Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза

Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, фармацевтической промышленности, ветеринарии, и представляет собой фармацевтическую композицию, обладающую репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, предназначенную для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, и состоящую из биологически активного белково-полипептидного комплекса, включающего органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а также сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Фармкомпозиция представляет собой биологически активный белково-полипептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа, с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, с общей концентрацией белка 0,8-4,2 мг/мл с максимумом поглощения ультрафиолетовый спектр раствора при длине волны 280±5 нм, наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель включающий буферный раствор и вспомогательные вещества - высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы в достаточных концентрациях. Субстанция получена путем ионообменной хроматографии фильтрата гомогената ткани, в присутствии буферного раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности.

Известен целый ряд препаратов белково-пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающих ноотропной и нейрометаболической активностью, которые используются для лечения заболеваний нервной системы. К наиболее близким по достигаемому эффекту относятся: Церебролизин - средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов, фирмы «Ebewe» (Австрия) [1], который является продуктом обработки мозга интактных свиней; Цереброкурин - лечебное средство при заболеваниях, сопровождаюшихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО «НИР» (Украина) [2], который является продуктом обработки мозга эмбрионов животных;

Кортексин - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО «Герофарм» (Россия) [3], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием; Церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепарат) [4], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота.

В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (-85%), низкомолекулярные пептиды (-15%), микроэлементы, сырьем для получения которых служит мозг свиней. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10000 дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и крайне низким регенеративным, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.

В состав «Цереброкурина» входят водорастворимые пренатальные нейропептиды и продукты расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников из гомогенизата мозга эмбрионов животных, который после разбавления физиологическим раствором подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают исходя из контрольной пробы получаемого средства, и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше 10°С. С помощью данной технологии достигается более высокая (по сравнению с Церебролизином) активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия, за счет более высокой массы содержащихся пептидов и низкомолекулярных белков, оставшихся после протеолиза. Однако несмотря на длительное формирование раствора до окончания процессов агрегации и протеолиза данная технология не позволяет получить фракцию необходимой степени очистки для применении препарата внутривенно, что значительно затрудняет его биодоступность. Водная экстракция без буферизации раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов на этапах получения Цереброкурина, а также неопределенные сроки гестации эмбрионального мозга животных не позволяют обеспечить необходимую степень стандартизации, что допускает значительный разброс по составу полученных эволюционно закрепленных белково-пептидных концентрационных соотношений, снижая его тканеспецифическую нейрорегенеративную активность и стабильность фармакологического действия, ограничиваясь биологическим действием по типу обратной связи за счет сигнальной функции продуктов протеолиза ткани.

В состав «Кортексина» входит комплекс водорастворимых биологически активных щелочных, кислых и нейтральных полипептидов с мол. м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5, получаемых из измельченной замороженной ткани головного мозга скота путем экстракции раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивании с последующей очисткой, стерилизации и лиофилизации целевого продукта.

Препарат предназначен для внутримышечного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных низкомолекулярных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Несмотря на то, что препарат участвует в регуляции соотношений тормозных и возбуждающих аминокислот, концентрации серотонина и дофамина, оказывая ГАМК-позитивное влияние, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, ускоряет восстановление функций головного мозга после стрессорных воздействий, Кортексин имеет невысокую активность и специфичность в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным, в том числе незначительным репаративным, потенциалом для нервной ткани, что требует значительной продолжительности курсового лечения.

В состав «Церебролизата» также входят водорастворимые полипептиды как результат гидролиза коры головного мозга крупного рогатого скота, обладающие слабой ферментативной активностью, с молекулярной массой не более 15000 Да. Обозначенная в патенте вариация аминокислотного состава препарата допускает значительный разброс по составу полученных пептидных концентрационных соотношений, определяя низкую тканеспецифическую активность и стабильность фармакологического действия - со слабым нейрометаболическим и невыраженным ноотропным эффектом.

Неуклонный рост сосудистых заболеваний центральной нервной системы, а также увеличение количества случаев травматического, токсического и гипоксического поражения головного и спинного мозга (ДТП, техногенные катастрофы, природные катаклизмы…) побуждает фармакологов к поиску новых, более эффективных препаратов для успешного лечения больных неврологического и нейрохирургического профиля, реабилитации этих пациентов и снижения уровня инвалидизации населения.

Целью данного изобретения явилось создание фармацевтической композиции, обладающей выраженным репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза.

Поставленная цель достигается тем, что фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполнена в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконьюктивального введения и содержит в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из быстроразмороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, гомогенизацией его в буферном растворе, содержащем ЭДТА (этилендиамино-тетрауксусную кислоту), отделением гомогената от балластных веществ фильтрованием, центрифугированием, отделением белков и пептидов хроматографией на колонке хроматографической с анионообменным носителем, уравновешенной буферным раствором, со ступенчатым градиентом буферного раствора, ультрафильтрацией, обессоливанием и стерилизующей фильтрацией, и включающий отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений рI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

При этом фармацевтическая композиция в качестве разбавителя предпочтительно, может содержать фармакопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.

Итак, поставленная цель достигается описываемой фармкомпозицией, содержащей в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс, состоящий из отрицательно заряженных слабокислых, нейтральных белков и полипептидов с молекулярной массой от 5 до 200 кДа, полученных из эмбриональной ткани мозга копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности, включающий органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а также сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, фармацевтически приемлемый разбавитель, состоящий из буферного раствора, например фосфатный буфер, и вспомогательных веществ - высокомолекулярные соединения, например кармелоза; стабилизаторы, например маннитол, консерванты, например нипагин, и солюбилизаторы, например полисорбат-80.

Заявляемая фармакологическая композиция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, отличается от заявленных ранее субстанций и композиций, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, взятого на определенных сроках гестации, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций (до 200 кДа), их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по способу применения (парентерально, интратекально, интраназально, субъконбюктивально), по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств), по биологической и фармакологической активности и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная, репаративно-регенеративная). Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения биологически активного комплекса.

Получение белковой фракции из эмбрионального мозга свиней. 250 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов свиней сроком гестации 14 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1% мальтозы, в течение 7 минут при 8°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 18000 g и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 8°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ NaCl, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650М. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом, повышая концентрацию соли с шагом 10%, собирая целевые фракции. Хроматографический процесс производят при температуре 8°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белковой фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм; максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют следующими методами: гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 200 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значении рI 4,2 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле, и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Аминокислотный анализ, %: Asp - 10,82±2,8; Thr - 5,4±1,6; Ser - 5,2±1,8; Glu - 16,2±3,4; Pro - 7,045±2,5; Gly - 5,2±2,4; Ala - 5,4±1,8; Val - 7,08±2,9; Met - 2,65±1,4; He - 4,45±1,8; Leu - 9,4±2,6; Tyr - 4,02±1,2; Phe - 4,8±1,9; Orn - 0,48±0,2; Lys - 8,48±2,4; His - 2,8±0,9; Arg - 6,52±2,2.

Пример 2. Способ получения биологически активного комплекса.

Получение белковой фракции из эмбрионального мозга поросят. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов поросят сроком гестации от 20 до 22-х недель размораживают и гомогенизируют в 800 мл 50 мМ Трис-малеатного буферного раствора рН 5,8,содержащего 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% маннит, в течение 5 минут при 25°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 30000 g в течение 30 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 25°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,04 М NaCl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракции с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 50 мМ раствором аспартата-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до общей концентрации 0,01 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм; максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, ределяют следующими методами: гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений рI 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Аминокислотный анализ полученного комплекса, %: Asp - 10,82±1,3; Thr - 5,4±0,9; Ser - 5,2±1,1; Glu - 16,2 db 1,9; Pro - 7,045±1,7; Gly - 5,2±0,8; Ala - 5,4±1,1; Val - 7,08±2,3; Met - 2,65±0,6; He - 4,45±0,8; Leu - 9,4±2,5; Tyr - 4,02±0,6; Phe - 4,8±1,1; Orn - 0,48±0,1; Lys - 8,48±2,3; His - 2,8±0,7; Arg - 6,52±2,1.

Пример 3. Способ получения фармкомпозиции.

Полученный по примеру 1 раствор биологически активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ глициново-фосфатным буферным раствором, с общим содержащим, 0,5% маннитола, 0,1% кармелозы, 0,0005% полисорбата 80 и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН 8,0, с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9-1,2 мг/мл. То есть композиция может содержать биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,9 мг/мл, 1 мг/мл, 1,2 мг/мл.

Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.

Свойства полученной фармкомпозиции были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [5].

Пример 4. Способ получения фармкомпозиции.

Полученный по примеру 2 раствор биологически активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ малеатным буферным раствором рН 5,8, с общим содержащим 0,3% молочной кислоты, 0,5% маннита, 0,1% кармелозы, до 0,0005% полисорбата 80 с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9-1,2 мг/мл, т.е. фармкомпозиция может содержать биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,9 мг/мл, 1 мг/мл, 1,2 мг/мл.

Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.

Пример 5. Исследование токсичности

Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: стерильный интраназальный дозированный спрей в стеклянном или полимерном флаконе емкостью 10 и 30 мл (0,1 мг/мл); раствор для инъекций: 5 ампул по 1 мл (0,1 мг/мл), 5 ампул по 2 мл (0,1 мг/мл), 1 ампула по 2 мл (0,2 мг/мл). Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4 мг при эндолюмбальном введении и 0,1 мг при внутривенном введении.

Условия проведения эксперимента и методы исследований

Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции. Исследование проводили на мышах обоего пола линии BALB/C массой 18-20 г при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы.

Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. Максимально возможная для введения мышам доза готовой лекарственной формы 0,2 мл и составила 10 мг/кг, что превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз. Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали вскрытию и анализу состояния внутренних органов.

Результаты исследования острой токсичности

Мыши. Масса животных составила от 18 до 20 г. Вводимая доза 0,2 мл, что составило 10 мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток.

Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми. Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.

Поведение. Не отличалось между группами и от нормы.

Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было.

Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено.

Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось.

Исследование подострой (субхронической) токсичности

Условия проведения эксперимента и методы исследований

Исследования токсичности оригинальной фармкомпозиции в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250 г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом:

1 группа (контроль) интактные животные

2 группа - оригинальная фармкомпозиция т.д. подкожное введение (п/к)

3 группа - оригинальная фармкомпозиция × 10 п/к

4 группа - оригинальная фармкомпозиция внутривенное введение (в/в) т.д.;

5 группа - оригинальная фармкомпозиция в/в × 10.

Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорбтивного действия.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения:

по выживаемости и общему виду (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы);

состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание);

изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента);

физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет).

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь:

морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина); биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования.

Макроскопические исследования

Выживаемость: все подопытные животные перенесли все способы введения. Гибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.

Поведение: Каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.

Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета, без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.

Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное, обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы.

Клинические исследования

Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет.

Гематологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.

Биохимические исследования: пептидный комплекс в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белокобразующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы.

Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.

Патоморфологические данные: Макроскопическое исследование.

У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно-жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной и ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека. Миокард на разрезе без патологических изменений.

Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена.

Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы.

Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба.

Семенники и яичники без особенностей.

Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний.

Щитовидная железа плотная с симметричными долями.

Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе.

Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.

Микроскопическое исследование

во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла, патоморфологических изменений не выявлено.

Исследование субхронической токсичности при интраназальном введении.

На половозрелых животных.

Исследования проводили на половозрелых кроликах самках породы Шиншилла весом 2500 г. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 1 месяц.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл.

Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия.

После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.

Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).

Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования

1. Визуальные наблюдения:

Выживаемость: все подопытные животные перенесли введение фармкомпозиции в исследуемых дозах. Гибели не наблюдалось.

Поведение: повышенной или пониженной активности у подопытных животных сравнительно с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус у подопытных животных и контрольных не отличался повышенной возбудимостью. Замечено, что введение препарата не вызывает у животных чувство дискомфорта.

Внешний вид: все животные независимо от применяемой дозы были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета, без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.

Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы; экскрет по цвету и оформленности не отличался от контроля.

2. Клинические исследования:

Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная, и достоверно не отличалась от интактного контроля.

Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.

Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах нормы. Концентрация белка у кроликов, получавших фармкомпозицию 1 и 2 раза в день статистически не различалась.

3. Патоморфологические данные:

Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла, патоморфологических изменений не выявлено.

Таким образом, проведены исследования субхронической токсичности назальной формы фармкомпозиции. При субхроническом исследовании спрея не было выявлено значимых изменений внутренних органов испытуемых животных, не обнаружено местнораздражающего действия. При изучении субхронической токсичности использовали клинические методы исследования, общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов и слизистых носа.

Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых кроликах при интраназальном введении на неполовозрелых животных

Исследования проводили на 3-недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500 г. Нанесение препарата производили ежедневно 1 и 2 раза в день по 1 впрыску в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия.

После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.

Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с п