Рекомбинантные микроорганизмы, продуцирующие метионин

Рекомбинантные микроорганизмы, продуцирующие метионин

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

Эта заявка заявляет приоритет на основании предварительной патентной заявки США №60/700,699, поданной 18 июля 2005, и предварительной заявки США №60/714,042, поданной 1 сентября 2005, обе озаглавленные «Рекомбинантные микроорганизмы, продуцирующие метионин», полное содержание каждой из которых включено сюда путем ссылки.

Дополнительно, эта заявка является родственной предварительной заявке США №60/700,698, поданной 18 июля 2005, и предварительной заявке США №60/713,907, поданной 1 сентября 2005, обе озаглавленные «Применение диметилдисульфида для продуцирования метионина в микроорганизмах», полное содержание каждой из которых включено сюда путем ссылки.

Эта заявка является также родственной предварительной патентной заявке США №60/700,557, поданной 18 июля 2005, и предварительной заявке США №60/713,905, поданной 1 сентября 2005, обе озаглавленные «Применение гена Bacillus MetI для улучшения продуцирования метионина в микроорганизмах», полное содержание каждой из которых включено сюда путем ссылки.

Полное содержание каждой из этих патентных заявок таким образом определенно включено сюда путем ссылки, включая, без ограничений, их описание, формулу изобретения и реферат, а также их любые рисунки, таблицы или чертежи.

Предшествующий уровень изобретения

Метионин - это аминокислота, используемая во многих областях промышленности, включая, но не ограничиваясь, корма для животных, фармацевтику, пищевые добавки, косметику и добавки к рациону. Метионин можно производить в больших масштабах множеством различных способов. Например, метионин можно производить химически сначала реакцией метилмеркаптана с акролеином, получая промежуточное соединение 3-метилмеркаптопропиональдегид (МРР). Дальнейшая обработка включает реакцию МРР с цианидом водорода, давая 5-(2-метилтиоэтил)гидантоин, который затем гидрализуется при помощи щелочи, такой как NaOH вместе с Na₂CO₃, NH₃ и CO₂. Впоследствии DL-метионин натрия нейтрализуется серной кислотой и Na₂CO₃, давая D, L-метионин, Na₂SO₄ и CO₂. Этот процесс дает большое количество неиспользуемых соединений по сравнению с количеством метионина, что представляет собой экономическую и экологическую проблему.

Дополнительно, ферментация микроорганизмов могла бы также потенциально использоваться для производства метионина в больших масштабах, например, культивированием микроорганизмов с питательными веществами, включая, но не ограничиваясь, источники углеводов, например, сахара, такие как глюкоза, фруктоза или сахароза, гидролизованный крахмал, источники азота, например, аммиак, и источники серы, например, сульфат и/или тиосульфат, наряду с другими необходимыми или дополнительными компонентами среды. Этот процесс давал бы L-метионин и биомассу как побочный продукт без токсически опасных, воспламеняющихся, нестабильных, ядовитых исходных веществ.

Однако существующие процессы дают слишком низкие титр и выход метионина, произведенного с их помощью, чтобы быть коммерчески жизнеспособными. Следовательно, существует необходимость в поиске улучшенных способов производства метионина, которые не давали бы токсические химикаты и вредные побочные продукты, при этом оставаясь коммерчески значимыми.

Было доложено, что высокий уровень производства определенных аминокислот может быть достигнут путем изменения экспрессии всего трех или даже меньше генов и/или белков, кодируемых ими. Например, штамм, продуцирующий 80 г/л лизина, может быть сконструирован просто изменением экспрессии аспартокиназы, пиру-ваткарбоксилазы и гомосериндегидрогеназы (Ohnishi, J. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 58(2):217-223 (2002)).

Сообщается, что изменение экспрессии следующих генов поодиночке или в комбинации с другими генами в бактериях приводит к продуцированию метионина: metF (См. WO/087386 A2, WO 04/024931 А2 и Публикация США №2002049305); metH (См. WO 04/024933 A2 и Публикация США №2002/0048793); metA (См. WO/024932 А2); metK (WO 03/100072 А2); sahH (См. EP 1507008); metY (См. Публикация США №20050064551); metR и/или metZ (См. Публикация США №2002/0102664); metE (Публикация США №20020110877); metD (См. Публикация США №20050074802), cysQ (См. WO 02/42466A2); cysD, cysN, cysK, cysE и cysH (См. WO 02/0086373); и metZ, metC, и rxa 00657 (См. WO 01/66573). Также сообщалось, что получение аналогичных резистентных штаммов, таких, например, как этионин-резистентные штаммы бактерий, продуцирующих аминокислоты, может приводить к производству метионина. (Kumar and Gomes, Biotechnology advances 23: 41-61 (2005)).

Однако поскольку биосинтез метионина включает введение восстановленного атома серы и считается более сложным, чем биосинтез других аминокислот, неясно, какая комбинация измененных генов и/или использование резистентных штаммов потребуется для производства коммерчески привлекательных уровней метионина.

Краткое содержание изобретения

Настоящее изобретение представляет новые и улучшенные способы повышения продуцирования метионина. В частности, изобретение основано, по меньшей мере частично, на открытии, что изменение определенных генов, например, методами генетической инженерии и классической генетики микроорганизмов, например, Corynebacterium glutamicum, обеспечивает повышенное продуцирование метионина.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным микроорганизмам, которые продуцируют повышенные уровни метионина по сравнению с метионином, продуцируемым их аналогами дикого типа, способам получения таких микроорганизмов и способам производства метионина, при которых применяются такие микроорганизмы. В некоторых вариантах осуществления изобретения определенные комбинации измененных генов приводят к повышенному продуцированию метионина, значительно более высокому, чем любой титр, приведенный ранее, например, по меньшей мере, 15 г/л или, по меньшей мере, 16 г/л, или, по меньшей мере, 17 г/л или выше.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, включают генетические изменения в каждом из любых двух или более, или трех или более, или четырех или более, или пяти или более, или шести или более, или семи или более, или восьми или более генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии генов, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии генетических изменений в каждом из любых двух или более, или трех или более, или четырех или более, или пяти или более, или шести или более, или семи или более, или восьми или более генов. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы имеют генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, пяти генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии, по меньшей мере, пяти генов, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии генетических изменений в каждом из, по меньшей мере, пяти генов. Также здесь описаны рекомбинантные микроорганизмы, включающие генетические изменения в каждом из любых шести, или любых семи, или любых восьми генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии генов, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии генетических изменений в каждом из любых шести, или любых семи, или любых восьми генов. Рекомбинантные микроорганизмы могут также включать генетические изменения во всех девяти генах ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии девяти генов, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с про-дуцированием метионина в отсутствии генетических изменений в каждом из девяти генов.

Как здесь описано, повышенная экспрессия может быть достигнута различными способами, включая, но не ограничиваясь, например, увеличение транскрипции/трансляции гена, например, введением промоторных и/или энхансерных последовательностей выше гена, замещение промотора гетерологичным промотором, который увеличивает экспрессию гена или приводит к конститутивной экспрессии гена, увеличение количества копий гена при помощи эписомных плазмид или модификацией последовательности гена, и любые комбинации таких методов, такие что фермент(ы), кодируемые геном, обладают повышенной активностью или повышенной устойчивостью к ингибированию одним или более ингибирующих соединений по сравнению с его аналогом дикого типа. Дополнительно, повышенная экспрессия также может быть достигнута, например, удалением или мутацией гена фактора транскрипции, который в нормальных условиях подавляет экспрессию гена, для которого желательна повышенная экспрессия.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, включают генетические изменения в каждом из любых двух генов, выбранных из mcbR, hsk, metQ, metK и рерСК, где генетические изменения понижают экспрессию любых двух генов и/или активность белка, кодируемого любыми двумя генами (например, ферментативную активность), таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии генетических изменений в каждом из любых двух генов. В других вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, включенные в настоящее изобретение, включают генетические изменения в каждом из любых трех генов, или любых четырех генов, или всех пяти генов, выбранных из mcbR, hsk, metQ, metK и pepCK, где генетические изменения снижают экспрессию любых двух генов и/или активность белка, кодируемого генами, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии генетических изменений в каждом из любых трех генов, или любых четырех генов, или всех пяти генов. При использовании здесь, снижение экспрессии гена может быть достигнуто множеством различных способов, включая, но не ограничиваясь, например, мутацию промотора гена, замещение промотора гена гетерологичным промотором, который уменьшает экспрессию гена, или модификацию последовательности гена, так что он кодирует белок или фермент(ы) со сниженной активностью по сравнению с его аналогом дикого типа. В определенных примерах снижение экспрессии достигается удалением или мутацией последовательности гена, так что белок или фермент продуцируется меньше или вообще не продуцируется. Дополнительно, снижение экспрессии гена может быть достигнуто, например, повышением экспрессии репрессора транскрипции гена.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, включенные в настоящее изобретение, включают генетические изменения в каждом из любых двух генов, или любых трех генов, или любых четырех генов, или любых пяти генов, или любых шести генов, или любых семи генов, или любых восьми генов, или всех девяти генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии каждого из любых двух генов, или любых трех генов, или любых четырех генов, или любых пяти генов, или любых шести генов, или любых семи генов, или любых восьми генов, или девяти генов, в комбинации с генетическими изменениями в каждом из любого одного гена, любых двух генов, или любых трех генов, или любых четырех генов, или пяти генов, выбранных из mcbR, hsk, metQ, metK и рерСК, где генетические изменения снижают экспрессию любого одного гена, любых двух генов, или любых трех генов, или любых четырех генов, или пяти генов, где комбинация приводит к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы включают генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, пяти генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии каждого из, по меньшей мере, пяти генов в комбинации с генетическими изменениями, по меньшей мере, в одном гене, выбранном из mcbR, hsk, metQ, metK и рерСК, таким образом, приводя к сниженной экспрессии, по меньшей мере, одного гена, где микроорганизм продуцирует повышенный уровень метионина по сравнению с метионином, продуцируемым в отсутствии комбинации.

Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, включают генетические изменения в каждом гене, выбранном из группы, состоящей из ask^fbr, hom^fbr, metH, и ask^fbr, hom^fbr metE, таким образом, приводя к повышенной экспрессии каждого гена, в комбинации с генетическими изменениями в каждом из mcbR и hsk, таким образом, приводя к сниженной экспрессии mcbR и hsk, где микроорганизм продуцирует повышенный уровень метионина по сравнению с метионином, продуцируемым в отсутствии комбинации. В других вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы включают генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, шести генов, выбранных из группы, состоящей из ask^fbr, hom^fbr, metX (также называется metA), metY (также называется metZ), metF, metH, metE и ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metF и metE, таким образом, приводя к повышенной экспрессии, по меньшей мере, шести генов, в комбинации с генетическими изменениями в каждом из mcbR и hsk, таким образом, приводя к сниженной экспрессии mcbR и hsk, где микроорганизм продуцирует повышенный уровень метионина по сравнению с метионином, продуцируемым в отсутствии комбинации.

Рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, могут также включать генетические изменения, приводящие к повышенной экспрессии одного или более генов пути биоситеза цистеина. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, включают генетические изменения в каждом из двух или более, или трех или более, или четырех или более, или пяти или более, или шести или более, или семи или более, или восьми или более, или девяти или более, или десяти или более, или одиннадцати или более, или двенадцати или более, или тринадцати или более, или четырнадцати или более, или пятнадцати или более, или шестнадцати или более, или семнадцати или более, или восемнадцати или более, или девятнадцати или более, или двадцати или более, или двадцати одного или более, или двадцати двух или более, или двадцати трех или более, или двадцати четырех или более, или двадцати пяти или более, или двадцати шести или более, или двадцати семи или более, или двадцати восьми или более, или двадцати девяти или более, или тридцати или более, или тридцати одного или более, или тридцати двух или более, или тридцати трех или более, или тридцати четырех генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX (также называется metA), metY (также называется metZ), metB, metK, metQ, metH, metE, metF, metC, zwf, frpAl, asd, cysE, cysK, cysN, cysD, cysH, cysl, cysC, cysX, cysM, cysA, cysQ, cysG, cysZ, cysJ, cysY, hsk, mcbR, рус, pepCK и ilvA, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии генетических изменений.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, включают генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, двух, или, по меньшей мере, трех, или, по меньшей мере, четырех, или, по меньшей мере, пяти, или, по меньшей мере, шести, или, по меньшей мере, семи, или, по меньшей мере, восьми, или, по меньшей мере, девяти, или, по меньшей мере, десяти, или, по меньшей мере, одиннадцати, или, по меньшей мере, двенадцати, или, по меньшей мере, тринадцати, или, по меньшей мере, четырнадцати, или, по меньшей мере, пятнадцати, или, по меньшей мере, шестнадцати, или, по меньшей мере, семнадцати, или, по меньшей мере, восемнадцати, или, по меньшей мере, девятнадцати, или, по меньшей мере, двадцати, или, по меньшей мере, двадцати одного, или, по меньшей мере, двадцати двух, или, по меньшей мере, двадцати трех, или, по меньшей мере, двадцати четырех, или, по меньшей мере, двадцати пяти, или двадцати шести генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX (также называется metA), metY (также называется metZ), metB, metH, metE, metF, metC, zwf, frpA, asd, cysE, cysK, cysN, cysA, cysD, cysH, cysI, cysC, cysX, cysG, cysM, cysZ, cysJ и рус, где, по меньшей мере, два, или, по меньшей мере, три, или, по меньшей мере, четыре, или, по меньшей мере, пять, или, по меньшей мере, шесть, или, по меньшей мере, семь, или, по меньшей мере, восемь, или, по меньшей мере, девять, или, по меньшей мере, десять, или, по меньшей мере, одиннадцать, или, по меньшей мере, двенадцать, или, по меньшей мере, тринадцать, или, по меньшей мере, четырнадцать, или, по меньшей мере, пятнадцать, или, по меньшей мере, шестнадцать, или, по меньшей мере, семнадцать, или, по меньшей мере, восемнадцать, или, по меньшей мере, девятнадцать, или, по меньшей мере, двадцать, или, по меньшей мере, двадцать один, или, по меньшей мере, двадцать два, или, по меньшей мере, двадцать три, или, по меньшей мере, двадцать четыре, или, по меньшей мере, двадцать пять, или двадцать шесть генов имеют повышенную экспрессию, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированном метионина в отсутствии генетических изменений. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы включают генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, восьми генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX (также называется metA), metY (также называется metZ), metB, metH, metE, metF, metC, zwf, frpA, asd, cysE, cysK, cysN, cysA, cysD, cysH, cysI, cysC, cysX, cysG, cysM, cysZ, cysJ и рус, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии, по меньшей мере, восьми генов, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии генетических изменений.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы включают генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, пяти генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии каждого из, по меньшей мере, пяти генов, в комбинации с, по меньшей мере, шестью генами, выбранными из cysE, cysK, cysN, cysA, cysD, cysH, cysI, cysC, cysX, cysG, cysM, cysZ, и cysJ, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии, по меньшей мере, шести генов, где комбинация приводит к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии комбинации.

В других вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы включают генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, двух генов, выбранных из metK, metQ, cysQ, cysY, hsk, mcbR, pepCK и ilvA, где экспрессия, по меньшей мере, двух генов снижена, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина микроорганизмом по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии генетических изменений.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы включают дерегуляцию, по меньшей мере, двух, или, по меньшей мере, трех, или, по меньшей мере, четырех, или, по меньшей мере, пяти, или, по меньшей мере, шести, или, по меньшей мере, семи, или, по меньшей мере, восьми, или, по меньшей мере, девяти, или, по меньшей мере, десяти, или, по меньшей мере, одиннадцати, или, по меньшей мере, двенадцати, или, по меньшей мере, тринадцати, или, по меньшей мере, четырнадцати, или, по меньшей мере, пятнадцати, или, по меньшей мере, шестнадцати, или, по меньшей мере, семнадцати, или, по меньшей мере, восемнадцати, или, по меньшей мере, девятнадцати, или, по меньшей мере, двадцати, или, по меньшей мере, двадцати одного, или, по меньшей мере, двадцати двух, или, по меньшей мере, двадцати трех, или, по меньшей мере, двадцати четырех, или, по меньшей мере, двадцати пяти белков, выбранных из: аспартаткиназы, гомосеринде-гидрогеназы, гомосерин ацетилтрансферазы, гомосерин сукцинилтрансферазы, цис-татионин-γ-синтазы, цистатионин-β-лиазы, O-ацетилгомосерин сульфогидролазы, O-сукцинилгомосерин сульфогидролазы, витамин В12-зависимой метионинсинтазы, витамин В12-независимой метионинсинтазы, N5,10-метилентетрагидрофолат-редуктазы, сульфатаденилилтрансферазы субъединица 1, сульфатаденилилтрансферазы субъединица 2, APS киназы, APS редуктазы, фосфоаденозинфосфосульфат редуктазы, НАДФ-ферредоксинредуктазы, сульфитредуктазы субъединица 1, сульфит-редуктазы субъединица 2, переносчика сульфата, серин-O-ацетилтрансферазы, O-ацетил серин (тиол)-лиазы А, уропорфириноген III синтазы, глюкоза-6-фосфат дегидрогеназы, пируваткарбоксилазы и аспартат-полуальдегид дегидрогеназы, где дерегуляция включает повышенную экспрессию белков, таким образом, приводя к продуцированию метионина в количестве, по меньшей мере, 8 г/л при подходящих условиях. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы включают дерегуляцию, по меньшей мере, пяти белков, описанных здесь, таким образом, приводя к повышенному продуцированию метионина в количестве, по меньшей мере, 16 г/л при подходящих условиях. Подходящие условия, по данному описанию, это условия, которые приводят к повышенному продуцированию метионина описанными здесь микроорганизмами.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы продуцируют метионин в количестве, по меньшей мере, 8 г/л, или, по меньшей мере, 9 г/л, или, по меньшей мере, 10 г/л, или, по меньшей мере, 11 г/л, или, по меньшей мере, 12 г/л, или, по меньшей мере, 13 г/л, или, по меньшей мере, 14 г/л, или, по меньшей мере, 15 г/л, или, по меньшей мере, 16 г/л при подходящих условиях. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы продуцируют метионин в количестве, по меньшей мере, 8 г/л. В других вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы продуцируют метионин в количестве, по меньшей мере, 16 г/л.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы включают генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, пяти генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии каждого из, по меньшей мере, пяти генов, в комбинации с генетическими изменениями, по меньшей мере, в одном гене, выбранном из metK, metQ, hsk, mcbR и рерСК, таким образом приводя к сниженной экспрессии, по меньшей мере, одного гена, где комбинация приводит к продуцированию метионина микроорганизмом, по меньшей мере, 8 г/л при подходящих условиях, например, описанных здесь.

В одном примере варианта осуществления изобретения рекомбинантный микроорганизм по настоящему изобретению содержит генетические изменения в каждом из восьми генов, выбранных из ask, hom, metX, metY, metE, metH, metF и mcbR, где титр метионина, продуцированного микроорганизмом при подходящих условиях, по меньшей мере, 16 г/л.

В некоторых вариантах осуществления изобретения повышенная экспрессия генов включает конститутивную экспрессию гена и/или полипепетида, кодируемого геном.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, являются этионин-резистентными. Поэтому этионин-резистентные микроорганизмы также охватываются настоящим изобретением, включая одну из многих комбинаций генетических изменений, описанных здесь, где комбинация резистентности к этионину и генетических изменений приводит к повышенному продуцированию метионина по сравнению с продуцированием метионина в отсутствии комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения этионин-резистентные микроорганизмы, включающие комбинацию генетических изменений, описанных здесь, продуцируют метионин в количестве, по меньшей мере, 8 г/л, или, по меньшей мере, 9 г/л, или, по меньшей мере, 10 г/л, или, по меньшей мере, 11 г/л, или, по меньшей мере, 12 г/л, или, по меньшей мере, 13 г/л, или, по меньшей мере, 14 г/л, или, по меньшей мере, 15 г/л, или, по меньшей мере, 16 г/л, или, по меньшей мере, 17 г/л, или, по меньшей мере, 18 г/л, или, по меньшей мере, 19 г/л, или, по меньшей мере, 20 г/л в процессе ферментации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, описанных здесь, рекомбинантные микроорганизмы включают комбинацию: (1) генетических изменений в каждом из, по меньшей мере, шести генов, выбранных из ask^fbr, hom^fbr, metX (также называется metA), metY (также называется metZ), metH, metF и ask^fbr, hom^fbr, metX (также называется metA), metY (также называется metZ), metH, metF и metE, таким образом, приводя к повышенной экспрессии каждого из, по меньшей мере, шести генов; (2) генетических изменений в каждом из mcbR и hsk, таким образом, приводя к сниженной экспрессии mcbR и hsk; и (3) этионин-резистентной мутации, где микроорганизм продуцирует, по меньшей мере, 16 г/л метионина при подходящих условиях.

Это изобретение также относится к способам генетической инженерии микроорганизмов, продуцирующих повышенные или увеличенные уровни метионина. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает векторы, которые могут быть введены в микроорганизмы для осуществления различных генетических изменений, охватываемых данным изобретением. Такие генетические изменения могут либо повысить экспрессию гена, либо снизить экспрессию гена. В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы используются для введения промоторных и/или энхансерных последовательностей выше гена, таким образом, повышая экспрессию гена.

Рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, могут быть либо грамположительными, либо грамотрицательными. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы принадлежат роду, выбранному из Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococci и Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, принадлежат роду Corynebacterium, например, штамму Corynebacterium glutamicum.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ получения метионина включает культивирование штамма Corynebacterium, включающее генетические изменения в каждом из, по меньшей мере, двух или, по меньшей мере, трех, или, по меньшей мере, четырех, или, по меньшей мере, пяти, или, по меньшей мере, шести, или, по меньшей мере, семи, или, по меньшей мере, восьми генов, выбранных из ask, hom, metX, metY, metB, metC, metH, metE, metF, metK, ilvA, metQ, fprA, asd, cysD, cysN, cysC, pyc, cysH, cysI, cysY, cysX, cysZ, cysE, cysK, cysG, zwf, hsk, mcbR и pepCK при таких условиях, что продуцируется метионин, и выделение метионина. В некоторых вариантах осуществления изобретения такой штамм Corynebacterium включает генетические изменения, по меньшей мере, в восьми генах.

В некоторых вариантах осуществления изобретения метод культивирования рекомбинантного микроорганизма, описанный здесь (например, рекомбинантный Corynebacterium glutamicum), приводит к производству метионина в количестве, по меньшей мере, 16 г на литр культуры.

В некоторых вариантах осуществления изобретения векторы включают интеграционные кассеты, применяемые для интеграции последовательностей нуклеиновых кислот в определенные, желаемые локусы внутри микроорганизма. В определенных вариантах осуществления изобретения интеграционные кассеты модифицируют эндогенный ген с помощью введения гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты внутрь последовательности эндогенного гена. Такие гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты могут включать, например, последовательности нуклеиновой кислоты, которые экспрессируют фермент(ы) пути биосинтеза метионина. Гетерологичным геном может быть ген из другого организма, модифицированный эндогенный ген или ген, перемещенный из другого местоположения в хромосоме.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - схема пути биосинтеза метионина, используемого в микроорганизмах, описанных здесь.

Фиг.2 - схема вектора рН273.

Фиг.3 - схема вектора рН373.

Фиг.4 - схема вектора рН304.

Фиг.5 - схема вектора рН399.

Фиг.6 - схема вектора рН484.

Фиг.7 - схема вектора рН491.

Фиг.8 - схема плазмиды рОМ62.

Фиг.9 - схема вектора рН357.

Фиг.10 - схема вектора рН410.

Фиг.11 - схема вектора рН295.

Фиг.12 - схема вектора рН429.

Фиг.13 - схема вектора рН170.

Фиг.14 - схема вектора рН447.

Фиг.15 - схема вектора рН449.

Фиг.16 - схема плазмиды рОМ423.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично, на открытии, что определенные генетические изменения в микроорганизмах приводят к повышенному продуцированию метионина микроорганизмами. В другом аспекте настоящее изобретение основано на открытии, что комбинации генетических изменений в определенных генах особенно желательны для продуцирования метионина.

Существует два альтернативных пути введения атомов серы в промежуточные субстраты синтеза метионина в микроорганизмах, как показано на Фиг.1. Например, бактерия Escherichia coli использует путь транссульфурации; тогда как некоторые другие микроорганизмы, такие, например, как Saccharomyces cerevisiae and Corynebacterium glutamicum (С.glutamicum) применяют пути прямого сульфгидри-рования. Несмотря на то, что многие микроорганизмы, судя по всему, применяют либо один, либо другой путь, С.glutamicum использует оба пути для продуцирования метионина.

Это изобретение основано, по меньшей мере частично, на определении генетических изменений, являющихся выгодными для продуцирования метионина в Corynebacterium, в частности, С.glutamicum. Для того чтобы повысить продуцирование метионина до максимума, важно снизить ингибирование по типу обратной связи определенных ключевых ферментов пути, таких, например, как аспартаткиназа (кодируемая геном ask), гомосериндегидрогеназа (кодируемая геном hom), O-ацетилгомосерин-сульфогидролаза (кодируемая геном metY), гомосерин-ацетилтрансфераза (кодируемая геном metX), М5,10-метилентетрагидрофолат-редуктаза (кодируемая геном metF) и метионинсинтазы (кодируемые геном metH и metE). Например, сообщалось, что ферменты аспартаткиназы (такие, например, как Ask), из различных организмов ингибируются лизином и/или треонином. Например, замена аминокислоты в положении 311 с треонина на изолейцин (T311L) уменьшает ингибирование по типу обратной связи Ask в С.glutamicum (См. патент США №6893848, полное содержание которого включено сюда путем ссылки). Похожим образом, гомосериндегидрогеназа (Hom) может ингибироваться треонином, метионином, лизином и изолейцином, как описано в: Sritharan V. Journal of General Microbiology, 136:203-209 (1990); Chassagnole С. et al. Biochemical Journal 356:415-23(2001); Eikmanns В. J. et al. Antonie van Leeuwenhoek 64:145-63 (1993-94); и Cremer J. et al. Journal of General Microbiology 134(12):3221-3229 (1988)), полное содержание которых включено сюда путем ссылки. Дополнительно, замена аминокислоты в положении 393 с серина на фенилаланина (S393F) уменьшает ингибирование по типу обратной связи Hom (также известный как Hsdh) в С.glutamicum, как описано в Sugimoto M et al. Bioscience, Biotechnology & Biochemistry, 61:1760-1762(1997), полное содержание которого включено сюда путем ссылки. Дополнительно, фермент O-ацетилгомосерин-сульфогидролаза (MetY) ингибируется метионином (WO 2004/108894 А2), так же как метионинсинтаза (MetH) (Chen et al. J. Biol. Chem. 269:27193-27197(1994)).

Настоящее изобретение показывает, что выгодно повышать экспрессию (например, транскрипцию и/или трансляцию) определенных генов в пути биосинтеза метионина, таких, например, как ask, hom (также известный как hsd), metX (также известный как metA), metY (также известный как metZ), metB, metff, metE, metF, metC и/или определенных генов пути биосинтеза цистеина, таких как cysJ, cysE, cysK, cysN, cysD, cysH, cysA, cysI, cysG, cysZ, cysX и cysM, для того чтобы повысить продуцирование метионина в микроорганизмах.

Кроме того, также выгодно снижать или разрегулировать экспрессию определенных генов, чьи продукты снижают продуцирование метионина при определенных условиях, таких, например, как mcbR (также называется RXA00655), как описано в Rey D.A., Journal of Biotechnology 103:51-65(2003); и Rey D.A. et al., Molecular Microbiology 56:871-887 (2005), полные содержания которых включены сюда путем ссылки, hsk, cysQ, cysY, ilvA, pepCK, metK и metQ, для увеличения продуцирования метионина. Например, мутация в гене hsk, приводящая к ферменту с заменой аминокислоты в положении 190 с треонина на аланин (Т190А), и/или мутация в гене metK, приводящая к ферменту S-Аденозилметионин синтазе с заменой аминокислоты в положении с цистеина на аланин (С94А), особенно выгодна для повышения продуцирования метионина в С.glutamicum.

Это изобретение также представляет микроорганизмы, содержащие генетические изменения в каждом гене в комбинации любых двух или в комбинации любых трех, или в комбинации любых четырех, или в комбинации любых пяти, или в комбинации любых шести, или в комбинации любых семи, или в комбинации любых восьми из следующих генов: ask^fbr, hom^fbr, metX (также называется metA), metY (также называется metZ), metB, metH, metE, metF и zwf, где генетические изменения приводят к повышенной экспрессии любых двух, или любых трех, или любых четырех, или любых пяти, или любых шести, или любых семи, или любых восьми генов, таким образом приводя к повышенному продуцированию метионина по отношению к метионину, продуцируемому в отсутствии генетических изменений. Также в настоящем изобретении представлены микроорганизмы, содержащие генетические изменения в каждом из девяти генов, перечисленных выше, что усиливает экспрессию всех девяти представленных выше генов, таким образом повышая продуцирование метионина.

В некоторых вариантах осуществления изобретения рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, содержат генетические изменения в каждом из любых двух, или любых трех, или любых четырех, или любых пяти, или любых шести, или любых семи, или любых восьми, или девяти из следующих генов: ask^fbr, hom^fbr, metX, metY, metB, metH, metE, metF и zwf, в комбинации с генетическими изменениями, по меньшей мере, в одном из следующих генов: mcbR, hsk, metQ, metK и рерСК, таким образом повышая продуцирование метионина. Подразумевается, что усиление или повышение экспрессии включает повышение транскрипции/трансляции гена или повышение активности или уровня белка/фермента, кодируемого геном.

Для того чтобы настоящее изобретение было более понятно, здесь впервые даны определения некоторым терминам.

Фраза «метионин-продуцирующий микроорганизм» при использовании здесь относится к любому микроорганизму, способному продуцировать метионин, например, бактерии, дрожжи, грибы, простейшие и т.д. В некоторых вариантах осуществления изобретения метионин-продуцирующие микроорганизмы принадлежат роду Corynebacterium. В других вариантах осуществления изобретения метионин-продуцирующий микроорганизм представляет собой Corynebacterium glutamicum. В других вариантах осуществления изобретения метионин-продуцирующий микроорганизм выбирается из: микроорганизма, принадлежащего роду Corynebacterium, микроорганизма, принадлежащего роду Enterobacteria, микроорганизма, принадлежащего роду Bacillus, и дрожжей. В некоторых вариантах осуществления изобретения микроорганизм, принадлежащий роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum; микроорганизм, принадлежащий роду Enterobacteria, представляет собой Escherichia coli. В других вариантах осуществления изобретения микроорганизм, принадлежащий роду Bacillus, это Bacillus subtilis. В других вариантах осуществления изобретения дрожжи это Saccharomyces cerevisiae.

При использовании здесь фраза «повышенные уровни продуцирования метионина» относится к титру метионина (например, в г/л при подходящих условиях ферментации), продуцированному микроорганизмом, содержащим генетические изменения в двух или более, или трех или более, или четырех или более, или пяти или более, или шести или более, или семи или более, или восьми или более, или девяти или более, или десяти или более, или одиннадцати или более, или двенадцати или более, или тринадцати или более, или четырнадцати или более, или пятнадцати или более, или шестнадцати или более, или семнадцати или более, или восемнадцати или более, или девятнадцати или более, или двадцати или более, или двадцати одного или более, или двадцати двух или более, или двадцати трех или более, или двадцати четырех или более, или двадцати пяти или более, или двадцати шести или более, или двадцати семи или более, или двадцати восьми или более, или двадцати девяти или более, или тридцати или более, или тридцати одного или более, или тридцати двух или более, или тридцати трех или более, или тридцати четырех или более генах по настоящему описанию, где такой титр больше, чем количество, продуцированное при похожих условиях контрольным микроорганизмом, который обычно