Лечение и предупреждение болезней сердца с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов

Лечение и предупреждение болезней сердца с использованием двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к способам лечения или предупреждения болезней сердца у субъекта, включающим введение субъекту двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF). Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, включающим введение в кровеносный сосуд двух или более изоформ фактора роста гепатоцитов (HGF). В одном варианте осуществления две или более изоформ HGF вводят в виде одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих указанные изоформы.

Предпосылки создания изобретения

HGF является гепаринсвязывающим гликопротеином, также известным как рассеивающий фактор или гепатопоэтин А. HGF, первоначально идентифицированный как сильный гепатотропный фактор роста (Nakamura et al., Nature 342: 440 (1989)), представляет собой гепаринсвязывающий белок мезенхимального происхождения, который имеет множество биологических эффектов, таких как митогенез, мотогенез и морфогенез различных типов клеток. Кодирующий HGF ген, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 (Seki Т., et al., Gene 102: 213-219 (1991)), находится на хромосоме 7q21.1 и включает 18 экзонов и 17 интронов. Транскрипт размером 6 т.п.о. транскрибируется с гена HGF, и затем на его основе синтезируется полноразмерный полипептид-предшественник HGF (flHGF), состоящий из 728 аминокислот, включающий следующие домены: N-концевая «петля-шпилька» - «двойная петля» 1 - «двойная петля» 2 - «двойная петля» 3 - «двойная петля» 4 - домен инактивированной серинпротеазы. Одновременно несколько отличных изоформ полипептида HGF синтезируются при альтернативном сплайсинге гена HGF. Известные изоформы включают вариант HGF с делецией (полноразмерный HGF за исключением делеции пяти остатков в «двойной петле» 1), NK1 (N-концевая «петля-шпилька» - «двойная петля» 1), NK2 (N-концевая «петля-шпилька» - «двойная петля» 1 - «двойная петля» 2) и NK4 (N-концевая «петля-шпилька» - «двойная петля» 1 - «двойная петля» 2 - «двойная петля» 3 - «двойная петля» 4). Кроме того, существуют аллельные варианты каждой изоформы. Под действием протеазы в сыворотке биологически неактивные предшественники могут превращаться в активные формы связанного с помощью дисульфидной связи гетеродимера. В гетеродимерах альфа-цепь с высокой молекулярной массой образует четыре домена «двойная петля» и N-концевую «петлю-шпильку», характерные для преактивированного пептидного района плазминогена. Домены «двойные петли» связанной с помощью трех дисульфидных связей петлеобразной структуры, состоящей из приблизительно 80 аминокислот, могут играть важную роль в межбелковых взаимодействиях. Низкомолекулярная бета-цепь образует подобный неактивной серинпротеазе домен. Состоящий из 723 аминокислот dHGF является полипептидом с делецией пяти аминокислот в первом домене «двойная петля» альфа-цепи, т.е. F, L, P, S и S, благодаря альтернативному сплайсингу между экзоном 4 и экзоном 5.

In vivo две изоформы HGF (flHGF, имеющий 728 аминокислот, и dHGF, имеющий 723 аминокислот) образуются благодаря альтернативному сплайсингу между экзоном 4 и экзоном 5. Хотя обе изоформы flHGF и dHGF имеют несколько общих биологических функций, они являются различными по иммунологическим и нескольким биологическим свойствам.

Установлено, что HGF стимулирует ангиогенез путем регулирования роста эндотелиальных клеток и миграции гладкомышечных клеток сосудов. Из-за своей ангиогенной активности HGF рассматривается в качестве одного из многообещающих кандидатов в терапевтическом ангиогенезе. «Терапевтический ангиогенез» означает вмешательство, при котором используются ангиогенные факторы, или в виде рекомбинантных белков, или в виде генов, для лечения ишемических болезней, таких как болезнь коронарных артерий (CAD) или болезнь периферических артерий (PAD). Также известно, что HGF стимулирует не только рост, но также и миграцию эндотелиальных клеток (Bussolino et al., J. Cell Biol. 119: 629 (1992); Nakamura et al., J. Hypertens 14: 1067 (1996)), и была также исследована его роль в качестве стимулирующего реэндотелизацию агента (Yasuda et al., Circulation 101: 2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther. 7: 1664 (2000)).

HGF был использован в качестве агента для терапевтического ангиогенеза. Morishita и коллеги по работе использовали ген HGF для лечения PAD и CAD. Они наблюдали некоторый терапевтический ответ в случае PAD после введения гена HGF, но было неясно, является ли перенос гена HGF эффективным для лечения CAD. На данное число перенос гена HGF был исследован в различных моделях CAD на животных (Miyagawa et al., Circulation 105: 2556 (2002); Azuma et al., Gene Ther. 13: 1206 (2006); Aoki et al., Gene Ther. 7: 417 (2000); Funatsu et al., J. Thoracic Cardiovasc. Surg. 124: 1099 (2002)). Однако все еще остается спорным то, оказывает ли перенос гена HGF целебные эффекты на CAD. Например, Miyagawa и его коллеги по работе установили, что перенос HGF человека не мог увеличить фракцию изгнания левого желудочка (LVEF) пораженного инфарктом сердца через 8 недель после лечения в модели инфаркта миокарда на крысах (Miyagawa et al., Circulation 105: 2556 (2002), фиг.2). Кроме того, перенос гена HGF имел незначительный эффект на фракцию укорочения в процентах и толщину передней стенки левого желудочка через 8 недель после лечения в той же модели (Miyagawa et al., Circulation 105: 2556 (2002), фиг.3 и 5).

HGF был также использован в качестве агента для ингибирования рестеноза. Методы ангиопластики коронарных сосудов, например, надувной баллон или стен, являются широко используемыми способами лечения перекрытых кровеносных сосудов. Однако утолщение интимы, например рестеноз коронарных артерий, создает значительную проблему при использовании ангиопластики. Одной из причин рестеноза является гиперпролиферация и миграция гладкомышечных клеток сосудов с сопутствующим синтезом экстраклеточного матрикса, что является следствием ответа на повреждение сосуда. Существуют данные, что быстрое восстановление эндотелиальной поверхности могло подавлять пролиферацию гладкомышечных клеток и, тем самым, ингибировать рестеноз (например, Bauters et al., Prog. Cardiovasc. Dis. 40: 107 (1997)). В качестве одного из способов предупреждения рестеноза была проверена локальная доставка факторов роста эндотелия, таких как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) или фактор роста гепатоцитов (HGF), в поврежденный кровеносный сосуд, и она продемонстрировала эффекты на ослабление рестеноза (Asahara et al., Circulation 94: 3291 (1996); Yasuda et al., Circulation 101; 2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther. 7: 1664 (2000); Walter et al., Circulation 110: 36 (2004)).

Все исследования в отношении HGF-генной терапии, описанные выше, были проведены с использованием кДНК flHGF, кодирующей 728 аминокислот, но не с кДНК dHGF, кодирующей 723 аминокислот (Miyagawa et al.; Azuma et al.; Aoki et al.; Funatsu et al.; Yasuda et al.; и Hayashi et al.). Настоящим изобретением предоставляется первое доказательство того, что перенос нуклеотидных последовательностей, экспрессирующих многочисленные изоформы HGF (например, flHGF и dHGF), может эффективно лечить CAD у животных и людей, по сравнению с кДНК flHGF, которую проверяли в большинстве предшествующих работ. Настоящим изобретением также предоставляется первое доказательство того, что перенос нуклеотидных последовательностей, экспрессирующих многочисленные изоформы HGF, может ускорить процесс реэндотелизации кровеносного сосуда.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, одной задачей настоящего изобретения является обеспечение применения композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Один аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, включающей две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения болезни сердца у субъекта.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, включающей две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение способов лечения или предупреждения болезни сердца путем введения двух или более изоформ HGF.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца или увеличения плотности сосудов в миокарде у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения болезни сердца у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способам усиления восстановления эндотелия или обеспечения лечения в месте повреждения сосуда или пораженного болезнью сосуда у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Дальнейшая задача настоящего изобретения имеет отношение к способам активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, включающим введение в кровеносный сосуд композиции, включающей две или более изоформ HGF. В одном варианте осуществления кровеносный сосуд является поврежденным. В дальнейшем варианте осуществления активируется реэндотелизация кровеносного сосуда.

В одном варианте осуществления две или более изоформ HGF включают полноразмерный HGF (именуемый здесь flHGF) и вариант HGF с делецией (именуемый здесь dHGF). В другом варианте осуществления две или более изоформ HGF также включают NK1.

В дальнейшем варианте осуществления две или более изоформ HGF вводят в форме полинуклеотидов, кодирующих изоформы.

В одном аспекте настоящего изобретения композицию вводят путем инъекции.

В другом аспекте настоящего изобретения композицию вводят, используя средство доставки. В одном варианте осуществления средством доставки является стент. В дальнейшем варианте осуществления стент выбирают из группы, состоящей из стента из нержавеющей стали без слоя полимера, стента из нержавеющей стали со слоем полимера, стента из хромокобальтового сплава без слоя полимера и стента из хромокобальтового сплава со слоем полимера.

В одном аспекте настоящего изобретения две или более изоформ HGF вводят непосредственно в ишемизированную ткань сердца у субъекта.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к композициям, включающим две или более изоформ HGF.

В одном варианте осуществления композиции включают полинуклеотиды, кодирующие две или более изоформ HGF.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к композиции для увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца у субъекта, включающей две или более изоформ HGF.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к композиции для активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде у субъекта, включающей две или более изоформ HGF.

В одном варианте осуществления введение композиции в кровеносный сосуд субъекта активирует эндотелизацию кровеносного сосуда. В другом варианте осуществления введение композиции в кровеносный сосуд субъекта активирует и/или ускоряет реэндотелизацию кровеносного сосуда.

В дальнейшем варианте осуществления субъект нуждается в предупреждении или лечении рестеноза.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Вышеприведенные и другие задачи и отличительные признаки настоящего изобретения станут явными из следующего описания настоящего изобретения, взятого вместе с сопроводительными чертежами.

На фиг.1 демонстрируются эффекты изоформ HGF на миграцию HUVEC.

На фиг.2 демонстрируются эффекты изоформ HGF на миграцию клеток С2С12.

На фиг.3 демонстрируются эффекты изоформ HGF на миграцию клеток Н9С2.

На фиг.4 демонстрируются эффекты изоформ HGF на пролиферацию HUVEC.

На фиг.5 демонстрируется схематическое представление порядка проведения эксперимента для оценки фармакологической эффективности HGF в модели ишемической болезни сердца на крысах.

На фиг.6 демонстрируется эффект HGF на функцию - фракцию изгнания левого желудочка.

На фиг.7 демонстрируется эффект HGF на функцию - межжелудочковую перегородку во время систолы.

На фиг.8 демонстрируется эффект инъецирования HGF в ишемизированный миокард на плотность капилляров.

На фиг.9 демонстрируется эффект инъецирования HGF в ишемизированный миокард на фиброз миокарда.

На фиг.10 демонстрируется область коронарной артерии в 20-сегментной модели MIBI-SPECT.

На фиг.11 демонстрируется выбор миокардиальной области для инъецирования pCK-HGF-X7. pCK-HGF-X7 вводят путем интрамиокардиальных инъекций в обе ветви коронарной артерии в пределах миокардиальной области, имеющей уменьшение перфузии по оценке с помощью MIBI-SPECT.

На фиг.12 демонстрируется эффект pCK-HGF-X7 на перфузию миокарда при MIBI-SPECT.

На фиг.13 демонстрируется перфузия миокарда (κ), оцениваемая с помощью контрастной стресс-эхокардиографии миокарда.

На фиг.14 демонстрируется ускорение реэндотелизации с помощью элюирующего плазмиду для HGF стента согласно OCT.

На фиг.15 демонстрируется ускорение реэндотелизации с помощью элюирующего плазмиду для HGF согласно SEM.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на открытии того, что введение двух или более изоформ HGF субъекту, страдающему болезнью сердца, такой как CAD, является эффективным для увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца и, следовательно, для лечения или предупреждения болезни сердца. Дальнейшие аспекты настоящего изобретения имеют отношение к открытию того, что введение двух изоформ HGF активирует эндотелизацию кровеносного сосуда, например, для ослабления рестеноза посредством быстрой реэндотелизации кровеносного сосуда. Соответственно, задачей настоящего изобретения является обеспечение способов лечения или предупреждения болезни сердца, например, CAD или рестеноза коронарных артерий, путем введения двух или более изоформ HGF. Другой задачей настоящего изобретение является обеспечение способов активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, например, если кровеносный сосуд является поврежденным.

Один аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, включающей две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для лечения или предупреждения болезни сердца у субъекта.

Другой аспект настоящего изобретения относится к применению композиции, включающей две или более изоформ HGF или один или несколько полинуклеотидов, кодирующих изоформы, для производства лекарственного средства для активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам увеличения перфузии ишемизированной ткани сердца или увеличения плотности сосудов в миокарде у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способам лечения или предупреждения болезни сердца у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способам усиления восстановления эндотелия или обеспечения лечения в месте повреждения сосуда или пораженного болезнью сосуда у субъекта, включающим введение субъекту композиции, включающей две или более изоформ HGF.

Другая задача настоящего изобретения имеет отношение к способам активирования роста эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде, включающим введение в кровеносный сосуд композиции, включающей две или более изоформ HGF, причем рост эндотелиальных клеток в кровеносном сосуде активируется.

В одном варианте осуществления способы включают введение композиции, включающей три или более изоформ HGF, например, четыре или более изоформ HGF. В одном варианте осуществления композиция включает две или более изоформ HGF, выбираемых их группы, состоящей из flHGF, dHGF, NK1, NK2 и NK4. В другом варианте осуществления композиция включает две или более изоформ HGF, выбираемых их группы, состоящей из flHGF, dHGF, NK1 и NK2. В еще одном варианте осуществления композиция включает две или более изоформ HGF, выбираемых их группы, состоящей из flHGF, dHGF и NK1. В дальнейшем варианте осуществления две или более изоформ HGF включают flHGF и dHGF. В дальнейшем варианте осуществления две или более изоформ HGF состоят из flHGF и dHGF. В другом варианте осуществления две или более изоформ HGF включают flHGF, dHGF и NK1. В другом варианте осуществления две или более изоформ HGF вводят в форме полинуклеотидов, кодирующих изоформы.

В настоящем изобретении болезнью сердца, подвергаемой лечению или предупреждаемой, является любое заболевание, связанное с уменьшением кровотока в сердце, аорте или коронарных артериях, или ишемизированной ткани сердца. Примеры болезней сердца включают, без ограничения, окклюзию коронарных артерий (например, являющуюся следствием или связанную с отложением липидов/холестерина, привлечением макрофагов/клеток воспаления, отрывом бляшек, тромбозом, отложением тромбоцитов или разрастанием неоинтимы); ишемические синдромы (например, являющиеся следствием или связанные с инфарктом миокарда, стабильной стенокардией, нестабильной стенокардией, рестенозом коронарных артерий или реперфузионным повреждением), кардиомиопатию (например, являющуюся следствием или связанную с ишемическим синдромом, кардиотоксином, инфекцией, гипертонией, болезнью обмена веществ (такой как уремия, алиментарный полиневрит или гликогеноз), облучением, нервно-мышечным заболеванием, инфильтративным заболеванием (таким как саркоидоз, гемохроматоз, амилоидоз, болезнь Фабри или синдром Гурлер), травмой или неясной этиологией); аритмию (например, являющуюся следствием или связанную с ишемическим синдромом, кардиотоксином, адриамицином, инфекцией, гипертонией, болезнью обмена веществ, облучением, нервно-мышечным заболеванием, инфильтративным заболеванием, травмой или неясной этиологией); инфекцию (например, вызванную патогенным агентом, таким как бактерия, вирус, гриб или паразит) и воспалительное заболевание (например, связанное с миокардитом, перикардитом, эндокардитом, иммунным отторжением сердца или воспалительными заболеваниями, являющимися следствием идиопатического, аутоиммунного заболевания или заболевания соединительной ткани).

В одном варианте осуществления способы настоящего изобретения можно использовать для лечения или предупреждения атеросклероза (например, в аорте или коронарных артериях) для предупреждения связанных с атеросклерозом осложнений (например, стенокардии, инфаркта миокарда, аритмий, сердечной недостаточности, почечной недостаточности, цирроза печени, болезни Легга-Кальве-Пертеса, ишемического удара, окклюзии периферических артерий, аневризмы, эмболии) или для ослабления ранних симптомов и признаков атеросклероза (например, невозможности увеличения при необходимости кровотока в поврежденной ткани, как при стенокардии, усилии или синдроме Шарко).

В другом варианте осуществления способы настоящего изобретения можно использовать для лечения или предупреждения болезней сердца, являющихся следствием сосудистой хирургии, в том числе, без ограничения, ангиопластики (например, чрескожной транслюминальной ангиопластики коронарных сосудов, чрескожной транслюминальной ангиопластики сонной артерии, коронарной ангиопластики с имплантацией стента), стентирования, атерэктомии или имплантации (например, имплантации шунта для коронарных артерий). В этом варианте осуществления способы настоящего изобретения могут выполняться до, во время и/или после хирургического вмешательства. В определенных вариантах осуществления болезнью сердца является рестеноз коронарных артерий.

В одном аспекте настоящего изобретения две и более изоформ HGF вводят субъекту, имеющему заболевание коронарных артерий. В одном варианте осуществления субъект имеет частичную или полную закупорку одной или нескольких коронарных артерий. В другом варианте осуществления субъект имел, имеет инфаркт миокарда или подвержен риску его развития. В дальнейшем варианте осуществления субъект, как определено, например, на основе ангиограммы, электрокардиограммы, эхокардиограммы или другого метода, имеет ишемизированную ткань сердца, или у него предполагается наличие такой ткани. В одном варианте осуществления субъект является кандидатом на имплантацию шунта для коронарных артерий (CABG). В другом варианте осуществления субъект имеет одну или несколько коронарных артерий, которые частично или полностью закупорены, но не подходят для CABG. В дальнейшем варианте осуществления субъект был подвергнут CABG, но произошла неполная реваскуляризация миокарда.

В одном аспекте настоящего изобретения две или более изоформ HGF вводят в кровеносный сосуд для активации роста эндотелиальных клеток. В одном варианте осуществления кровеносный сосуд является перекрытым или поврежденным. В определенных вариантах осуществления перекрытый кровеносный сосуд, просвет которого сужен и кровоток через который уменьшен, может включать артерию или вену. В одном варианте осуществления введение двух и более изоформ HGF активирует реэндотелизацию кровеносного сосуда, например, после повреждения стенки кровеносного сосуда, например, во время метода ангиопластики. В определенных вариантах осуществления реэндотелизация может быть активирована и/или ускорена, например, наблюдается увеличение скорости роста эндотелиальных по сравнению с ростом эндотелиальных клеток в отсутствие двух или более изоформ HGF. В другом варианте осуществления введение двух или более изоформ HGF, например, субъекту, нуждающемуся в предупреждении или лечении рестеноза, подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток в кровеносном сосуде.

Используемый здесь термин «лечить» или «лечение» болезни, например болезни сердца или перекрытого или поврежденного кровеносного сосуда, относится к введению субъекту фактора в количестве, достаточном для вызова уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов болезни или предотвращения развития болезни, или вызова регрессии болезни, например, вследствие активирования ангиогенеза или роста эндотелиальных клеток. Например, что касается уменьшения интенсивности симптома болезни сердца, лечение приводит к измеримому уменьшению интенсивности симптома, составляющему по крайней мере 5%, предпочтительно по крайней мере 10%, по крайней мере 15%, по крайней мере 20%, по крайней мере 25%, по крайней мере 30%, по крайней мере 35%, по крайней мере 40%, по крайней мере 45%, по крайней мере 50%, по крайней мере 55%, по крайней мере 60%, по крайней мере 65%, по крайней мере 70%, по крайней мере 75%, по крайней мере 80%, по крайней мере 85%, по крайней мере 90%, по крайней мере 95% или по крайней мере 100%. Физиологические эффекты, имеющие отношение к лечению болезни сердца, которые можно выявить и измерить для определения лечения, включают, без ограничения, увеличение производительности сердца (определяемой по, как минимум, одному клиническому показателю функции сердца, такому как минутный сердечный выброс, давления в легочной артерии и центральных венах или фракция изгнания желудочка), кровотока в стенке миокарда в покое или в состояниях нагрузки, регенерации ткани миокарда, образования, достижения полного развития и/или роста коллатеральных кровеносных сосудов (например, локального неоангиогенеза, увеличение капиллярной плотности, артериогенеза, лимфоангиогенеза, васкулогенеза), кардиомиогенеза (например, клеток поперечно полосатых мышечных волокон, гладких мышечных клеток или эпителиально-мышечных клеток), васкуляризации миокардиальной ткани, сократительной функции сердца, фракции изгнания левого желудочка или межжелудочковой перегородки, или уменьшение миокардиального фиброза, утолщения интимы (разрастания/гиперплазии неоинтимы), пролиферации эндотелиальных или гладкомышечных клеток, боли в груди или одышки.

Используемые здесь термины «предупреждать» или «предупреждение» относятся к уменьшению возникновения одного или нескольких симптомов болезни (например, изменения функции сердца или уменьшения кровотока вследствие перекрытого или поврежденного кровеносного сосуда) у животного. Предупреждение может быть полным, например, полным отсутствием симптомов у субъекта. Предупреждение может быть также частичным, так что частота симптомов у субъекта меньше частоты, которая наблюдалась бы без настоящего изобретения.

В одном варианте осуществления изоформы HGF или полинуклеотиды, кодирующие изоформы HGF, вводят в сосудистую сеть или сердце субъекта, например, поврежденный кровеносный сосуд, частично или полностью закупоренную коронарную артерию, ишемизированную миокардиальную ткань, перикардиальное пространство или коронарный синус.

Изоформы HGF или полинуклеотиды, кодирующие изоформы HGF, могут доставляться в требуемое место, используя любые средства, известные в данной области техники. Примеры средств доставки, которые могут использоваться, включают, без ограничения, катетеры (например, баллонный катетер, инфузионный катетер, катетер со стилетным концом), иглы, безигольные инъекторы, стенты, инфузионную канюлю, сетку, передаточные механизмы для сердца, шунты, кардиостимуляторы, имплантируемые фибриляторы, шовные материалы, металлические клипсы, накрутки вокруг сосудов, гибкие листы или мембраны, которые могут в значительной степени принимать очертания места ранения, средства каналирования, имплантаты и насосы. Конкретные примеры способов доставки изоформ HGF включают, без ограничения, доставку посредством баллонного катетера, помещаемого в вену, дренирующую в коронарный синус (например, большую вену сердца, среднюю вену сердца, заднюю вену левого желудочка или переднюю межжелудочковую вену или любую из их боковых ветвей); доставку через катетер, проведенный в просвет одной или нескольких коронарных артерий (например, правую или левую коронарную артерию), причем изоформами HGF покрыт баллон, который надувается на месте, или эти изоформы инъецируются из наконечника катетера; доставку через иглу во время операции на открытом сердце или трансплантации сердца (например, в левое или правое предсердие или левый или правый желудочек); доставку в перикардиальное пространство, используя внутренний ввод через левое предсердие, правый желудочек или левый желудочек или используя внешний ввод посредством операции со вскрытием грудной клетки, в минимальной степени инвазивной хирургии, или чрескожный ввод, выполняемый с помощью инъекции, катеризации, создания с помощью лазера перфузионных каналов, канюлизации, использования генной пушки или использования насоса; доставку с помощью антероградной перфузии из катетера, помещаемого в канал, доставляющий кровь в ткань, или ретроградной перфузии из катетера, помещаемого в канал, получающий кровь из ткани; или доставку посредством находящегося внутри просвета средства или внутрисосудистого протеза для сохранения сосудистой проходимости (например, стента, имплантата, стента-имплантата, фильтрующего контура в полой вене). В одном варианте осуществления средство является биодеградабельным, вследствие чего его не нужно удалять после того, как оно больше не требуется. В определенных вариантах осуществления две изоформы HGF доставляют, используя стент. В дальнейшем варианте осуществления стент выбирают из группы, состоящей из стента из нержавеющей стали без слоя полимера, стента из нержавеющей стали со слоем полимера, стента из хромокобальтового сплава без слоя полимера и стента из хромокобальтового сплава со слоем полимера.

В одном варианте осуществления полинуклеотиды, кодирующие изоформы HGF, доставляют в форме клеток, включающих полинуклеотиды и экспрессирующие полипептиды HGF. Клетки могут быть аутологичными или неаутологичными (например, аллогенными или ксеногенными) клетками. Можно использовать любую клетку, которая является жизнеспособной после трансплантации, в том числе, например, фибробласты, кардиомиоциты, эндотелиальные клетки или стволовые клетки (например, эмбриональные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки). Клетки, включающие полинуклеотиды, можно вводить в виде инъецируемого препарата жидкой суспензии, например, для инъекции в место поврежденного миокарда или внутривенно. Клетки можно вводить в инфарктную зону для уменьшения степени рубцового образования и для увеличения желудочковой функции. При введении полинуклеотидов в клетки ex vivo клетки можно получить от субъекта с помощью любого метода, известного в данной области техники, включающего, но без ограничения, биопсии, соскоб или хирургическое излечение ткани. Выделенные клетки можно культивировать в течение периода времени, достаточного для позволения полинуклеотидам внедриться в клетки, например, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 36, 48 часов или более. Способы культивирования эмбриональных клеток в течение коротких периодов времени широко известны в данной области техники. Например, клетки можно культивировать в планшетах (например, микролуночных планшетах) или в виде прикрепленных клеток, или в суспензии. В одном варианте осуществления присутствие полинуклеотидов в клетках определяют до введения клеток обратно субъекту. В другом варианте осуществления отбирают (например, на основе присутствия селектируемого маркера в полинуклеотидах) клетки, содержащие полинуклеотиды, и субъекту снова вводят только клетки, содержащие полинуклеотиды.

Когда изоформы HGF или полинуклеотиды, кодирующие изоформы HGF, доставляют с помощью инъекции, инъекция может быть внутрисердечной инъекцией, например, внутрь предсердия (левого и/или правого) или желудочка (левого и/или правого). Инъекция может также быть интрамиокардиальной инъекцией. Место инъекции может быть в ишемизированной/характеризующейся гипоксией области или вблизи такой области, на границе нормальной ткани и ишемизированной/характеризующейся гипоксией области, или в нормальную ткань. Инъекция может быть в месте одной или нескольких коронарных артерий, например, закупоренной артерии. Инъекции могут быть трансэпикардиальными или трансэндокардиальными. Доставка может состоять из одной инъекции или множественных инъекций в одно или несколько мест. Доставка может быть осуществлена с помощью интраперикардиальной инъекции. Доставка в являющееся сосудом место может быть внутрисосудистой инъекцией, например, внутривенной или внутриартериальной (внутрикоронарной, внутриаортальной). Доставка может быть в по крайней мере две коронарные артерии, например, по крайней мере одну левую и одну правую коронарную артерию, например, в место как минимум приблизительно 1 см к просвету коронарной артерии. Сосудистая инъекция может быть, например, в месте, прилегающем к ишемизированной или пораженной болезнью ткани, в месте сосудистого повреждения или в месте стеноза.

Введение изоформ HGF может быть повторено неоднократно, например, спустя промежуток времени, составляющий 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней или более, например, спустя 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель или более. В одном варианте осуществления после каждого введения изоформ HGF контролируют состояние сердечной перфузии или здоровое состояние сосудов, например, с помощью ангиограммы, электрокардиограммы, эхокардиограммы или другого способа, и, при необходимости, предоставляются дополнительные введения.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения две или более изоформ HGF вводят субъекту, испытывающему на данный момент ишемический эпизод. В другом варианте осуществления две или более изоформы HGF вводят как можно раньше после того, как ишемический эпизод имел место, например, в пределах 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 36, 48 или 72 часов от ишемического эпизода.

Две или более изоформ HGF вводят в терапевтически эффективной дозе, например дозе, которая приводит к измеряемому улучшению болезни сердца и/или сосудистого заболевания у субъекта, например увеличению перфузии ишемизированной ткани сердца, увеличению капиллярной плотности в ишемизированной ткани сердца, уменьшению фиброза в ишемизированной ткани сердца, уменьшению степени сосудистого повреждения, увеличению эндотелизации и т.п. Эффективная доза будет меняться от субъекта к субъекту в зависимости от степени болезни и/или потребности в эндотелизации, выбранного пути введения, возраста, пола и веса тела отдельного субъекта, состояния здоровья субъекта и тяжести симптомов у субъекта и может вводиться в однократной дозе или в разделенной на курс лечения общей дозе. Поэтому ежедневная доза не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения никоим образом. Например, когда две или более изоформ HGF водятся в виде белков, терапевтически эффективная доза может находиться в диапазоне, составляющем от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мг, например, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 10 мг каждого белка. Когда две или более изоформ HGF водятся в виде полинуклеотидов, терапевтически эффективная доза может находиться в диапазоне, составляющем от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мг, например, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 5 мг, например, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 2 мкг, от 100 мкг до приблизительно 1 мг. Когда введение изоформ HGF повторяется неоднократно, вводимая доза может быть одной и той же или различной каждый раз.

В одном варианте осуществления способы, кроме того, включают назначение субъекту дополнительных терапевтических средств или способов (например, ангиопластики), которые, как известно, являются эффективными для лечения болезни сердца и/или сосудистого заболевания. Примеры терапевтических средств включают, без ограничения, активаторы ангиогенеза (например, фактор роста сосудистого эндотелия, высвобождающие или образующий окись азота агенты, фактор роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста, интерлейкин-6, белок-1, вызывающий хемотаксис моноцитов, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, трансформирующий фактор-β роста), антитромбозные средства (например, аспирин, гепарин, РРАСК, эноксаприн, гирудин), антикоагулянты, антибиотики, антитромбоцитарные средства, тромболитики (например, активатор тканевого плазминогена), антипролиферативные средства, противовоспалительные средства, агенты, которые ингибируют гиперплазию, агенты, которые ингибируют рестеноз, ингибиторы гладкомышечных клеток, факторы роста, ингибиторы факторов роста, ингибиторы клеточной адгезии, химиотерапевтические средства и их комбинации.

Следующие определения предоставлены и должны помочь понять объем и осуществление на практике настоящего изобретения.

Термин «выделенный» для целей настоящего изобретения обозначает биологический материал (клетку, нуклеиновую кислоту или белок), который был извлечен из его первоначального окружения (окружения, в котором он присутствует в природе). Например, полинуклеотид, находящийся в своем природном состоянии в растении или животном, не является выделенным, однако этот же полинуклеотид, отделенный от соседних нуклеиновых кислот, с которыми он присутствуют в природе, считается «выделенным».

«Нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к образованной с помощью фосфатно-эфирных связей полимерной форме рибонуклеозидов (аденозина, гуанозина, уридина или цитидина; «молекулам РНК») или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозина, дезоксигуанозина, дезокситимидина или дезоксицитидина; «молекулам ДНК») или любым их фосфоэфирным аналогам, таким как фосфоротиоаты и тиоэфиры, или в одноцепочечной форме, или в виде двухцепочечной спирали. Возможны двухцепочечные ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК спирали. Термин «молекула нуклеиновой кислоты» и, в частности, молекула ДНК или РНК относится только к первичной и вторичной структуре молекулы и не ограничивает ее какими-либо конкретными третичными формами. Таким образом, этот термин включает двухцепочечную ДНК, обнаруживаемую, среди прочего, в линейных или кольцевых молекулах ДНК (например, рестрикционных фрагментах), плазмидах, суперскрученных ДНК и хромосомах. При обсуждении структуры конкретной двухцепочечной молекулы ДНК последовательности могут здесь описываться в соответствии со стандартным правилом дачи последовательности только в направлении от 5' к 3' вдоль нетранскриби