этот способ имеет недостатки, связанные с недостаточной быстротой и простотой определения и с необходимостью применения в качестве реагента относительно дорогого фермента.

Патентный документ 1: выложенная патентная заявка Японии №10-267928

Патентный документ 2: выложенная патентная заявка Японии №11-32795

Патентный документ 3: выложенная патентная заявка Японии №2003-121448

Описание изобретения

Задачи, решаемые настоящим изобретением

[0013] Ввиду вышеизложенного существует необходимость в способе обнаружения патогенной изоформы прионного белка независимо от нормального прионного белка, который был бы быстрым, простым и количественным, с высокой чувствительностью без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К.

[0014] Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в создании способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка независимо от нормального прионного белка, который был бы быстрым, простым и количественным, с высокой чувствительностью без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К, и создании средства для обнаружения, которое могло бы использоваться в данном способе.

[0015] Кроме того, также имеется необходимость в реагенте (связующем веществе), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка и который мог бы использоваться в таком способе обнаружения.

[0016] Таким образом, другая задача настоящего изобретения заключается в создании реагента (связывающего вещества), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка.

Способы решения проблемы

[0017] Для достижения вышеуказанных задач авторы настоящего изобретения проводили интенсивное исследование способа специфического обнаружения патогенной изоформы прионного белка и в результате установили, что лактоферрин, который представляет собой белок, полученный из молока млекопитающих, не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. Данное открытие привело к осуществлению настоящего изобретения.

[0018] Таким образом, лактоферрин является долгожданным реагентом (т.е. связующим агентом, связывающим агентом, осуществляющим связывание агентом), который не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. Использование лактоферрина делает возможным обнаружить патогенную изоформу прионного белка независимо от нормального прионного белка без предварительной ферментативной обработки с использованием протеазы К.

[0019] Кроме того, использование свойства лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка делает возможным не только специфически обнаруживать патогенную изоформу прионного белка, но также проводить специфическое разделение (включая выделение, очистку и концентрирование) патогенной изоформы прионного белка, специфическую иммобилизацию патогенной изоформы прионного белка и специфическое ингибирование самосборки патогенной изоформы прионного белка, тем самым обеспечивая возможность новому применению, которое не возможно с помощью обычного способа, включающего ферментативную обработку протеазой К. То есть связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка по настоящему изобретению обладает таким полезным действием.

[0020] Таким образом, настоящее изобретение относится к:

(1) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка (связывающий агент), включающему лактоферрин.

(2) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка (связывающий агент), имеющему фрагмент, связывающий патогенную изоформу прионного белка, состоящий из лактоферрина.

[0021] Кроме того, лактоферрин может быть иммобилизован на связующем веществе (т.е. носителе, субстрате, материале носителя, материале основы). При использовании такого связывающего материала с иммобилизованным лактоферрином возможно особенно эффективно проводить отделение патогенной изоформы прионного белка от нормального прионного белка (включая выделение, очистку и концентрирование патогенной изоформы прионного белка) с получением только патогенной изоформы патогенного белка, связывания и иммобилизации патогенной изоформы прионного белка с лактоферрином и обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

[0022] Таким образом, настоящее изобретение также относится к:

(3) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (1) и (2), где лактоферрин иммобилизуют на связывающем материале (носителе).

(4) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (1) и (2), где лактоферрин иммобилизуют в качестве фрагмента, связывающего патогенную изоформу прионного белка, на связывающем материале (носителе).

(5) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанными пунктами (3) и (4), где связывающий материал представляет собой бусы.

(6) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с вышеуказанным пунктом (5), где бусы представляют собой намагничиваемые бусы.

[0023] Такое связывающее вещество патогенной формы прионного белка можно использовать для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к:

(7) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

(8) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка, имеющий связывающий агент патогенной изоформы прионного белка, состоящий из лактоферрина.

(9) Связывающему веществу патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из вышеуказанных пунктов (1)-(6), которое представляет собой агент для обнаружения патогенной изоформы прионного белка, имеющий связывающий агент патогенной изоформы прионного белка, состоящий из лактоферрина и меченого фрагмента.

[0024] Настоящее изобретение также относится к способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, способу связывания патогенной изоформы прионного белка, способу выделения патогенной изоформы прионного белка (включая способ очистки патогенной изоформы прионного белка, способ отделения патогенной изоформы прионного белка и способ концентрирования патогенной изоформы прионного белка), способу иммобилизации патогенной изоформы прионного белка, или способу ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка, каждый из которых включает использование связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка или агента обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

[0025] Соответственно, настоящее изобретение также относится к:

(10) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему следующие стадии:

стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из пунктов (3)-(6);

стадию отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и

стадию обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.

(11) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (10), где на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащейся в компоненте, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, обнаружение патогенной изоформы прионного белка осуществляют с использованием иммуноанализа.

(12) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (11), где иммуноанализ представляет собой метод вестерн-блоттинга, метод ELISA (метод твердофазного иммуноферментного анализа) или метод иммуноосаждения.

(13) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему следующие стадии:

стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка в соответствии с любым из пунктов (3)-(6);

стадию отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом.

(14) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(13), где связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка, полученное иммобилизацией лактоферрина на связывающем материале, представляет собой бусы с иммобилизованным лактоферрином.

(15) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(13), где связывающее вещество патогенной изоформы прионного белка представляет собой бусы с иммобилизованным лактоферрином, с использованием намагничиваемых бус.

(16) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(15), где образец представляет собой жидкий образец, полученный гомогенизацией смеси животной ткани и поверхностно-активного вещества.

(17) Способу в соответствии с вышеуказанным пунктом (16), где животная ткань представляет собой одну или несколько из тканей мозга млекопитающего, спинного мозга, глаза и тонкого кишечника.

(18) Способу в соответствии с любым из пунктов (10)-(17), где стадию отделения связанного компонента проводят путем элюирования раствором, содержащим лактоферрин.

[0026] Кроме того, настоящее изобретение также относится к:

(19) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему стадии:

стадию связывания лактоферрина с патогенной изоформой прионного белка; и

обнаружение лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.

(20) Способу обнаружения патогенной изоформы прионного белка, включающему стадии:

стадию связывания лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, с патогенной изоформой прионного белка; и

обнаружение меченого фрагмента лактоферрина, связанного с патогенной изоформой прионного белка.

(21) Способу ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка за счет связывания лактоферрина с патогенной изоформой прионного белка.

(22) Ингибитору для ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка, включающему лактоферрин.

[0027] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для связывания патогенной изоформы прионного белка.

[0028] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для обнаружения патогенной изоформы прионного белка.

[0029] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для выделения патогенной изоформы прионного белка.

[0030] Настоящее изобретение также относится к применению лактоферрина, лактоферрина, имеющего меченый фрагмент, или лактоферрина, иммобилизованного на связывающем материале, для ингибирования самосборки патогенной изоформы прионного белка.

Результаты изобретения

[0031] Как описано выше, в настоящем изобретении впервые описано, что лактоферрин не связывается с нормальным прионным белком, но специфически связывается с патогенной изоформой прионного белка. В соответствии с настоящим изобретением, основанным на этом обнаружении, можно просто, быстро и количественно обнаруживать патогенную изоформу прионного белка независимо от нормального прионного белка с высокой чувствительностью без осуществления ферментативной обработки с использованием протеазы К.

[0032] То есть согласно настоящему изобретению можно отличить патогенную изоформу прионного белка от нормального прионного белка, не проводя ферментативной обработки с использованием протеазы К. Это исключает необходимость проведения сложных операций для создания условий, подходящих для ферментативной реакции, и времени, требуемого для проведения ферментативной реакции. В результате, в принципе, способ по настоящему изобретению не имеет недостатков, связанных с ферментативной обработкой с использованием протеазы К, таких как низкая скорость, плохая воспроизводимость и необходимость использования относительно дорогого фермента в качестве реагента.

[0033] Следовательно, согласно настоящему изобретению можно анализировать пищу, напитки и лекарства, в которых используются полученные от животных исходные вещества, на загрязнение патогенной изоформой прионного белка (инфекционный прионный белок) более просто, быстро и количественно с высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Кроме того, также можно диагностировать прионные заболевания людей и животных более просто, быстро и количественно с высокой чувствительностью при более низкой стоимости, чем когда-либо ранее. Это отвечает потребности общества в профилактике инфекции и ранней диагностике прионных заболеваний у людей или животных.

[0034] Кроме того, согласно настоящему изобретению можно собирать патогенную изоформу прионного белка отдельно от нормального прионного белка. Это дает возможность выделения, отделения, концентрирования и очистки патогенной изоформы прионного белка. Соответственно, при комбинировании вышеуказанных аспектов настоящего изобретения можно более эффективно проводить вышеуказанное инспектирование на предмет загрязнения патогенной изоформой прионного белка (инфекционный прионный белок) и диагностику прионных заболеваний у людей и животных.

Краткое описание рисунков

[0035] Фиг.1 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, демонстрирующую, что патогенная изоформа прионного белка специфически связывается с бусами с иммобилизованным лактоферрином.

Фиг.2 представляет собой фотографию, показывающую результаты иммуноблоттинга, демонстрирующую, что обычный способ обнаружения, включающий ферментативную обработку протеазой К, может отличать патогенную изоформу прионного белка от нормального прионного белка.

Лучший способ осуществления изобретения

[0036] Далее будут подробно описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничено следующими предпочтительными вариантами и могут быть сделаны любые изменения в рамках объема настоящего изобретения. Следует отметить, что в данном описании «процент (%)» относится к «проценту (%) по массе», если не указано другого.

[0037] Предпочтительный вариант осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка по настоящему изобретению включает стадии:

контактирование образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, полученным иммобилизацией лактоферрина на связующем веществе; отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом; и обнаружение патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.

[0038] В соответствии с данным способом обнаружения патогенная изоформа прионного белка, содержащаяся в образце, может быть собрана при предоставлении патогенной изоформе прионного белка возможности специфически связываться (адсорбироваться) с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, а затем отделения патогенной изоформы прионного белка, связанного с лактоферрином, иммобилизованным в связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, и соответственно может быть обнаружена по отдельности от нормального прионного белка путем обнаружения патогенной изоформы прионного белка, отделенной от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка.

[0039] На стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, обнаружение патогенной изоформы прионного белка предпочтительно осуществляют с помощью иммуноанализа.

[0040] Предпочтительные примеры такого иммуноанализа включают метод вестерн-блоттинга, метод ELISA и метод иммуноосаждения.

[0041] Способ, используемый при обнаружении патогенной изоформы прионного белка на стадии обнаружения патогенной изоформы прионного белка, содержащегося в компоненте, отделенном от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, включая указанный выше иммуноанализ, не ограничен конкретно до тех пор, пока с его помощью может быть обнаружена патогенная изоформа прионного белка, и, соответственно, способ, с помощью которого нельзя различить патогенную изоформу прионного белка и нормальный прионный белок, конечно, можно использовать. Это возможно, поскольку в соответствии с настоящим изобретением специфичность патогенной изоформы прионного белка гарантирована ранее при предоставлении возможности патогенной изоформе прионного белка связываться с лактоферрином перед стадией обнаружения патогенной изоформы прионного белка. Следовательно, в вышеуказанном иммуноанализе можно, конечно, использовать антитело, которое не способно отличать патогенную изоформу прионного белка и нормальный прионный белок.

[0042] Лактоферрин (далее иногда сокращаемый как «ЛФ») представляет собой связанный с железом гликопротеин с молекулярной массой примерно 80 кДа, главным образом присутствующий в молоке молочной железы, и он известен как молочный белок, обладающий различной активностью, такой как антибактериальная активность в отношении вредных бактерий, таких как Escherichia coli, Candida, Clostridium и Staphylococcus, иммуномодулирующая активность и противоопухолевая активность. Как описано выше, лактоферрин представляет собой гликопротеин на основе молока и, следовательно, является высокобезопасным и его можно непрерывно принимать в течение длительного промежутка времени. Кроме того, лактоферрин сам по себе практически не имеет вкуса и запаха и соответственно широко используется в качестве добавки для различных пищевых продуктов, лекарственных средств и кормов животных. Однако способность лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка ранее известна не была.

[0043] Лактоферрин для использования в настоящем изобретении может быть коммерчески доступным или может быть получен путем выделения из исходного вещества, такого как молозиво, молоко (промежуточное молоко, зрелое молоко или молоко при поздней лактации) млекопитающих (например, человек, корова, коза, овца и лошадь), или продукта, полученного при переработке такого молока, такого как снятое молоко или сыворотка, посредством обычной обработки, такой как ионообменная хроматография. В частности, предпочтительно используют коммерчески доступный лактоферрин, получаемый в промышленном масштабе (например, лактоферрин, производимый Morinaga Milk Industry Co., Ltd.). Альтернативно, также можно использовать лактоферрины, продуцируемые с использованием микроорганизмов, животных клеток, трансгенных животных или тому подобного с помощью методов генной инженерии. В качестве исходного вещества для лактоферрина, используемого в настоящем изобретении, особенно предпочтительной является сыворотка, полученная из коровьего молока, поскольку ее можно стабильно получать в больших количествах в качестве побочного продукта производства молочных продуктов.

[0044] Далее будет описан один пример способа получения лактоферрина (выделение лактоферрина из исходного вещества, такого как молоко, и его очистка). Первоначально ионообменник (например, СМ-сефароза FF, получаемая от Amersham Pharmacia) упаковывают в колонку. Через колонку пропускают соляную кислоту и колонку промывают водой для уравновешивания ионообменника. Затем снятое молоко, имеющее рН 6,9 и охлажденное до 4°С, пропускают через колонку, выделяют эффлюент с колонки и эффлюент снова пропускают через колонку таким же образом. Затем через колонку пропускают дистиллированную воду, а после этого раствор соли пропускают через колонку для получения элюата, содержащего основной белок, адсорбированный на ионообменнике. Затем к элюату добавляют 80%-ный насыщенный раствор сульфата аммония для осаждения белка и после этого элюат центрифугируют для получения осадка. Полученный осадок промывают 80%-ным насыщенным раствором сульфата аммония и затем к промытому осадку добавляют деионизированную воду для получения раствора. Затем раствор обессоливают с использованием ультрафильтрационного мембранного модуля (например, SLP0053 производства Asahi kasi Corporation) и после этого подвергают лиофильной сушке для получения порошкообразного коровьего лактоферрина. Таким образом можно получать коровий лактоферрин с чистотой 95% по массе или выше. Следует отметить, что в данном описании чистота лактоферрина представляет собой показатель, измеренный методом жидкостной хроматографии.

[0045] Как и многие белки, лактоферрин также обычно содержит мутацию, такую как замещение, делеция, вставка, дополнение или инверсия одного или нескольких оснований в одном или нескольких положениях, вследствие разницы в видах или генах или различия между индивидами, и аминокислоты белка, кодируемого геном, имеющим такую мутацию, также могут содержать мутацию. В настоящем изобретении лактоферрин, содержащий такую мутацию, также можно использовать до тех пор, пока не нарушается его способность специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка.

[0046] Иммобилизацию лактоферрина на связывающем материале для получения связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка можно проводить с помощью обычно используемого способа иммобилизации до тех пор, пока не ухудшается способность лактоферрина специфически связываться с патогенной изоформой прионного белка. Примеры такого способа иммобилизации включают способ, в котором ковалентная связь непосредственно образуется с первичной аминогруппой полипептида, и способ, в котором ковалентная связь непосредственно образуется с сульфгидрильной группой (тиольной группой) полипептида.

[0047] Связывающий материал (т.е. носитель, субстрат, материал носителя, материал основы), используемый для иммобилизации лактоферрина для получения связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, не является особо ограниченным до тех пор, пока он представляет собой обычно используемый связывающий материал и может функционировать в качестве твердой фазы при желательных условиях и иммобилизовывать белок. Примеры такого связывающего материала включают таковые, имеющие на своей поверхности гидрофильную или гидрофобную смолу, и такому связывающему материалу можно придать различную форму, такую как частицы (бусы), пленки, волокна, полые волокна и сетки. Среди них предпочтительными являются связывающие материалы в форме бус (макрочастиц). Конкретный размер (диаметр) бус (частицы) может быть выбран подходящим образом в соответствии с целью применения, но составляет, например, обычно от 0,5 до 200 мкм, предпочтительно от 1,0 до 100 мкм, более предпочтительно от 1,0 до 50 мкм, еще более предпочтительно от 1,0 до 20 мкм, еще более предпочтительно от 1,0 до 10 мкм, особенно предпочтительно от 1,0 до 5,0 мкм.

[0048] Как описано выше, бусы (частица), имеющие на своей поверхности гидрофобную или гидрофильную смолу, предпочтительно используют в качестве связывающего материала (т.е. носителя субстрата, материала носителя, материала основы). В таком случае связывающий материал, активный в отношении связывания патогенной изоформы прионного белка, получают путем иммобилизации лактоферрина на связывающем материале, упоминаемом как бусы с иммобилизованным лактоферрином. Данные бусы, используемые в качестве связывающего материала, могут быть суспендированы и диспергированы в жидкости, и, если это необходимо в процессе эксплуатации, их легко можно осадить и собрать.

[0049] Более предпочтительно в качестве связывающего материала используют бусы, имеющие на своей поверхности гидрофобную или гидрофильную смолу и намагничиваемый материал внутри (в центре). В таком случае связывающий материал, активный в отношении связывания патогенной изоформы прионного белка, получают путем иммобилизации лактоферрина на связывающем материале, упоминаемом как бусы с иммобилизованным лактоферрином на основе намагничиваемых бус. Данные бусы, используемые в качестве связывающего материала, могут быть суспендированы и диспергированы в жидкости, и, если это необходимо в процессе эксплуатации, их легко можно осадить и собрать с использованием магнита. Если это необходимо в процессе эксплуатации, такую операцию специалист в данной области может провести во время, перед или после стадии контактирования образца с бусами с иммобилизованным лактоферрином или на стадии отделения компонента, связанного с бусами с иммобилизованным лактоферрином.

[0050] Образец не является особо ограниченным до тех пор, пока он представляет собой жидкий образец, в котором, как подозревают, содержится патогенная изоформа прионного белка (инфекционный прионный белок). Однако предпочтительно, чтобы в том случае, когда образец содержит патогенную изоформу прионного белка, патогенная изоформа прионного белка была бы в достаточной мере диспергирована в образце. В том случае, когда тестируемым объектом является животная ткань, образец предпочтительно получают с помощью солюбилизирования в достаточной мере животной ткани. Пример такого солюбилизированного образца включает жидкий образец, полученный гомогенизацией смеси животной ткани и поверхностно-активного вещества. рН такого жидкого образца не является особо ограниченным, но предпочтительно он близок к нейтральному. Более конкретно, рН обычно составляет от 5,5 до 7,8, предпочтительно от 6,0 до 7,7, особенно предпочтительно от 6,5 до 7,6. Поверхностно-активное вещество, используемое при получении такого жидкого образца, не является особо ограниченным до тех пор, пока оно представляет собой поверхностно-активное вещество, обычно используемое для солюбилизации животной ткани, но предпочтительно представляет собой неионное поверхностно-активное вещество с позиций солюбилизации животной ткани и поддержания структуры высшего порядка прионного белка. Предпочтительные примеры поверхностно-активного вещества включают Tween 20, тритон Х-100 и NP-40. Среди данных поверхностно-активных веществ Tween 20, тритон Х-100 и NP-40 являются предпочтительными, и Tween 20 и NP-40 являются особенно предпочтительными. Для того чтобы гарантировать специфическое связывание между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка, образец предпочтительно получают в виде жидкого образца, который можно привести в контакт с материалом, активным в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, в следующих условиях.

[0051] Для того чтобы гарантировать специфическое связывание между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка, образец предпочтительно приводят в контакт с материалом, активным в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, при рН, обычно составляющем от 5,5 до 7,8, предпочтительно от 6,0 до 7,7, особенно предпочтительно от 6,5 до 7,6, при температуре, обычно составляющей от 3 до 30°С, предпочтительно от 3 до 20°С, особенно предпочтительно от 3 до 5°С, обычно в течение от 5 до 300 минут, предпочтительно от 10 до 180 минут, особенно предпочтительно от 15 до 90 минут. Однако условия для контактирования материала, активного в отношении связывания с патогенной изоформой прионного белка, не ограничены указанным.

[0052] Животная ткань для солюбилизации не ограничена особо до тех пор, пока подозревается, что она содержит патогенную изоформу прионного белка (инфекционный прионный белок), но с позиций ранней диагностики предпочтительными являются одна или несколько из тканей мозга млекопитающего, спинного мозга, глаза и тонкого кишечника, поскольку известно, что патогенная изоформа прионного белка присутствует главным образом в данных тканях.

[0053] На стадии отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом, связанный компонент может быть отделен и элюирован путем его диссоциации со связывающим веществом патогенной изоформы прионного белка при относительно жестких условиях диссоциации в ряду различных условий, обычно используемых для диссоциации взаимодействий белок-белок. Например, отделение связанного компонента может быть осуществлено с использованием раствора, содержащего поверхностно-активное вещество, при рН, близком к нейтральному, и температуре от 3 до 30°С. Альтернативно, отделение связанного компонента может быть осуществлено путем диссоциации специфического связывания между лактоферрином и патогенной изоформой прионного белка при элюировании с использованием раствора, содержащего лактоферрин.

[0054] Предпочтительный вариант осуществления способа обнаружения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению может дополнительно включать, после стадии контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, полученным иммобилизацией лактоферрина на связывающем материале, но перед стадией отделения связанного компонента от связывающего вещества патогенной формы прионного белка, приведенного в контакт с образцом, стадию промывки связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка, приведенного в контакт с образцом. Стадию промывки обеспечивают главным образом в целях удаления компонента, неспецифически адсорбированного на связующем веществе патогенной изоформы прионного белка, приведенном в контакт с образцом, когда такой компонент присутствует. Стадию промывки можно проводить с помощью метода, обычно используемого для достижения описанной выше цели. Такой метод не ограничен конкретно, но, например, стадию промывки можно проводить путем промывания связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка раствором, который использовался для приготовления образца, предназначенного для контактирования со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка, но который не содержит солюбилизированной животной ткани или тому подобного.

[0055] Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу выделения патогенной изоформы прионного белка. Предпочтительный вариант осуществления способа выделения патогенной изоформы прионного белка согласно настоящему изобретению включает следующие стадии: контактирование образца, полученного солюбилизацией животной ткани со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка (связующий агент), полученным иммобилизацией лактоферрина на соединительном материале (т.е. носителе, субстрате, материале носителя, материале основы); и отделение связанного компонента от связывающего вещества патогенной изоформы прионного белка (связывающего агента), которое было введено на стадию контактирования образца со связующим веществом патогенной изоформы прионного белка.

[0056] В соответствии с данным способ