Рекомбинантная вакцина против вируса африканской катаральной лихорадки

Рекомбинантная вакцина против вируса африканской катаральной лихорадки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к векторам, содержащим, по меньшей мере, один полинуклеотид рода Orbivirus семейства Reoviridae, более специфично, вируса африканской катаральной лихорадки, называемого вирус синего языка (BTV), или, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую, по меньшей мере, один BTV антиген, иммуноген или эпитоп, напр., in vivo и in vitro экспрессирующим векторам, которые могут содержать и экспрессировать, по меньшей мере, один полинуклеотид BTV, или in vivo и in vitro экспрессирующим векторам, которые могут содержать и экспрессировать, по меньшей мере, один BTV антиген, иммуноген или эпитоп, а также к иммуногенным композициям и вакцинам против заболевания синий язык; например, таким композициям или вакцинам, которые могут содержать один или более векторов и/или один или более продуктов экспрессии векторов. Изобретение также относится к способам применения векторов, композиций и вакцин, включая иммунизацию и вакцинацию против этого вируса, экспрессирующего продукты экспрессии полинуклеотида(ов), используя продукты экспрессии в анализах или для получения антител, пригодных в анализах, а также к способам приготовления полинуклеотида(ов), векторов, композиций, вакцин, анализов, inter alia.

Предшествующий уровень техники

Африканская катаральная лихорадка или заболевание синий язык (ВТ) представляет антропонозное инфекционное вирусное заболевание жвачных животных. Крупный рогатый скот и козы могут с легкостью заражаться вызывающим заболевание вирусом BTV, но без обширного сосудистого поражения, и, следовательно, эти виды обычно не в состоянии показывать выраженные клинические симптомы. Наоборот, заболевание у овец характеризуется катаральным воспалением слизистых оболочек рта, носа и кардиального отдела желудка и воспалением венчиков копыт и пластинки копыт. Наблюдается отслаивание эпителия и, в конечном счете, некроз слизистой оболочки щеки; вздутые и воспаленные язык и рот могут окрашиваться в синий цвет, из-за чего эта болезнь получила свое название (Spreull 1905). Уровень смертности овец насчитывает 1-30%.

BTV представляет собой прототипный вирус рода Orbivirus (семейство Reoviridae) и имеет, по меньшей мере, 24 различных серотипов (Wilson and Mecham 2000). Различные штаммы BTV идентифицированы во всем мире во всех тропических и температурных зонах. BTV инфекция происходит до 45°N в Европе, до 50°N в Азии и Северной Америке и до 35° в Южной. BTV не является контагиозным среди жвачных животных, таким образом распространение BTV зависит от присутствия членистоногих векторных видов coides sp. (biting midges), с различными векторными вилами, находящимися в различных частях мира. Последние данные полагают, что генетический дрейф и эффект основателя обеспечивают разнообразие отдельных генных сегментов полевых штаммов BTV (Bonneau, Mullens et al. 2001). Показано, что BTV серопозитивные животные резистентны к повторному инфицированию гомологичным серотипом BTV.

BTV инфицирование у жвачных является транзиторным, тогда как инфицирование вектором насекомых Culicoides - персистентным. Продолжительность виремии зависит от животных видов и штамма BTV. Было отмечено, что виремия может быть транзиторной у овец и может длиться до 41 дня у BTV-инфицированных индивидуумов, до 42 дней у коз и до 100 дней у крупного рогатого скота. Поскольку BTV инфекция крупного рогатого скота часто приводит к длительной, но не персистентной, виремии, крупный рогатый скот служит как резервуар, из которого вирус может заражаться вектором Culicoides и затем передаваться другим жвачным (Anderson, Stott et al. 1985; MacLachlan 1994; MacLachlan and Pearson 2004). Экология многих видов векторов Culicoides плохо изучена, их место расположения не охарактеризовано, и их скорости распространения не известны. Culicoides sonorensis представляет главный вектор BTV в Северной Америке. Самки насекомых Culicoides становятся устойчиво инфицированными BTV и могут переносить вирус после наружного периода инкубации, длящегося до 14 дней (Mullens, Tabachnick et al. 1995). BTV, перезимовавший в умеренных зонах, может проникать посредством вертикального инфицирования инсектицидными векторами, хотя последние данные показывают, что наблюдается сниженная экспрессия внешних капсидных генов в течение персистентной инфекции BTV на стадиях личинки векторов насекомых (White, Wilson et al. 2005).

Вирионы BTV имеют диаметр ~69 нм с двухслойным покрытием (капсид), который иногда окружается липопротеиновой "псевдо-оболочкой", полученной из клеточных мембран инфицированных клеток. BTV геном включает 10 разных сегментов двухцепочечной РНК, которые вместе кодируют семь структурных (VP1 - VP7) и четыре неструктурных (NS1, NS2, NS3 и NS3a) протеина (Roy 1996); 9 геномных сегментов являются моноцистронными, при этом сегмент 10 кодирует и NS3 и NS3A, используя второй, внутрирамочный стартовый кодон. Геномная РНК заключена в капсид в двадцатигранной вирионной частице посредством двухслойного протеинового капсида (Verwoerd, Els et al. 1972). Двадцатигранное ядро состоит из двух главных (VP3 и VP7) и трех минорных протеинов (VP1, VP4, VP6) и окружено внешним капсидом, который состоит из VP2 и VP5, которые соответственно кодируются геномными сегментами 2 и 5 (Roy 1996). VP2 является ответственным за связывание и вхождение BTV в клетки, нейтрализацию, серотип-специфичность и гемагглютинацию. Многомерные формы VP2 (димеры и тримеры) отделывают большую часть поверхности VP5, помещенного на внешнюю поверхность вирусных частиц (Hassan and Roy 1999). VP2 различается наиболее среди 24 BTV серотипов, и уровни анти-VP2 антитела коррелируют с вирусной нейтрализацией in vitro и in vivo (Huismans and Erasmus 1981). VPS также отличается значительно между различными серотипами и штаммами BTV (de Mattos, de Mattos et al. 1994; DeMaula, Bonneau et al. 2000), и хотя не было определено VP5-специфичных нейтрализующих MAb, данные полагают, что этот протеин играет роль в нейтрализации и определении серотипа через его конформационное влияние на VP2 (Huismans and Erasmus 1981; Roy, Urakawa et al. 1990; DeMaula et al., 2000). Очищенный VP2, иммуноабсорбированный с помощью BTV anti-core сыворотки с устранением следовых количеств VP7, был введен овцам. Начальная доза в 50 микрограммов VP2 была достаточной для индуцирования VP2-оседающих антител, а также нейтрализующих и ингибирующих гемагглютинацию антител. Эти овцы были полностью защищены против провокации вирулентным штаммом этого же серотипа BTV. Более низкие дозы VP2 еще обеспечивали значимый уровень защиты, даже если нейтрализующее антитело не определялось перед провокацией (Huismans, van der Walt et al. 1987). Последние результаты показали, что VP2 и NS1 экспрессируют эпитопы, узнаваемые цитотоксичными Т-лимфоцитами (CTL) (Andrew, Whiteley et al. 1995), хотя невероятно, что VP7 и VP5 имеют CTL эпитопы. В данное время VP3, VP4, VP6, NS2 и NS3 не стимулируют CTL ответ у овец (Lobato, Coupar et al. 1997). Таблица 1 (модифицированные из (Wilson and Mecham 2000)) ниже суммирует гены BTV и их протеиновые функции:

Таблица 1
Гены вируса синий язык и кодирующие протеины с положением, свойствами и действием протеинов
Часть генома	Протеин	Положение	Свойства и действие
L1 (3954 пн) (150 кДа)	VP1	В sub-core на оси 5 порядка	РНК-зависимая РНК-полимераза
L2 (2926 пн) (111 кДа)	VP2	Наружный капсид (тример)	Наружный капсид, серотип специфичный антиген, протеин связывающий клетки млекопитающих, нейтрализующие эпитопы
L3 (2770 пн) (103 кДа)	VP3	Sub-core капсидный слой (Т=2 симметрия)	Отдаленная протеиновая капсидная оболочка, sub-core капсидный слой, самосборные, поддерживает двадцатигранную симметрию, РНК связывание, взаимодействует с внутренними малыми протеинами
М4 (2011 пн) (76кДа)	VP4	В sub-core на оси 5 порядка (димер)	Кэппинг фермент. Гуанилилтрансфераза
М5 (1638 пн) (59 кДа)	VP5	Наружный капсид (тример)	Внутренний внешний капсидный протеин, может затрагивать характеристики вирусного серотипа
М6 (1769 пн) (64 кДа)	NS1	Цитоплазма	Формы тубул в клеточной цитоплазме
S7 (1156 пн) (38кДа)	VP7	Наружный капсид (Т=13 симметрия, тример)	Наружный core поверхностный протеин, иммуно-доминантный главный специфичный к серогруппе антиген, протеин прикрепления для векторных инсектиционных клеток, взаимодействует с 'core нейтрализирующими 'антителами
S8 (1124 пн) (41 кДа)	NS2	Цитоплазма, вирусные тельца включения (VIB)	Важные вирусные включения основной матрицы протеин, ssRNA связывание, фосфорилированный, может связываться с внешним капсидом
S9 (1046 пн) (36 кДа)	VP6	В sub-core на оси 5 порядка	ssRNA и dsRNA связывание, геликаза, МТРаза
S10 (822 пн) (24 кДа)	NS3, NS3a	Клеточные мембраны	Гликопротеины, мембранные протеины, включенные в клеточный выход

Lobato и Coupar (Lobato, Coupar et al. 1997) разработали вакцинные основанные на вирусе экспрессирующие векторы, содержащие различные включения, соответствующие нуклеотидным последовательностям, кодирующим структурные протеины VP2, VP5 и VP7 BTV для обоих in vivo и in vitro исследований. Эти экспрессирующие векторы вводили кроликам и овцам с развитием иммунного ответа относительно ELISA и титра нейтрализующих антител и исследовали защитную эффективность VP2 и VP5 конструкций у овец. Вакцинные вирус-экспрессирующие VP2, VP5 и VP2+VP5 являлись защитными, с наиболее повторяемой защитой, проявляющейся у животных, иммунизированных обоими VP2 и VP5, хотя защита даже этими конструкциями различалась.

Будет выгодно обеспечить усовершенствованные иммуногенные и вакцинные композиции против BTV и способы приготовления и применения таких композиций, включая такие композиции, которые обеспечивают способы дифференциальной диагностики, анализы и наборы.

Каждая из вышеуказанных заявок совместно с документом, цитируемым здесь, и каждый из документов, на который ссылаются и который цитируется здесь, объединены посредством ссылки.

Каждый документ, цитируемый в тексте ("документы, цитируемые в заявке"), и каждый документ, цитируемый или на который ссылаются в каждом документе, цитируемом в заявке, и любые характеристики производителя или инструкции для любых продуктов упомянуты в тексте и в любом документе, объединенном в этом тексте, объединены здесь посредством ссылки; и технология в каждом из документов, объединенных здесь посредством ссылки, может использоваться в способе применения данного изобретения.

Цитата или определение любого документа в данной заявке не является признанием, что такой документ является пригодным в качестве уровня техники настоящего изобретения.

Сущность изобретения

Изобретение обеспечивает иммуногенную или вакцинную композицию для индуцирования иммунного ответа или защитной иммунной реакции против Orbivirus, в особенности вируса синий язык (BTV), у животных, восприимчивых к BTV, или сходного вируса, содержащую или состоящую преимущественно из фармацевтически или ветеринарно-приемлемого связующего вещества или наполнителя и вектора, который содержит или состоит преимущественно из гетерологичной(ых) молекулы(л) нуклеиновой кислоты и который экспрессирует в животном in vivo Orbivirus - BTV протеин, антиген, иммуноген или его эпитоп, такие как, но не ограничиваясь, BTV VP2 (L2) и BTV VP5 (М5) полипептиды.

Вектором может быть рекомбинантная ДНК плазмида или рекомбинантный вирус, такой как рекомбинантный аденовирус, вирус герпеса или вирус оспы, напр., вирус avipox, такой как вирус оспы канареек или вирус оспы птиц. Животное может выбираться из группы парнокопытных, состоящей из овцы, быки, свиньи, козы, антилопы, лошади, ламы и других.

Преимущественно молекула нуклеиновой кислоты содержит или состоит преимущественно из нуклеотидов 20-2887 (SEQ ID NO:3 и 1), кодирующих BTV VP2 (L2), и соответственно нуклеотидов 30-1610 (SEQ ID NO:4 и 2), кодирующих BTV протеин VP5 (М5). Предпочтительное воплощение содержит или состоит из молекул нуклеиновой кислоты млекопитающих с оптимизированными кодонами.

Иммуногенная или вакцинная композиция может дополнительно содержать адъювант, такой как карбомер.

Иммуногенная или вакцинная композиция может дополнительно содержать антиген или иммуноген или его эпитоп из патогена животного, иного, чем BTV, или вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген, иммуноген или его эпитоп, и экспрессирует ее in vivo в животном, или инактивированный или ослабленный патоген, другой, чем BTV.

Изобретение дополнительно включает набор, содержащий или состоящий преимущественно из (а) иммуногенной или вакцинной композиции, и (b) антигена или иммуногена или его эпитопа из патогена, отличного от BTV, животного, или вектора, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген, иммуноген или его эпитоп, и экспрессирует ее in vivo в животном, или инактивированный или ослабленный патоген, отличный от BTV, животного, в котором (а) и (b) находятся в раздельных контейнерах, и набор необязательно содержит инструкции для смешивания и/или введения (а) и (b).

Изобретение также охватывает способ индуцирования иммунологического или защитного иммунного ответа против BTV в животном, который может содержать введение животному иммуногенной или вакцинной композиции, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген, иммуноген или ее эпитоп.

Изобретение дополнительно охватывает способ индуцирования иммунологического или защитного иммунного ответа против BTV у животного, который может содержать введение животному (а) иммуногенной или вакцинной композиции, и (b) BTV изолированного антигена, иммуногена или эпитопа, в котором (а) вводится до (b) в режиме двукратной иммунизации, или (b) вводится до (а) в режиме двукратной иммунизации, или (а) и (b) вводятся совместно, либо последовательно, либо в смеси. Изобретение также включает набор для осуществления этого, который может содержать (а) и (b) в раздельных контейнерах, необязательно с инструкциями для смешивания и/или введения.

Изобретение даже дополнительно охватывает двукратную иммунизацию или вакцинацию против BTV, где примирование (а) ДНК вакциной(ами) или иммунологической или иммуногенной композицией(ями), которая содержит или состоит преимущественно из (а) молекулы(л) нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей in vivo BTV иммуноген, антиген или эпитоп, и стимулирование осуществляется (а) вакциной(ами) или иммунологической или иммуногенной композицией(ями), которая является BTV инактивированным, или ослабленным, или субъединичным (антиген, иммуноген и/или эпитоп) препаратом(ами), и/или (а) рекомбинантной или модифицированной вирусной вакциной, или иммунологической или иммуногенной композицией(ами), которая содержит или состоит преимущественно из (а) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей in vivo BTV иммуноген(ы), антиген(ы) или эпитоп(ы). Таким образом, изобретение обеспечивает способ двукратной иммунизации или вакцинации против BTV, такой как двукратная иммунизация или вакцинация, которая может содержать введение мишеневым видам животных (а) ДНК вакцины(н) или иммунологической или иммуногенной композиции(й) изобретения (которая содержит или состоит преимущественно из молекул(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующей и экспрессирующей(их) in vivo BTV антиген(ы), иммуноген(ы) или эпитоп(ы) (в качестве затравки) и с последующим введением (в качестве стимула) инактивированного BTV и/или ослабленного BTV или BTV субъединичного (антиген, иммуноген и/или эпитоп) препарата(ов)) и/или рекомбинантной или модифицированной вирусной вакцины или иммунологической или иммуногенной композиции, которая может содержать молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, кодирующую и экспрессирующую in vivo BTV иммуноген(ы), антиген(ы) или эпитоп(ы), преимущественно (а) рекомбинантной вакцины или иммунологической или иммуногенной композиции(й), которая экспрессирует BTV иммуноген, антиген или эпитоп in vivo. Стимул может преимущественно совмещаться с затравкой, напр., стимул содержит или состоит преимущественно из или экспрессирует, по меньшей мере, один антиген, эпитоп или иммуноген, который экспрессируются посредством затравки.

Режим двукратной иммунизации согласно изобретению может использоваться у животных любого возраста, преимущественно у молодых животных (напр., животных, которые имеют определяемые материнские антитела и/или находятся на грудном вскармливании), у еще не взрослых животных (животных, которые старше молодых животных, но еще не достигли зрелости или периода полового созревания или возраста, пригодного для спаривания или размножения), у взрослых животных (напр., животных, которые находятся в возрасте спаривания или размножения или старше), и является выгодным применение режима двукратной иммунизации у беременных самок или самок перед родами, кладкой или оплодотворением.

Изобретение также относится к таким иммуногенным и вакцинным композициям и наборам из них, пригодным для использования в таком режиме двукратной иммунизации и режимах двукратной иммунизации. Хозяин или мишеневый вид, для которого практикуется режим двукратной иммунизации, включает любого животного (мишеневого или хозяина) вида, восприимчивого к заболеванию, вызванному инфекцией Orbivirus, включая млекопитающих, рептилий, птиц, в особенности людей, парных млекопитающих или животных, таких как, но не ограничиваясь, собак, кошек, лошадей, млекопитающих из зоопарков или животных, таких как морские млекопитающие, напр., тюлени, кошки, лошади, зоопарковые рептилии, такие как змеи, крокодилы, аллигаторы, и птичьи виды.

Режим двукратной иммунизации в особенности выгоден для применения у молодого животного, поскольку это позволяет провести вакцинацию или иммунизацию в раннем возрасте, например первое введение в режиме двукратной иммунизации, когда практикуется для молодого животного, может быть в возрасте, при котором молодое животное имеет материнские антитела. Другое преимущество этого режима состоит в том, что может обеспечиваться уровень безопасности для беременных самок, присутствующих в этой же местности или в непосредственной близости к молодому животному или друг к другу. Таким образом, изобретение обеспечивает двукратную иммунизацию или способ вакцинации против BTV, и способ может осуществляться для молодого животного, такого как ягненок, щенок или котенок, например, если примирование осуществляется во время, когда молодое животное имеет материнские антитела против BTV, при этом стимулирование выполняется преимущественно во время, когда материнские антитела могут быть ослаблены или снижены или не присутствовать, как, например, в период после кормления грудью.

Таким образом, изобретение также включает наборы для осуществления режима двукратной иммунизации, содержащие или состоящие преимущественно из примирующей вакцинной или иммунологической или иммуногенной композиции и стимулирующих вакцинных, или иммунологических, или иммуногенных композиций, в раздельных контейнерах, необязательно с инструкциями для смешивания и/или введения.

Дополнительно, изобретение обеспечивает способ дифференциальной диагностики, содержащий введение животному иммуногенной или вакцинной композиции и/или BTV антигена, иммуногена или эпитопа, и тестирование животного на предмет наличия или отсутствия BTV протеина или антитела, не экспрессирующегося иммуногенной или вакцинной композицией и/или не присутствующего в BTV антигене, иммуногене или эпитопе. Изобретение дополнительно включает набор для осуществления этого способа, содержащий иммуногенную или вакцинную композицию и/или BTV антиген, иммуноген или эпитоп, и анализ для тестирования по поводу присутствия или отсутствия BTV протеина, в раздельных контейнерах, необязательно с инструкциями для введения иммуногенной или вакцинной композиции и/или BTV антигена, иммуногена или эпитопа и/или для осуществления анализа.

Необходимо указать, что в данном описании и в особенности в формуле изобретения и/или параграфах, термины, такие как "содержит", "содержащий" и подобные и такие термины как "состоящий преимущественно из" и "включает преимущественно", имеют значения, приписываемые им патентным законом США, напр., они предназначены для элементов, неточно изложенных, но исключая элементы, которые имеются в уровне техники или которые затрагивают основные или новые характеристики изобретения.

Эти и другие воплощения описываются и следуют из и охватываются следующим подробным описанием.

Краткое описание чертежей

Следующее подробное описание, представленное посредством примера, но не предназначенное для ограничения изобретения только по описываемым специфичным воплощениям, лучше будет понимаемым в сочетании с сопутствующими чертежами.

Фиг.1 изображает последовательность нуклеиновой кислоты BTV-17 нативного VP2 (BTV-17 VP2 native - SEQ ID NO:3) по сравнению с синтетическим BTV17 VP2 с оптимизированными кодонами (synthetic BTV-17 VP2 - SEQ ID NO:1).

Фиг.2 изображает последовательность нуклеиновой кислоты BTV-17 нативного VP5 (BTV-17 VP5 native - SEQ ID NO:4) по сравнению с синтетическим BTV17 VP5 с оптимизированным кодоном (synthetic BTV-17 VP5 - SEQ ID NO:2).

Фиг.3 представляет схематическую конструкцию плазмиды 043004pPCR - Script, кодирующую оптимизированный синтетический протеин BTV VP2.

Фиг.4 представляет схему реакционной карты донорной плазмиды pNVH6C5LSP-18.

Фиг.5 представляет схематическую конструкцию pCXL148.2, ALVAC донорной плазмиды.

Фиг.6 показывает нуклеиновую последовательность pCXL148.2 донорной плазмиды (SEQ ID NO:13).

Фиг.7 представляет схематическую конструкцию pALVAC С5Н6р-синтетического BTV VP2 (pLH2030.2), донорная плазмида.

Фиг.8 представляет схематическую конструкцию плазмиды 043005pPCR - Script, кодирующую оптимизированный синтетический протеин BTV VP5 для добавления 42Kp синтетической промоторной последовательности энтомологического вируса оспы Amsacta moorei к фрагменту BTV-VP5.

Фиг.9 представляет схематическое изображение схемы клонирования для 42Кp запускаемого промотором оптимизированного синтетического BTV VP5 в PCR 2.1 ТОРО клонирующий/челночный вектор (создание PCR 2-42KpVP5) для амплификации кассеты 42KpVP5.

Фиг.10 представляет схематическое изображение конструкции итогового донорского гомологичного вектора pС5Н6рVР2 42KpVP5 (pLH2078.15), содержащего оптимизированный VP2, запускаемый промотором Н6, и оптимизированный BTV VP5, запускаемый 42K промотором, с векторной гомологией с C5R областью из ALVAC.

Фиг.11 обеспечивает данные о последовательности нуклеиновых кислот и протеиновой последовательности для pLH2078.15 (рС5 Н6р синтетический BTV-VP2 42Kр синтетический BTV-VP5), итогового гомологичного вектора для создания рекомбинантной ALVAC+BTV. А раскрывает SEQ ID NOS:20-21 соответственно в порядке появления. В раскрывает SEQ ID NO:19, кодирующую SEQ ID NOS: 20-21. С раскрывает нуклеотиды 1800-6293 из SEQ ID NO:19, кодирующей SEQ ID NOS:20-21. D раскрывает SEQ ID NO:22.

Фиг.12 изображает схему, иллюстрирующую конструкцию рекомбинантного ALVAC вирусного вектора, кодирующего BTV оптимизированные синтетические VP2 и VP5 (vCP2289).

Фиг.13 представляет теоретическую карту расщепления RE для рекомбинантной ALVAC-BTV vCP2289, образованной из плазмиды и ALVAC последовательности нуклеиновых кислот, приготовленной посредством Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Фиг.14 представляет окрашенный агарозный гель, показывающий расщепление рестрикционной эндонуклеазой геномной ДНК, выделенной из ALVAC+BTV рекомбинантного вируса vCP2289 (сравнение с теоретически ожидаемым характером исчерченности, как показано на фиг.13, выше).

Фиг.15 показывает анализ Саузерн-блот рестрикционной эндонуклеазы, расщепляющей vCP2289 геномную ДНК, зондированную BTV-специфичным ДНК зондом.

Фиг.16 представляет Вестерн-блот фракций лизата CEF и супернатанта, приготовленных после инфицирования двумя различными изолятами vCP2289, зондируя для экспрессии VP5 из ALVAC рекомбинантного вируса. Первичный антительный зонд представлял кроличью анти-ВТV-17 VP5 специфичную поликлональную сыворотку, использующуюся в разведении 1:2000.

Фиг.17 представляет карту средних температур тела овец, иммунизированных vCP2289 по сравнению с WNV-CP контрольной вакциной после провокации вирулентным BTV-17 дикого типа.

Фиг.18 представляет карту, показывающую среднее количество лейкоцитов (WBC) овец, иммунизированных vCP2289 по сравнению с WNV-CP контрольной вакциной после провокации вирулентным BTV-17 дикого типа.

Фиг.19 представляет карту, показывающую среднее количество лимфоцитов овец, иммунизированных vCP2289 по сравнению с WNV-CP контрольной вакциной после провокации вирулентным BTV-17 дикого типа.

Фиг.20 представляет карту, показывающую среднее количество тромбоцитов овец, иммунизированных vCP2289 по сравнению с WNV-CP контрольной вакциной после провокации вирулентным BTV-17 дикого типа.

Фиг.21 изображает последовательность праймеров для амплификации экспрессионной касеты 42Kp-BTV VP5.

Подробное описание изобретения

Как здесь указано, настоящее изобретение относится к векторам, содержащим, по меньшей мере, один полинуклеотид BTV или, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей, по меньшей мере, один BTV антиген, иммуноген или эпитоп, напр., in vivo и in vitro экспрессирующим векторам, содержащим, по меньшей мере, один полинуклеотид BTV, или in vivo и in vitro экспрессирующим векторам, содержащим и экспрессирующим, по меньшей мере, один BTV антиген, иммуноген или эпитоп, а также к иммуногенным композициям и вакцинам против заболевания синий язык; например, таким композициям или вакцинам, которые содержат один или более векторов и/или один или более продуктов экспрессии векторов.

Преимущественно иммуногены, антигены содержат внешний капсидный протеин VP2 (L2), или внешний капсидный протеин VP5 (М5), или эпитопы или комбинации их, напр., VP2 и VP5; VP2; и VP5 или их фрагменты. Комбинации могут состоять из отдельных протеинов или полипротеинов. Композиции или вакцины могут, таким образом, содержать один или более векторов, экспрессирующих более одного протеина, напр., различные протеины. Композиции или вакцины могут содержать, или векторы из них экспрессировать, протеины из различных штаммов или изолятов BTV. Таким образом, композиции или вакцины могут содержать, или векторы из них экспрессировать, VP2, VP5 или их комбинации, при этом VP2 и VP5 происходят из различных штаммов или изолятов.

В этой связи необходимо отметить, что используется серотип 17 BTV изолята или штамма, напр., полевых изолятов (депонированных как сегменты в GenBank:(de Mattos, de Mattos et al. 1994)[VP2] изолят 17В81, SEQ ID No. S72158; (Mecham and Johnson 2005)[VP5] изолят FL99, SEQ ID No: AY855281); и/или Американской коллекции типовых культур VR-875™ (депонированные как BTV серотип 17; кровь от овцы с типичной болезнью синий язык Wyoming, 1962). Вследствие сегментной природы генома BTV геномные нуклеотидные последовательности для каждого сегмента определяются индивидуально для каждого сегмента серотипа. В Таблице 2 перечисляются последовательности, пригодные для ВТV серотипа 17.

Также необходимо отметить, что сравнительный филогенетический анализ VP2 последовательностей в серотипах показывает степень гомологии, однако имеется достаточно естественная изменчивость в различиях вирусных линий в одном серотипе. BTV серотип контролируется в первую очередь вирусным внешним капсидным протеином VP2, кодируемым геномным сегментом 2. Предусматривается, что анализ последовательностей сегмента 2 может использоваться не только для идентификации вирусного серотипа, а также посредством сравнения последовательности исходных штаммов для идентификации происхождения отдельных вирусных штаммов.

Преимущественно в воплощениях, включающих, по меньшей мере, один эпитоп, присутствующий в, или экспрессирующийся посредством вектора или векторов в, композициях или вакцинах изобретения, эпитоп или эпитопы из VP2, VP5 или их комбинаций, и эпитоп или эпитопы могут быть из различных штаммов или изолятов. В этой связи необходимо указать, что один может локализовываться или эпитопы картирования в BTV антигенах или иммуногенах, такие как VP5 протеин; см., напр., (Martinez-Torrecuadrada, Langeveld et al. 1999) и (Wang, Du Plessis et al. 1995), VP2 протеин (Heidner, Rossitto et al. 1990; Rossitto and MacLachlan 1992; DeMaula, Bonneau et al. 2000) и VP1 протеин (Huang, Hwang et al. 1995).

Также, как здесь указано, изобретение относится к способам применения векторов, иммунологических композиций и вакцин, включая иммунизацию и вакцинацию против этого вируса, экспрессию полипептидов, кодируемых полинуклеотидом(ами), и способам применения продуктов экспрессии в анализах или для получения антител, использующихся в анализах, а также к способам приготовления полинуклеотида(ов), векторов, композиций, вакцин, анализов, inter alia.

Настоящее изобретение, таким образом, относится к способам профилактики и/или борьбы с заболеваниями, вызванными BTV, так как снижаются или прекращаются клинические симптомы, и/или виремия, и/или очаги повреждения.

Изобретение относится к таким иммуногенным и вакцинным композициям, которые пригодны для использования у различных животных (мишеневых или хозяев) видов, восприимчивых к заболеванию, вызванному BTV, включая, но не ограничиваясь, млекопитающих, рептилий, птиц, в особенности людей, парных млекопитающих или животных, таких как, но не ограничиваясь, собак, кошек, лошадей, млекопитающих из зоопарков или животных, таких как морские млекопитающие, напр., тюлени, кошки, лошади, зоопарковые рептилии, такие как змеи, крокодилы, аллигаторы, и птичьи виды.

Изобретение дополнительно относится к способам иммунизации и вакцинации, включающим иммуногенные и вакцинные композиции, для мишеневых или хозяйских видов. И в этом аспекте изобретения упоминается, что относительно диких или неодомашненных животных, таких как, но не ограничиваясь, дикие или неодомашненные птицы или млекопитающие, композиции, содержащие один или более векторов, которые экспрессируют один или более BTV эпитопов, или антигенов, или иммуногенов, могут доставляться посредством пищи, напр., каплей для приманки, или пищи для млекопитающих или птиц, оставленной для потребления дикими или неодомашненными птицами или млекопитающими, которая включает или содержит один или более векторов, так, они могут быть введены им перорально путем потребления млекопитающими или птицами пищи. Этот путь введения может быть выгодным, когда один или более векторов представляет один или более вирус оспы, напр., вирус оспы птиц, такой как ослабленный вирус оспы канареек, например ALVAC, или ослабленный вирус оспы птиц, например TROVAC, или вакцинный вирус, такой как ослабленный вакцинный вирус, например NYVAC. Таким образом, изобретение предусматривает пероральное или слизистое введение, а также съедобные композиции, которые содержат одно или более векторов изобретения, родственных с вирусом бешенства MERIAL, продукта RABORAL™. Из данного описания и уровня техники следует, что квалифицированный специалист может составить съедобную пищу для птиц или млекопитающих, которая содержит пригодную дозу одного или более векторов изобретения. Кроме того, изобретение охватывает местное введение композиций, содержащих векторы, см., напр., Патент США №6,348,450 относительно местного введения векторных композиций, и устройства для местного введения композиций диким или неодомашненным животным, см., напр., WO01/95715, Заявка США №10/374,627, поданная 26 февраля 2003, для таких устройств для грызунов и птиц; каждый из которых, вместе с каждым документом, цитированным или приведенным здесь, как с каждым документом, процитированным здесь, и каждым документом, указанным здесь или цитированным в каждом документе, объединены здесь посредством ссылки.

Изобретение дополнительно относится к устройствам и способам, которые делают возможным проведение дифференциальной диагностики, напр., способам, которые делают возможным осуществление, или позволяют провести, различий между животным, инфицированным патогенным BTV, и животным, которому ввели вакцину или иммуногенную композицию изобретения.

В дополнение к полинуклеотиду, кодирующему VP2 и VP5, экспрессирующие векторы изобретения могут содержать один или более других полинуклеотидов, кодирующих другие протеины BTV, предпочтительно структурные протеины BTV и указанные последовательности предпочтительно выбираются из тех, которые кодируют структурные вирусные протеины.

Вектор предпочтительно содержит полинуклеотид, кодирующий участки, соответствующие, напр., VP2, VP5, или преимущественно VP2 и VP5, или их эпитопам; а именно экспрессия множества протеинов или их эпитопов считается выгодной. Вектор, содержащий несколько отдельных полинуклеотидов, кодирующих различные протеины (напр., VP2 и/или VP5 или их эпитопы), также входит в объем настоящего изобретения. Вектор, особенно для in vivo экспрессии, может также содержать полинуклеотиды, соответствующие более чем одному BTV серотипу, штамму или изоляту, например два или более полинуклеотидов, кодирующих VP2 или VP5, или их эпитоп(ы), различных штаммов. Из всех различных серотипов, таких как, но не ограничиваясь, серотипы 1, 2, 4, 9, 10, 11, 13, 16 и 17.

Аналогично, иммуногенная или вакцинная композиция может содержать один или более векторов для экспрессии полинуклеотидов, соответствующих более одному BTV серотипу, штамму или изоляту, например два или более полинуклеотидов, кодирующих VP2 или VP5, или их эпитоп(ы), различных штаммов. Вектор, в особенности для экспрессии in vivo, может дополнительно содержать одну или более нуклеотидных последовательностей, кодирующих иммуногены других патогенных агентов и/или цитокинов.

Термин полинуклеотид, кодирующий протеин BTV, главным образом означает фрагмент ДНК или изолированную молекулу ДНК, кодирующую указанный протеин, или комплементарный штамм; однако РНК не исключается, поскольку, как известно из уровня техники, что тимидин (Т) в ДНК последовательности рассматривается как эквивалентный урацилу (U) в РНК последовательности. Таким образом, РНК последовательности для использования в изобретении, напр., для использования в РНК векторах, могут быть получены из ДНК последовательностей, посредством того, что тимидин (Т) в ДНК последовательности считается эквивалентным урацилу (U) в РНК последовательности.

Термин протеин включает пептиды и полипептиды. Фрагмент протеина является иммунологически активным в смысле, что однажды введенный хозяину является способным вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленный против протеина. Предпочтительно, фрагмент протеина является таким, что он имеет по существу аналогичную иммунологическую активность, как и общий протеин. Таким образом, фрагмент протеина изобретения содержит или состоит преимущественно из или включает, по меньшей мере, один эпитоп или антигенную детерминанту. Термин эпитоп относится к участку протеина, способному вызывать иммунную реакцию гуморального типа (В клетки) и/или клеточного типа (Т клетки).

Таким образом, минимальной структурой полинуклеотида является такая, которая содержит или состоит преимущественно из или включает нуклеотиды, которые кодируют эпитоп или антигенную детерминанту BTV протеина. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент полного протеина, более преимущественно, содержит или состоит преимущественно из или включает минимум 21 нуклеотид, преимущественно, по меньшей мере, 42 нуклеотида, и предпочтительно, по меньшей мере, 57, 87 или 150 последовательных или соседних нуклеотидов последовательности, кодирующей полный протеин или полипротеин. Как указывалось ранее, процедуры определения эпитопов, такие как сконструированные библиотеки перекрывающихся пептидов (Hemmer, Pinilla et al. 1998), Pepscan (Geysen, Meloen et al. 1984); (Geysen, Barteling et al. 1985); (Van der Zee, Van Eden et al. 1989); (Geysen 1990); Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot and Rothman 1999), могут использоваться в практической части изобретения, без проведения дополнительного эксперимента. Другие документы, цитированные здесь, могут также быть консультативными относительно способов определения эпитопов иммуногена или антигена и, таким образом, молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют такие эпитопы.

Элементы для экспрессии полинуклеотида или полинуклеотидов преимущественно присутствуют в векторе изобретения. Минимальным образом он содержит, состоит преимущественно из или включает стартовый кодон (ATG), стоп-кодон и промотор и необязательно также последовательность полиаденилирования для определенных векторов, таких как плазмида, и определенных вирусных векторов, напр., вирусных векторов, других, чем вирус оспы. Если полинуклеотид кодирует фрагмент протеина, напр., преимущественно, в векторе, ATG помещается на 5' рамки считывания и стоп-кодон помещается на 3'. Могут присутствовать и другие элементы для контролирования экспрессии, так