Микроорганизм-носитель нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигены и белковые токсины

Микроорганизм-носитель нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигены и белковые токсины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к микроорганизмам как носителям гетерогенных нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигены и белковые токсины, способу их получения, а также соответствующим плазмидам или векторам экспрессии. Данные микроорганизмы можно использовать как лекарственные средства, в частности, как противоопухолевые вакцины для лечения различных опухолей.

Уровень техники

Иммунотерапия рака дает многообещающую возможность лечения опухолей. Множество клинических исследований с использованием различных подходов сосредоточивается на ее эффективности у пациентов. В принципе показано различие между пассивной и активной иммунотерапией.

Активная иммунотерапия направлена на индукцию связанного с вакциной опухолеспецифического иммунного ответа. Последний в настоящее время исследуют в клинических условиях с использованием ряда различных подходов. Например, имеются так называемые цельноклеточные вакцины, исходным материалом для которых являются опухолевые клетки, которые либо получают непосредственно от пациента (аутологичные) или выделяют из соответствующих клеточных линий (гетерологичные). Затем данные клетки, как правило, инактивируют, дифференцированно проводят манипуляции и вводят (обратно вводят) пациенту.

Напротив, антигенспецифические вакцины включают один или более опухолеспецифических антигенов, частей антигенов или ДНК, кодирующую специфический антиген, а также так называемые антиидиотипические вакцины. Обычно данные вакцины не являются выделенными, но их инъецируют в комбинации с подходящим носителем. Следовательно, с одной стороны, используют различные классические адъюванты, но также используют комбинации с биологическими иммуностимуляторами, такими как цитокины.

С целью иммуностимуляции используют подходы, которые включают антиген-ассоциированные иммуностимуляторы, такие как столбнячный токсин. Более того, имеются попытки использования антигенов в комбинации с дендритными клетками. И, наконец, имеется ряд попыток использования рекомбинантных живых вакцин с вирусными или бактериальными носителями.

Слитые белки бактериальных токсинов, такие как столбнячный токсин, шига-токсин, летальный токсин или холерный токсин, в качестве адъювантов с антигеном используют как вакцины, особенно противоинфекционные, уже давно (см. статью Freytag и Clements, 1999). Кроме того, нативные токсины, часто слитые со специфической в отношении клетки молекулой-мишенью, такой как молекула клеточной поверхности опухолевых клеток, также используют с целью разрушения клеток-мишеней.

В таком случае, слитые белки с нативным токсином, который, как правило, включает ферментную группу и белок-связывающий домен, проявляют свой оптимальный эффект при использовании в качестве вспомогательных лекарственных веществ (см. статью Freytag и Clements, 1999). С помощью данных вакцин получают удовлетворительный иммунный ответ даже после иммунизации через слизистые и особенно после пероральной иммунизации. Сложности с данными слитыми белками заключаются в том, что нативные токсины являются высокотоксичными и, вследствие этого, не могут быть использованы для человека (см. статью Holmgren et al., 2005).

Целое направление исследований, таким образом, занимается детоксификацией токсинов, которые в то же время сохраняют эффект в качестве вспомогательных лекарственных веществ. Однако, поскольку в большинстве случаев данный эффект совпадает с ферментной активностью, которая ответственна за токсический эффект (см. статью Lycke et al., 1992), детоксификация не может быть проведена прямым путем, даже если это представляется возможным для некоторых токсинов, которые не теряют своей ферментной адъювантной активности (см. статьи Hormozi et al., 1999; Lycke et al., 1992).

В случае холерного токсина (СТ) предпринят ряд попыток детоксификации (см. статьи Agren et al., 1999; Byun et al., 2001; Eriksson et al., 2004; Kweon et al., 2002; Sanchez et al., 2002), в которых, однако, преобладает использование вспомогательного лекарственного вещества для слизистых (см. работу Freytag и Clements). Вследствие этого главным образом эффективная индукция ответа антител (в основном IgA слизистых), которые получают усиленную связанную с токсином поддержку Т-клеток с рестрикцией МНС (главного комплекса гистосовместимости) класса II, является основным предварительным условием для вспомогательного лекарственного средства для слизистых для вакцины, которая состоит из белка-антигена и слитого или совместно используемого токсина (см. статью Freytag и Clements).

Что касается холерного токсина, особенно его В-субъединицы (CtxB), то его тестируют как адъювант, поскольку он является ответственным за связывание с рецептором GM-1 и не проявляет токсических эффектов, будучи выделенным (см. статью Holmgren et al.). Слияния белка с CtxB характеризуются в основном индукцией так называемых Th2 иммунных ответов. Они представляют собой Т-клеточные ответы, которые главным образом характеризуются цитокинами, такими как ИЛ-4 или ИЛ-6, и которые в основном вызывают индукцию антител, но которые совсем не инициируют или наиболее ограниченно инициируют клеточный иммунный ответ, в частности, цитотоксических Т-клеток (CTL) (см. статью Holmgren et al.).

Кроме того, CtxB в качестве адъюванта для слизистых индуцирует системную толерантность к белку-антигену. Системная толерантность описывает истощение или инактивацию антиген-специфических лимфоцитов, в частности, Т-клеток или В-клеток. Подход данного типа, вследствие этого, неприменим для индукции системного иммунного ответа (см. статью Holmgren et al.).

В противоположность применению на слизистых внутрибрюшинное или подкожное применение слитого белка токсин-антиген способно индуцировать системный, а также низкий цитотоксический ответы. Это в действительности используют для противоопухолевой вакцинации в модельных системах (см., например, работу (Becerra et al., 2003)). Однако данный ответ также получают с самим очищенным антигеном и главным образом в зависимости от используемого адъюванта. За исключением того факта, что измеренные ответы CTL на модели являются очень низкими, отсутствуют доказательства того, что защита в той же мере зависит от данных эффектов. Более того, антиген не применяют перорально, но только путем прямой инъекции (s.c. (подкожной), i.d. (внутрикожно), i.m. (внутримышечно), i.p. (внутрибрюшинно)) антигена.

Антигенные белки, слитые с детоксифицированным токсином, как правило, неэффективны при применении в качестве противоопухолевой вакцины. Основными причинами являются, если они вообще имеются, лишь низкая индукция системного иммунного ответа или даже, в случае CtxB, индукция системной толерантности, а также индукция ограниченных слизистой антител и иммунных ответов типа Th2.

В статье McSorley et al., например, показано, что назальная иммунизация слитым белком CtxB-антиген (который для противоопухолевой вакцины представляет предпочтительный путь индукции системного ответа) предпочтительно переносится и, вследствие этого, инактивирует Th1-клетки, тогда как Th2-клетки не подвергаются воздействию (см. статью McSorley et al., 1998). Ответы Th2 характеризуются Т-хелперными клетками, которые преимущественно продуцируют ИЛ-4 или ИЛ-6. Данные цитокины особенно ответственны за инициацию продукции антител В-клетками, которые обеспечивают защиту в случае самых распространенных вакцин. Напротив, Т-клетки Th1 в основном секретируют ИЛ-2 и ИФН-γ соответственно цитокины, которые играют роль в клеточном иммунном ответе. В зависимости от цели стратегии иммунизации имеет большое значение, инициируется ли вызываемый антителами иммунный ответ Th2 (так называемый сдвиг Th2) или вызываемый клетками ответ Th1 (так называемый сдвиг Th1).

Напротив, системная индукция Th1-доминирующего клеточного иммунного ответа с помощью ИФН-γ, дающая Т-клетки хелперы, и индукция цитотоксических Т-клеток (CTL) является необходимой для иммунотерапии опухолей.

Предшествующий уровень техники показывает, что токсины могут действовать как адъюванты. В частности, холерный токсин (СТ) показывает сильный адъювантный эффект. Однако данный эффект существенно ослабляется, как только токсин детоксифицируют. Что касается его субъединицы CtxB, пероральное применение даже индуцирует системную толерантность. Данной проблемы можно частично избежать путем назального применения. Однако если используют назальное введение, возникают другие проблемы, в частности, такие как ассоциированные с субъединицей CtxB, затрагивающие экспрессию рецептора GM-1 в головном мозге (см. статью van Ginkel et al., 2000), которые выражаются в повышенном риске развития определенных тяжелых побочных эффектов (см. статью Mutsch et al., 2004).

Для преодоления данных проблем возможно генерировать рекомбинантные живые вакцины, которые соэкспрессируют токсины и (гетерологичные) антигены. Данная возможность уже рассматривалась в связи с противоинфекционными вакцинами, т.е. вакцинами, которые направлены на специфический патоген, например на возбудитель туберкулеза, и предназначены для индукции иммунитета против данного патогена.

В процессе разработки данных противоинфекционных вакцин уже получены рекомбинантные токсины, слитые с соответствующими (гетерологичными) антигенами, с использованием ряда рекомбинантных бактериальных штаммов, которые вводят перорально как в случае живой, так и инактивированной вакцины. В большинстве случаев генерированные штаммы экспрессируют только рекомбинантный токсин. Вследствие этого данные подходы в основном направлены на иммунизацию исключительно против самого токсина (индукцию ответа антител) и, следовательно, штамма, экспрессирующего токсина (патогена). Данные типы вакцин непригодны для применения в качестве потенциальных противоопухолевых вакцин при лечении опухолей и неудивительно, что в соответствующих испытаниях не упоминают о какой-либо возможности данного применения (см. статью Reveneau et al., 2002), (см. статью Vertiev et al., 2001), (см. статьи Freytag и Clements, 1999; Jackson et al., 1996).

Что касается данных противоинфекционных вакцин, в процессе индукции ответа антител токсин не работает как адъювант, в данном случае преобладает индукция иммунного ответа антител слизистых. Данные испытания противоинфекционных вакцин не включают или включают только очень слабый системный иммунный ответ. В противоположность противоопухолевым вакцинам данные вакцины не осуществляют индукцию клеточного иммунного ответа, особенно цитотоксических Т-клеток. Бактериальные патогены, экспрессирующие токсин, обычно относятся к внеклеточному живому типу и, вследствие этого, не участвуют в активации CTL, т.е. защита, представляемая данными противоинфекционными вакцинами, является CTL-независимой.

В упомянутых испытаниях вакцин использованы следующие бактериальные штаммы: рекомбинантные Lactobacilli (см. статью Reveneau et al., 2002), Listeria (см. статью Vertiev et al., 2001), Bacillus anthracis (см. статьи Mendelson et al., 2005; Mesnage et al., 1999), Shigellae (см. статьи Andersen et al., 2000; Tzschaschel et al., 1996b), E. coli (см. статью Walker et al., 1992), Vibrio (см. статьи Butterton et al., 1995; Chen et al., 1998; Thungapathra et al., 1999) и Salmonella (см. статью Jackson et al., 1996).

Кроме того, пытались усилить иммунные ответы слизистых путем поверхностной презентации (см. статью Konieczny et al., 2000) или секреции токсина в качестве гетерологичного антигена (Salmonella, Shigellae (см. статьи Garmory et al., 2003; Orr et al., 1999; Su et al., 1992; Tzschaschel et al., 1996a; Tzschaschel et al., 1996b), Yersinia (см. статью Sory и Cornelis, 1990), Vibrio (cm. статью Ryan et al., 1997a), E. coli (см. статью Zhu et al., 2006)). Однако в данных дополнительных случаях сами токсины представляют антигены, в отношении которых направлен иммунный ответ.

Таким образом, следует отметить, что токсины не действуют как адъюванты и в описанных исследованиях не планируют экспрессировать токсины в виде слитых белков с дополнительным отдельным (гетерологичным) антигеном. Более того, слитые белки с СТ или CtxB не были генерированы с данными системами, и это не предполагалось.

Следовательно, слитые белки, упомянутые в вышеприведенных документах, представляют собой слитые белки пептидного сигнала секреции, такого как HlyA, и белка токсина, а не слитые белки, состоящие из токсина и (гетерологичного) антигена.

Главной целью данных исследований является просто получить оптимальный иммунный ответ слизистых (см. статью Tzschaschel et al., 1996a). Индукцией системного иммунного ответа не занимаются. До настоящего времени, если сравнивать в целом, анализы системных иммунных ответов были ограничены только антителами (в частности, системными IgA), поскольку защита в моделях данного типа главным образом опосредуемая антителами (ср., например, [31]). Индукция системного клеточного иммунного ответа, в частности ответа цитолитических Т-клеток, не описана. Слияние с сигналом секреции в основном использовали для повышения растворимости токсинов и повышения их стабильности соответственно, поскольку сильная абсолютная цитоплазматическая экспрессия часто приводит в результате к продукции нерастворимых агрегатов (см. статью Gentschev et al., 2002a).

В данном аспекте ряд авторов обращает внимание на то, что белки с сигналом секреции вызывают быстрое цитоплазматическое разложение (см. статью Tzschaschel et al., 1996a), тогда как другие наблюдают стабилизацию (см. статью Orr et al., 1999). Предшествующий уровень техники, следовательно, в данном случае имеет противоречия. До настоящего времени предшествующие эксперименты с секретируемыми токсинами (токсин + сигнал секреции), прежде всего, направлены на повышение стабильности, которая очевидным образом не достигается во всех случаях.

Одна причина безусловно обнаружена в изменяющейся интенсивности экспрессии и стабильности плазмид. В статье Tzschaschel et al. описано, что используемая плазмидная система высоко нестабильна и, кроме того, без селекции просто найдена в нескольких бактериях. В качестве возможного решения авторы используют хромосомную интеграцию посредством минитранспозона (см. статьи Tzschaschel et al., 1996a; Tzschaschel et al., 1996b).

Однако данная система имеет ряд недостатков. С одной стороны, точка интеграции не определена, что может привести к нежелательному фенотипическому изменению штамма-хозяина (например, повышенной/пониженной экспрессии фланкирующих генов). С другой стороны, ожидаемый уровень экспрессии при использовании одной геномной копии только низкий, что оказывает отрицательное воздействие на иммуногенность. Кроме прочего, хромосомная интеграция транспозона относительно нестабильна, поскольку она очень часто приводит к спонтанным эксцизиям по сторонам повторяющихся элементов.

Как отмечено выше, предшествующий уровень техники является противоречивым в отношении стабильности секретируемого гетерологичного токсина.

В статье Garmory et al. даже предполагают, что секреция гетерологичного антигена не обладает каким-либо особенным преимуществом в отношении иммуногенности (см. статьи Garmory et al., 2002; Roland et al., 2005). В других случаях повышенный системный ответ антител на секретируемый токсин после внутривенного введения в действительности наблюдают, но не после перорального введения. Напротив, пероральное введение, пусть даже косвенно, является частью проблемы (см. статью Roland et al., 2005).

В конечном счете исследования с грамположительным штаммом (Lactobacillus plantarum), который продуцирует столбнячный токсин, не показывают существенных различий в индукции системного ответа антител по сравнению со штаммами, которые секретируют токсин, присутствует ли он в связанном с их мембраной виде, или они содержат токсин в цитоплазме (см. статью Reveneau et al., 2002).

Системные клеточные иммунные ответы, в частности ответы цитотоксических Т-клеток, и полученная в результате защита не исследованы и не описаны.

Таким образом, на основании вышеприведенных данных по предшествующему уровню техники, касающихся противоинфекционных вакцин на основе токсинов, нельзя утверждать, представляет ли секреция токсина, используемого в качестве адъюванта, преимущество в плане индукции системного (клеточного) иммунного ответа. Напротив, вышеприведенные исследования скорее указывают на проблему стабильности и отмечают потерю положительного эффекта секретируемого гетерологичного токсина. Слитые белки, состоящие из сигнала, токсина и гетерологичного антигена, совсем не описаны или не предполагаются.

В вышеприведенных абзацах представлен предшествующий уровень техники, который описывает бактериальные носители, которые гетерологично экспрессируют токсины и могут быть использованы в качестве противоинфекционных вакцин. В приведенных примерах осуществлены в основном модификации, касающиеся экспрессии или стабильности токсинов и их растворимости, например инсерция сильного экспрессирующего промотора или слияния токсина с сигналом секреции.

Другие авторы получают также исследованные генетические слияния токсинов с гетерологичными антигенами в живых вакцинах. В данных случаях токсин в основном используют в качестве адъюванта. В ряде случаев (например, см. статью Brassier et al., 2000) гетерологичный антиген действует как адъювант, а токсин как подходящий антиген.

Однако важно отметить, что в упомянутых случаях экспрессия конструкции слитых генов токсина-антигена происходит исключительно цитоплазматически или периплазматически. Конструкция токсин-антиген не слита с дополнительным сигналом секреции (который может привести к его полной секреции) и не секретируется непосредственно.

В процессе получения данных конструкций слитых генов токсина-антигена используют рекомбинантную Е. coli (см. статью Clemens et al., 2004), Bacillus anthracis (см. статью Brassier et al., 2000), Shigella (см. статьи Koprowski et al., 2000; Ranallo et al., 2005; Zheng et al., 2005) и штаммы Vibrio (см. статью Silva et al., 2003). Для Salmonella (см. обзор в статье (Garmory et al., 2002)) описаны также слияния вариантов СТ с антигенами (см. статьи Hajishengallis et al., 1996; Huang et al., 2000) или других токсинов с антигенами (см. статьи Barry et al., 1996; Cardenas и Clements, 1993; Chabalgoity et al., 1997; Chabalgoity et al., 1996; Chabalgoity et al., 2000; Chabalgoity et al., 1995; Chacon et al., 1996; Jagusztyn-Krynicka et al., 1993; Khan et al., 1994a; Khan et al., 1994b; Lee et al., 2000; Pogonka et al., 2003; Schodel et al., 1990; Smerdou et al., 1996; Ward et al., 1999; Wu et al., 2000).

В большинстве данных случаев основное внимание сосредоточено на индукции иммунного ответа слизистых (антител), и для индукции системного иммунного ответа выбирают только подкожное, но не пероральное применение [36].

Несколько работ с Salmonella в качестве поддерживающего штамма ограничены простой характеризацией штамма (см. статьи Gomez-Duarte et al., 1995; Jagusztyn-Krynicka et al., 1993), в других только анализируют ответ антител слизистых и/или системный ответ антител и/или защиту (см. статьи Barry et al., 1996; Cardenas и Clements, 1993; Dunstan et al., 2003; Hajishengallis et al., 1996; Harokopakis et al., 1997; Khan et al., 1994a; Khan et al., 1994b; Pogonka et al., 2003; Smerdou et al., 1996; Somner et al., 1999). Во всех данных случаях, где попутно используют слияние антигена и столбнячного токсина и которые используют исключительно в качестве противоинфекционных вакцин, системные клеточные иммунные ответы, особенно ответы цитотоксических Т-клеток, не изучали.

Вследствие этого, с иммунологической точки зрения из данных исследований нельзя сделать никаких заключений относительно потенциального применения в качестве противоопухолевой вакцины, поскольку они сосредоточены на опосредованных антителами эффектах в качестве противоинфекционных вакцин.

Исследования, которые включают анализ изотипа исследуемого иммунного ответа, по-видимому, являются более подходящими. В действительности в данных случаях непосредственно измеряют клеточные иммунные ответы, но изотипический профиль ответа антител позволяет сделать заключение относительно сдвига Th1/Th2 иммунного ответа. Изотипы антител, подобных lgGI, связаны с ответами Th2, и изотипы, подобные lgG2a, ассоциированы с ответами TM. Как уже отмечали, ответы ТМ представляют собой преобладающие клеточные иммунные ответы, тогда как ответы Th2 в основном представляют гуморальные ответы, направляемые антителами. Кроме того, в данных исследованиях не описывают противоопухолевые вакцины, и в них не предполагают какого-либо применения противоопухолевого агента.

Одно исследование противоинфекционной вакцины на основе Salmonella в качестве носителя, которая экспрессирует слитый белок столбнячного токсина и антигена, осуществлено на собаках. Низкие уровни ответов антител, которые индуцированы у собак, показывают сдвиг ТМ, касающийся профиля антител, следовательно, ответа, который сильно коррелирует с иммунным ответом клеточного типа (см. статью Chabalgoity et al., 2000). Надо отметить, что иммунология собак недостаточно изучена и, вследствие этого, неясно, в какой степени профиль антител собаки может дать информацию относительно сдвига Th1.

Исследования на мышах, проведенные той же группой с использованием сравнимых конструкций, показали тем не менее профиль антител с одинаковым уровнем для lgG1, что для lgG2a, что будет указывать на смешанный ответ Th1/Th2.

Интересно, что имеющийся иммунитет к столбнячному токсину, который обнаружен у большинства людей вследствие предшествующих иммунизации, вызывает иную относительно сильную индукцию lgG1, тогда как lgG2a почти не индуцируется. Это ясно указывает на другое соотношение Th2 (см. статью Chabalgoity et al., 1995). По данной причине живая вакцина на основе столбнячного токсина в качестве противоопухолевой вакцины является очень вредной для использования на человеке. Вследствие этого можно ожидать, что сильный вызываемый антителами ответ Th2 индуцируется у большинства данных пациентов, которые демонстрируют специфический ответ на столбнячный токсин.

Только в некоторых исследованиях также анализируют клеточный иммунный ответ и сравнивают генетические конструкции со слитым токсином и без него. В одном случае, например, слияние антигена со столбнячным токсином и без него сравнивают на Salmonella (см. статью Lee et al.). В данном случае слитая конструкция столбнячного токсина и антигена главным образом повышает общий уровень антител, тогда как профиль Th1/Th2 мало изменяется. Даже антиген-специфическая секреция Т-клетками CD4+ типичных цитокинов Th1, таких как ИФН-γ и ИЛ-2 соответственно, показывает только слабое отклонение. В более раннем исследовании той же группы измеряют также уровни ИФН-γ. Однако не представлено никакого сравнения с конструкциями без столбнячного токсина (см. статью Chabalgoity et al.). В других исследованиях с различными грамположительными бактериальными носителями, подобными Shigella (см. статьи Koprowski et al., Ranallo et al., Zheng et al.) или Vibrio (см. статьи Campos et al., Ryan et al.), не анализируют ни изотипы, ни клеточные иммунные ответы. Подводя итоги, можно утверждать, что упомянутые исследования ясно сосредоточены на индукции направляемого антителами гуморального иммунного ответа. В действительности используют генетические конструкции токсина и антигена, но они не имеют сигнала секреции и они непосредственно не секретируются. Однако ни при каких условиях не анализировали системные клеточные иммунные ответы, в частности ответы цитотоксических Т-клеток. К тому же данные клеточные ответы цитотоксических Т-клеток не могут быть выведены из гуморального ответа антител и не могут быть определены, если ответ антител включает Th1/Th2.

Однако, это именно те клеточные иммунные ответы цитотоксических Т-клеток, которые важны для использования в лечении путем противоопухолевой вакцинации.

Тем не менее, в плане слияний токсин-антиген, которые ограничены только противоинфекционными вакцинами для слизистых, состояние уровня техники не допускает никакого утверждения относительно возможного использования каких-либо данных конструкций в качестве противоопухолевых вакцин.

Как уже отмечено, экспрессию генетических слитых конструкций осуществляют без помощи системы секреции. Токсины и конструкции токсин-антиген, соответственно, как правило, расположены цитоплазматически, а также периплазматически, т.е. между двумя мембранами. Для индукции эффективного клеточного иммунного ответа токсин должен быть свободно доступен для антиген-презентирующей клетки (АРС). Как правило, нативный токсин продуцируется в периплазме грамотрицательных бактерий. Это достаточно для полных иммунных ответов слизистых, поскольку периплазматические токсины могут выйти из периплазмы в толстой кишке и, следовательно, также являются доступными (см. статью Hunt и Hardy, 1991). Однако это не принимают во внимание, если носитель направлен на антигенпрезентирующие клетки вне толстой кишки, такие как, например, пейеровы бляшки или лимфатические органы, такие как лимфатические узлы или селезенка.

В принципе, два фактора являются важными в плане эффективности противоопухолевой вакцины: индукция клеточного иммунного ответа Th1-типа и участие компонентов врожденной иммунной системы, таких как NK-клетки, NKT-клетки и γ-δ Т-клетки, которые играют важную роль в плане эффективности противоопухолевой терапии (см. статью Dunn et al., 2004).

Важность данных компонентов врожденных иммунных систем лежит на множестве уровней. Должным образом активированные NK- и γ-δ Т-клетки способны локально продуцировать большие количества ИФН-γ. Данный интерферон, который также продуцируется специфическими Th1-поляризованными Т-клетками, имеет множество функций, относящихся к терапии опухолей. Одной из его главных функций является ингибирование ангиогенеза, которое перекрывает снабжение опухоли кислородом и питательными веществами и приводит фактически к голоданию опухоли. Кроме того, NK-клетки имеют рецепторы, которые распознают молекулы МНС класса I. Если данные молекулы присутствуют на клетке, NK-клетки ингибируются.

Что касается вакцины, которая индуцирует специфические цитотоксические Т-клетки, то опухолевые клетки могут быть уничтожены данными CTL. Если опухолевая клетка теряет свою способность экспрессировать молекулы МНС класса I, что очень часто имеет место в опухолях, специфические цитотоксические Т-клетки неэффективны. Вследствие этого в данном случае ингибирование NK-клеток прекращается, и они способны непосредственно элиминировать опухолевые клетки.

Следовательно было бы идеальным, если бы противоопухолевая вакцина эффективно индуцировала оба компонента. Имеются противоречивые данные относительно сдвига Th1-Th2 слитого токсина-адъюванта. Как обсуждалось ранее, слитые конструкции токсин-антиген, используемые в выделенном виде, очевидным образом индуцируют сильный Th2-поляризованный иммунный ответ. Ряд авторов, кроме того, описывает низкий уровень сдвига для живых носителей; другие авторы отмечают небольшой Th1-сдвиг.

Однако данные результаты снова основаны исключительно на несекретируемых конструкциях. Индукцию врожденного иммунитета с помощью данных типов противоинфекционных вакцин никогда не сравнивали и не предусматривали.

Как уже отмечено, главная причина состоит в том, что имеющиеся вакцины представляют собой противоинфекционные вакцины для слизистых, а не противоопухолевые вакцины. Вследствие этого индукция Th1-иммунных ответов, иммунных ответов CTL и ответов врожденной иммунной системы не были в центре внимания. Напротив, что касается противоопухолевых вакцин, индукция данных иммунных ответов обязательна.

Интересно, что в биологии клетки нативные токсины обычно используют как ингибиторы путей передачи сигнала. Так, среди прочего показано, что нативный токсин коклюша, но не холерный токсин, способен ингибировать определенный тип апоптоза NK-клеток (см. статью Ramirez et al., 1994). Другое научное исследование способно показать, что холерный токсин, но не его В-субъединица, блокирует специфические функции NK-клеток (см. статью Poggi et al., 1996). Нативный токсин коклюша используют для ингибирования хемотаксиса лимфоцитов (см. статью Spangrude et al., 1985). Даже если данные исследования не относятся к противоопухолевой вакцинации, компетентный специалист в области техники мог бы сделать заключение о том, что использование токсинов в качестве противоопухолевых вакцин было бы вредным, поскольку ответ врожденной иммунной системы, важный для терапии опухолей, более ингибируется, чем индуцируется.

Другие научные исследования способны показать, что токсины, подобные нативному токсину коклюша (не инактивированному токсину коклюша), эффективно индуцируют компоненты врожденной иммунной системы. Касательно иммунотерапии опухолей это будет означать, что если их вообще будут использовать, то следует использовать нативные токсины. Однако по причинам токсичности данный тип введения недопустим. Кроме того, данная индукция неизбежно приводила бы к Тh2-направляемому вторичному иммунному ответу, который в свою очередь будет вредным для лечения опухолей (см. статью Boyd et al., 2005). Следовательно, касательно индукции врожденного иммунного ответа, в предшествующем уровне техники не описана и не предусмотрена противоопухолевая вакцинация. Напротив, критический анализ литературы даже мешает использованию токсинов при лечении опухолей.

Интересным, тем не менее, является анализ синергического эффекта токсинов или их субъединиц с другими стимуляторами, такими как иммуностимулирующие олигонуклеотиды ДНК с гипометилированными мотивами CpG (CpG ODN) (см. статью Holmgren et al., 2005) или липосахариды (LPS). В случае LPS в основном индукция моноцитов, по-видимому, повышается главным образом посредством В-субъединицы токсинов, тогда как она ингибируется токсином в целом (голотоксином) (см. статью Hajishengallis et al., 2004). Однако данные исследования основаны исключительно на использовании очищенных слитых конструкций токсин-антиген, к которым добавляют субстанции, подобные LPS или CpG в качестве адъювантов. Кроме того, анализ в данном случае проводят только на макрофагах, которые индуцируют адаптивный иммунный ответ, но непосредственно не действуют на опухоли. Следовательно, данные исследования не имеют существенного значения касательно индукции компонентов врожденной иммунной системы, в частности, NK-клеток, которые могут непосредственно действовать на опухоли.

Другие исследования, однако, показывают, что NK-клетки могут быть активированы и хемотаксически привлечены токсинами, подобными экзотоксину A Pseudomonas aeruginosa (см. статью Muhlen et al., 2004). В зависимости от экспериментальной системы можно также индуцировать Th1-ответы, хотя вследствие этого главным образом происходит супрессия NK-клеток и Th1-ответов (см. статью Michalkiewicz et al., 1999). Тем не менее, данные исследования в основном направлены на анализ гепатотоксичности энтеротоксина А и не относятся к противоопухолевой вакцинации. Интересно, что эффекты являются в высокой степени дозозависимыми, и только незначительное изменение дозы может инвертировать эффекты. Хотя авторы не могли показать, какой ответ эффективно имеет место in vivo. Вследствие этого данные не дают предсказания, какие эффекты могут иметь место, если токсин или даже детоксифицированный токсин используют в качестве адъюванта.

В общем и целом иммунный ответ в сильной степени зависит от используемой конкретной системы. В большинстве случаев противоинфекционая вакцина для слизистых направлена на локальную манипуляцию с иммунной системой в слизистой с целью индукции эффективного иммунного ответа в слизистых (см. статью Lycke, 2005). Однако данные исследования не включают разработку противоопухолевой вакцины. Кроме того, в данных исследованиях отсутствует информация об индукции системных клеточных иммунных ответов, в частности ответов цитотоксических Т-клеток, которые являются основными для противоопухолевой вакцинации.

Уже показано, что секреция гетерологичного антигена дает преимущества системному иммунному ответу (см. статью Hess et al., 1996). Однако описанные секретируемые антигены не являются секретируемыми конструкциями токсин-антиген; токсины или их субъединицы не используют. Достигаемые таким образом иммунные ответы в модели трансгенной опухоли также в высокой степени ограничены (см. статью Gentschev et al., 2005). Действительно, в данном случае могут быть индуцированы слабые ответы антител и цитотоксических Т-клеток, которые частично защищают от развития опухоли. Однако, не только сами иммунные ответы, но и сама защита ограничена. Аналогично в данных исследованиях противоопухолевой вакцинации отсутствует сравнение с несекретируемыми конструкциями. Более того, сравнительные исследования не проводили в контексте противоопухолевой вакцинации (см. статью Hess et al., 1996) и, они противоречат дальнейшим исследованиям, в которых не наблюдают какого-либо преимущества в отношении секреции (см. статьи Garmory et al., 2002; Roland et al., 2005). В итоге и как отмечено ранее, предшествующий уровень техники очень противоречив в плане секреции и в общем и целом не дает никакого намека касательно потенциальных преимуществ секретируемых конструкций токсин-антиген при лечении опухолей. Напротив, критический анализ имеющейся литературы в значительной мере противоречит данному типу применения.

Бактериальные токсины (см. статью Todar, 2002): на химическом уровне существует два типа бактериальных токсинов, липополисахариды, которые связаны с клеточными стенками грамотрицательных бактерий, и белки, которые высвобождаются из бактериальных стенок и могут действовать на тканевые участки, удаленные от области бактериального роста. Связанные с клеткой липополисахаридные (LPS) токсины называют эндотоксинами, и внеклеточные способные к диффузии токсины называют экзотоксинами.

Экзотоксины, как правило, представляют собой растворимые белки, секретируемые живыми бактериями в период экспоненциального роста, но в ряде случаев они высвобождаются путем лизиса бактериальной клетки. Продукция токсина, как правило, специфична в отношении определенных видов бактерий, которые вызывают заболевание, ассоциированное с токсином (например, только Clostridium tetani продуцирует столбнячный токсин; только Corynebacterium diphtheriae продуцирует дифтерийный токсин). Как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии продуцируют растворимые белковые токсины.

В общем имеется три класса белковых (экзо)токсинов: (i) токсины типа I (суперантигены), которые связываются с поверхностью клетки-хозяина и модулируют иммунный ответ, но не транслоцируются в клетку, (ii) токсины типа II (порообразующие токсины), которые действуют на мембрану клетки-хозяина и вызывают вытекание из клетки-хозяина и ее гибель, и (iii) токсины типа III (A-B токсины), которые связываются с клеткой-хозяином посредством специфического рецептора и транслоцируются в клетку, становятся в ней активными и модифицируют белки или другие компоненты клетки-хозяина.

Как показано выше, токсины типа III, действующие внутриклеточно в отношении клеток-хозяев, состоят из двух компонентов: один компонент (субъединица А) отвечает за ферментную активность токсина, другой компонент (субъединица В) участвует в связывании со специфическим рецептором на мембране клетки-хозяина и переносе фермента через мембрану. Ферментный компонент неактивен до тех пор, пока не высвободится из нативного (А+В) токсина. Выделенные А-субъединицы ферментативно активны, но лишены способности связывания и входа в клетку. Выделенные В-субъединицы могут связываться с клетками-мишенями (и даже блокировать связывание нативного токсина), но они нетоксичны.

Существует ряд путей, которыми можно синтезировать и собрать субъединицы токсина: А+В показывает, что токсин синтезирован и секретируется в виде двух отдельных белковых субъединиц, которые взаимодействуют на поверхности клетки-мишени; А-В или А-5В или АВ5 показывает, что А- и В-субъединицы синтезируются раздельно, но связаны нековалентными связями во время секреции и связываются со своей мишенью; 5В ил В5 показывает, что домен связывания белка состоит из 5 идентичных субъединиц. АВ или А/В показывает токсин, синтезированный в виде одного полипептида, разделенного на домены А и В, которые могут быть разделены путем протеолитического расщепления. Примерами токсинов АВ или А/В являются дифтерийный токсин, экзотоксин А, ботулинический токсин и столбнячный токсин. Примерами токсинов А-5В или АВ5 являются холерный токсин и шига-токсин, тогда как токсин сибирской язвы LF и токсин сибирской язвы EF являются примерами токсинов А-В.

Дальнейшие имеющие отношение к делу документы предшествующего уровня техники включают следующие:

Michl et al. описывают использование бактерий и бактериальных токсинов в качестве лечебных факторов для солидных опухолей. Раскрывают слитые конструкции токсин-антиген, а также бактериальную направленность данной конструкции. Исследуют использование дифтерийного токсина (DT), экзотоксина A Pseudomo