Рнки-ингибирование репликации вируса гриппа

Рнки-ингибирование репликации вируса гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент США рег. № 60/732243, поданной 1 ноября 2005 г.; заявки на патент США рег. № 60/748317, поданной 7 декабря 2005 г.; и заявки на патент США рег. № 60/799000, поданной 9 мая 2006 г. Содержание каждой из указанных предварительных заявок во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к терапии гриппа и к композициям и способам, применяемым для модуляции репликации вируса, а более конкретно для негативной регуляции гена(ов) вируса гриппа с использованием олигонуклеотидов, которые действуют посредством интерференции РНК и которые вводят местно в легкие и в носовые ходы путем ингаляции/интраназально или системно, например путем внутривенной инъекции.

Предшествующий уровень техники

Термин интерференция РНК или “РНКи" был впервые введен в употребление Fire и сотрудниками для описания проводимых наблюдений, в процессе которых было обнаружено, что при введении двухцепочечной РНК (дцРНК) червям она может блокировать экспрессию гена (Fire et al., Nature 391:806-811, 1998). Короткоцепочечная дцРНК регулирует геноспецифический посттранскрипционный сайленсинг во многих организмах, включая позвоночных, и используется как новый инструмент для исследования функции генов. За последнее время эта технология была уже много раз описана в литературе, см., например, публикации Novina, C. D. & Sharp, P., Nature 2004, 430:161, и Sandy, P., et al., Biotechniques 2005, 39:215, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Грипп является одним из наиболее широко распространенных инфекционных заболеваний во всем мире. Это может показаться невероятным, но, по оценкам специалистов, в 1918 году при пандемии гриппа, вызванного вирусом штамма А, умерло от 20 до 40 миллионов человек. В Соединенных Штатах ежегодно от гриппа, вызываемого вирусом штамма А, или от его осложнений умирает от 20 до 40 тысяч человек. Во время эпидемий только за одну зиму число случаев госпитализаций по поводу гриппа может достигать 300000.

Эпидемиологическому распространению вируса гриппа благоприятствуют некоторые свойства этого вируса. Во-первых, он легко передается от человека к человеку воздушно-капельным путем (воздушно-капельная инфекция). Во-вторых, в антигенах вируса гриппа часто возникают небольшие изменения (антигенный дрейф), в результате чего этот вирус легко “ускользает” от иммунного “надзора”, индуцированного предварительным воздействием другого варианта этого вируса. В-третьих, благодаря реассортации или смешиванию генетического материала различных штаммов (антигенный дрейф) могут легко продуцироваться новые штаммы вируса гриппа. В случае вируса гриппа А такое смешивание может происходить между подтипами или штаммами, которые поражают организмы различных видов. Считается, что пандемия 1918 года была вызвана возникновением гибридного штамма вируса, продуцированного в результате реассортации свиного и человеческого вируса гриппа А. В настоящее время существует большая опасность возможного распространения новых штаммов гриппа, являющихся инфекционными для человека, в частности, вариантов птичьего гриппа, а более конкретно штамма H5N1, которые образуются в результате смешивания человеческого и птичьего вирусов при одновременном их воздействии на человека. Эксперты уже не ставят под сомнение тот факт, что тесный контакт между домашней птицей и птицеводами, существующий во многих странах Азии, приведет к возникновению такого смешанного штамма, и они убеждены, что это лишь вопрос времени. При быстром развитии такой пандемии во всем мире ее последствия могут быть гораздо серьезнее, чем в 1918 году.

Несмотря на огромные усилия, предпринимаемые в настоящее время, пока еще не были разработаны эффективные способы лечения инфекций, вызываемых вирусом гриппа, а действие уже существующих вакцин ограничено отчасти их склонностью к антигенной изменчивости и антигенному дрейфу, как указывается выше. По этим причинам глобальные исследования вируса гриппа А продолжаются уже в течение многих лет, и Национальный институт здоровья США назвал эти исследования одним из самых приоритетных направлений в борьбе против вирусных патогенов. Хотя современные вакцины, которые были получены на основе инактивированных вирусов, способны предупреждать заболевание примерно у 70-80% здоровых индивидуумов в возрасте до 65 лет, однако у индивидуумов более старшего возраста или у индивидуумов с нарушенным иммунитетом этот процент гораздо ниже. Кроме того, высокая стоимость этих вакцин и возможные побочные эффекты, ассоциированные с введением этих вакцин, снижают эффективность таких вакцин до уровня ниже оптимального. Хотя современные противовирусные лекарственные средства, разрешенные для применения в Соединенных Штатах, являются эффективными для лечения и/или профилактики гриппа, однако они находят ограниченное применение из-за побочных эффектов, неудобства их употребления пациентом и возможного возникновения резистентных штаммов.

В заявке на патент США 20040242518 и в соответствующей заявке WO 04/028471, поданных 29 сентября 2003 г., предлагается небольшое число РНКи-агентов для лечения гриппа. Однако их эффективность для человека не описана.

Поэтому необходимость в разработке эффективной терапии, направленной на лечение и предупреждение инфекций, вызываемых вирусом гриппа у человека и животных, а в частности высокоэффективной терапии, направленной на уничтожение подтипов вируса гриппа широкого ряда, остается актуальной. Одним из необходимых условий высокой эффективности терапии является медленное разложение активного ингредиента в физиологических условиях.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении in vitro и in vivo того факта, что инфекция, вызываемая вирусом гриппа, может быть ингибирована путем интраназального введения иРНК-агентов, а также путем парентерального введения таких агентов и идентификации эффективных иРНК-агентов, которые происходят от генов MP, NP, PB1, PB2 или PA вируса гриппа и которые могут снижать уровни РНК вируса гриппа некоторых подтипов. На основании этого было разработано настоящее изобретение, которое относится к конкретным композициям и к способам, применяемым для снижения уровней мРНК вируса гриппа, уровней белка вируса гриппа и титров вируса гриппа у индивидуума, например у млекопитающего, такого как человек.

Настоящее изобретение, в частности, относится к иРНК-агентам, включающим либо состоящим или, в основном, состоящим из них, по меньшей мере, 15 или более смежных нуклеотидов одного из генов вируса гриппа, а в частности генов MP, NP, PB1, PB2 и PA вируса гриппа, а более конкретно к агентам, содержащим 15 или более смежных нуклеотидов одной из последовательностей, представленных в таблицах 1A-1H. иРНК-агент, предпочтительно, содержит менее чем 30 нуклеотидов на цепь, например 21-23 нуклеотида, таких как нуклеотиды, описанные в таблицах 1А-1Н. Двухцепочечный иРНК-агент либо может иметь тупые концы, либо он может, что предпочтительно, иметь выступающие концы, состоящие из 1-4 нуклеотидов, расположенных со стороны одного или обоих 3'-концов этого агента.

Кроме того, иРНК-агент может содержать либо только природные рибонуклеотидные субъединицы, либо он может быть синтезирован так, чтобы он содержал одну или несколько модификаций сахара или оснований в одной или в нескольких рибонуклеотидных субъединицах, включенных в этот агент. иРНК-агент может быть дополнительно модифицирован так, чтобы он был присоединен к лиганду, выбранному в целях повышения стабильности, распределения или поглощения вещества, например холестерина, в клетках. иРНК-агенты могут быть также получены в отдельной форме либо они могут быть частью фармацевтической композиции, используемой в описанных здесь способах, а в частности в фармацевтической композиции, предназначенной для доставки в легкие или в носовые ходы или для парентерального введения. Такие фармацевтические композиции могут содержать один или несколько иРНК-агентов, а в некоторых вариантах изобретения они могут содержать два или более иРНК-агентов, каждый из которых направлен на различные сегменты гена вируса гриппа или на различные гены вируса гриппа.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к двухцепочечному олигонуклеотиду, содержащему, по меньшей мере, одно неприродное нуклеотидное основание. В некоторых вариантах изобретения таким неприродным нуклеотидным основанием является дифтортолил, нитроиндолил, нитропирролил или нитроимидазолил. В предпочтительном варианте изобретения таким неприродным нуклеотидным основанием является дифтортолил. В некоторых вариантах изобретения только одна из двух олигонуклеотидных цепей, включающих двухцепочечный олигонуклеотид, содержит неприродное нуклеотидное основание. В некоторых вариантах изобретения обе олигонуклеотидные цепи, включающие двухцепочечный олигонуклеотид, независимо друг от друга содержат неприродное нуклеотидное основание.

Настоящее изобретение также относится к способам снижения уровня РНК вируса гриппа в клетке. Такие способы включают стадию введения одного из иРНК-агентов согласно изобретению индивидууму, подробно описанную ниже. В способах согласно изобретению используются клеточные механизмы, участвующие в интерференции РНК, приводящей к селективному разрушению вирусной РНК в клетке, и такие способы включают стадию контактирования клетки с одним из антивирусных иРНК-агентов согласно изобретению. Такие способы могут быть осуществлены непосредственно на клетках, либо они могут быть осуществлены путем введения индивидууму-млекопитающему одного из таких средств, как иРНК-агенты/фармацевтические композиции согласно изобретению. Снижение уровня вирусной РНК в клетке приводит к уменьшению количества продуцируемого вирусного белка, а в организме индивидуума - к снижению титра реплицирующегося вируса (как показано в примерах).

Способы и композиции согласно изобретению, например способы, в которых используется иРНК-агент, и композиции, содержащие иРНК-агент, могут быть применены в любой из описанных здесь лекарственных форм и/или препаратов, и такие формы и препараты могут быть также введены любым из описанных здесь способов. Особенно важным аспектом настоящего изобретения является интраназальное введение иРНК-агента и его способность ингибировать репликацию вируса в тканях дыхательных путей.

Подробное описание одного или нескольких вариантов осуществления настоящего изобретения приводится ниже в описании графического материала и в описании изобретения. Другие признаки, цели и преимущества изобретения будут более очевидны из описания изобретения, из графического материала и из формулы изобретения. Все цитируемые здесь работы, патенты и патентные заявки во всей своей полноте и во всех целях вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1A-1I: Кривые “доза-ответ”, иллюстрирующие ингибирование экспрессии гена-мишени с использованием выбранных РНКи-агентов. Соответствующий ген-мишень рекомбинантно клонировали в плазмиде в клетки Cos-7, что приводило к экспрессии мРНК, кодирующей ген-мишень и люциферазу Renilla, а затем эти клетки обрабатывали РНКи-агентом и определяли количество люциферазы Renilla. Клетки обрабатывали РНКи-агентом при концентрациях 100 нМ, 25 нМ, 6,3 нМ, 1,6 нМ, 400 пМ, 100 пМ, 24 пМ, 6 пМ, 1,5 пМ и 380 фМ и величины IC₅₀ определяли путем построения параметрической кривой с помощью программы XLfit.

Подробное описание изобретения

Используемый здесь термин “вирус гриппа” означает любой штамм вируса гриппа, который способен вызывать заболевание у животных или человека или который представляет интерес как кандидат для экспериментального анализа. Вирусы гриппа описаны в публикациях Fields, B., et al., Fields' Virology, 4^th ed. 2001, Lippincott Williams and Wilkins; Philadelphia, ISBN: 0781718325. В частности, этот термин включает любой штамм вируса гриппа А, который способен вызывать заболевание у животного или человека или который представляет интерес как кандидат для экспериментального анализа. Было частично или полностью секвенировано большое число изолятов вируса гриппа А. В таблице 6 представлен лишь неполный список полноразмерных последовательностей сегментов генома вируса гриппа А, которые были депонированы в общедоступной базе данных (база данных последовательностей вируса гриппа (ISD), см. Macken, C, Lu, H., Goodman, J., & Boykin, L., "The value of a database in surveillance and vaccine selection." in Options for the Control of influenza IV. A. D. M. E. Osterhaus, N. Cox & A. W. Hampson (Eds.) 2001, Elsevier Science, Amsterdam, pp 103-106). Эта база данных также содержит полноразмерные последовательности сегментов генома вируса гриппа B и C. Указанная база данных имеется в Интернете и включает удобный механизм поиска, который позволяет пользователю осуществлять поиск по сегментам генома, по видам, инфицированным вирусом, и по году выделения штамма. Последовательности вируса гриппа также имеются в базе данных Genbank. Поэтому последовательности генов вируса гриппа являются легко доступными для среднего специалиста в данной области, либо они могут быть легко определены специалистом.

Для лучшего понимания используемых здесь терминов “нуклеотид" или “рибонуклеотид" следует отметить, что иногда эти термины применяются к одной или нескольким мономерным субъединицам РНК-агента. Кроме того, следует отметить, что используемый здесь термин “рибонуклеотид" или “нуклеотид", в том случае, если он относится к модифицированной РНК или нуклеотидному заменителю, также означает модифицированный нуклеотид или заменяющую его часть, подробно описанную ниже, в одном или нескольких положениях.

Используемый здесь термин “РНК-агент" означает немодифицированную РНК, модифицированную РНК или нуклеозидную замену, каждая из которых описана в настоящей заявке и хорошо известна специалистам в области синтеза РНК. Хотя в настоящей заявке описано множество модифицированных РНК и нуклеозидных замен, однако предпочтительными примерами являются молекулы, которые обладают большей резистентностью к расщеплению нуклеазой, чем немодифицированные РНК. Предпочтительными примерами являются молекулы, имеющие модификацию в 2'-положении сахара, модификацию в одноцепочечном выступающем конце, а в частности в одноцепочечном выступающем 3'-конце, или, в случае одноцепочечной молекулы, 5'-модификацию, которая включает одну или несколько фосфатных групп или один или несколько аналогов фосфатной группы.

Используемый здесь термин “иРНК-агент" (данное сокращение означает “интерферирующий РНК-агент") означает РНК-агент, который может ингибировать экспрессию гена-мишени, например, вируса гриппа. Не ограничиваясь какой-либо теорией, следует отметить, что иРНК-агент может действовать по одному или нескольким механизмам, включая посттранскрипционное расщепление мРНК-мишени, иногда называемое специалистами РНКи, или по претранскрипционным или претрансляционным механизмам. иРНК-агент может представлять собой двухцепочечный иРНК-агент.

Используемый здесь термин “дц-иРНК-агент" (данное сокращение означает “двухцепочечный иРНК-агент") представляет собой иРНК-агент, имеющий более чем одну, а предпочтительно две цепи, в которых межцепьевая гибридизация может приводить к образованию области с дуплексной структурой. Используемый здесь термин “цепь” означает последовательность из смежных нуклеотидов (включая неприродные или модифицированные нуклеотиды). Такие две цепи или несколько цепей могут представлять собой отдельные молекулы, либо каждый из них может быть частью отдельных молекул, либо они могут быть ковалентно связаны между собой, например, посредством линкера, такого как полиэтиленгликолевый линкер, с образованием одной молекулы. По меньшей мере, одна цепь может включать область, которая является в достаточной степени комплементарной РНК-мишени. Такая цепь называется “антисмысловой цепью”. Вторая цепь дцРНК-агента, содержащая область, комплементарную антисмысловой цепи, называется “смысловой цепью”. Однако дц-иРНК-агент может быть также образован из одной молекулы РНК, которая является по меньшей мере частично аутокомплементарной, образуя, например, шпилечную структуру или структуру, которая по своей форме напоминает “ручку сковородки” и включает область дуплекса. Последнюю из упомянутых выше структур называют короткой шпилечной РНК или кшРНК. В этом случае термин “цепь” означает одну из областей РНК-молекул, которая комплементарна другой области той же самой молекулы РНК.

В клетках млекопитающих длинные двухцепочечные иРНК-агенты могут индуцировать интерфероновый ответ, который часто является нежелательным, однако короткие двухцепочечные иРНК-агенты не индуцируют интерфероновый ответ, по меньшей мере, на таком уровне, который мог бы негативно воздействовать на клетки и/или на организм хозяина (Manche et al., Mol. Cell. Biol. 12:5238, 1992; Lee et al., Virology 199:491, 1994; Castelli et al., J. Exp. Med. 186:967, 1997; Zheng et al., RNA 10:1934, 2004; Heidel et al., "Lack of interferon response in animals to naked siRNAs" Nature Biotechn. advance online publication doi:10.1038/nbtl038, Nov. 21, 2004). иРНК-агенты согласно изобретению включают молекулы, которые являются достаточно короткими, то есть они не способны индуцировать нежелательный неспецифический интерфероновый ответ в нормальных клетках млекопитающих. Так, например, введение индивидууму композиции, включающей иРНК-агент (например, приготовленной, как описано в настоящей заявке), может быть осуществлено в целях снижения уровня экспрессии генов вируса гриппа в клетках, экспрессирующих вирус гриппа у индивидуума, что позволяет избежать вырабатывания интерферонового ответа. Молекулы, которые являются достаточно короткими и не способны индуцировать нежелательный интерфероновый ответ, называются здесь киРНК-агентами или киРНК. Используемый здесь термин “киРНК-агент" или “киРНК" означает иРНК-агент, например дц-иРНК-агент, который является достаточно коротким и не способен индуцировать нежелательный интерфероновый ответ в клетках млекопитающих, а в частности в клетках человека, например, он имеет дуплексную область, содержащую менее чем 60, а предпочтительно менее чем 50, 40 или 30 пар нуклеотидов.

Описанные здесь выделенные иРНК-агенты, включая дц-иРНК-агенты и киРНК-агенты, могут опосредовать снижение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты вируса гриппа, например, посредством разрушения РНК. Для удобства такая РНК будет здесь также называться молчащей РНК. Такая нуклеиновая кислота также называется здесь геном-мишенью. Предпочтительно, молчащая РНК представляет собой генный продукт гена вируса гриппа, который является частью штамма вируса гриппа, патогенного для человека.

Используемый здесь термин “опосредует РНКи" означает способность данного агента к последовательность-специфической инактивации гена-мишени. Термин “сайленсинг гена-мишени” означает процесс, при котором клетка, содержащая и/или экспрессирующая определенный продукт гена-мишени, в том случае, когда она вступает в контакт с данным агентом, будет содержать и/или экспрессировать, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% или менее указанного генного продукта по сравнению с аналогичной клеткой, которая не контактировала с данным агентом. Указанный продукт гена-мишени может представлять собой, например, матричную РНК (мРНК), белок или регуляторный элемент.

Используемый здесь термин “комплементарный” указывает на достаточную степень комплементарности, то есть на осуществление стабильного и специфического связывания соединения согласно изобретению с РНК-молекулой-мишенью, например мРНК вируса гриппа. Для специфического связывания необходима достаточная степень комплементартности, что позволяет избежать неспецифического связывания олигомерного соединения с последовательностями, не являющимися мишенями, в условиях, при которых желательно специфическое связывание, а именно в физиологических условиях, во время проведения in vivo анализов или терапевтического лечения, или во время осуществления in vitro анализов в условиях, при которых проводят такие анализы. Не являющиеся мишенями последовательности обычно отличаются от последовательностей-мишеней, по меньшей мере, на 2, 3 или 4 нуклеотида.

Используемый здесь иРНК-агент является “достаточно комплементарным” РНК-мишени, например мРНК-мишени (например, мРНК-мишени вируса гриппа), если такой иРНК-агент способствует снижению уровня продуцирования белка, кодируемого РНК-мишенью в клетке. Такой иРНК-агент может быть также “абсолютно комплементарным” РНК-мишени, например РНК-мишени, и такой иРНК-агент гибридизуется, предпочтительно, с образованием гибрида, состоящего исключительно из пар оснований Уотсона-Крика в области абсолютной комплементарности. “Достаточно комплементарный” иРНК-агент может включать внутреннюю область (например, по меньшей мере, из 10 нуклеотидов), которая является абсолютно комплементарной РНК-мишени вируса гриппа. Кроме того, в некоторых вариантах изобретения иРНК-агент, в частности, отличается лишь одним нуклеотидом. В этом случае иРНК-агент опосредует РНКи, только если в области (например, из 7 нуклеотидов), отличающейся одним нуклеотидом, имеет место абсолютная комплементарность. Предпочтительные иРНК-агенты созданы на основе смысловых и антисмысловых последовательностей, представленных в таблицах 1A-1H, либо они состоят из этих последовательностей или включают эти последовательности.

Используемый здесь термин “по существу идентичный”, если он используется при сравнении первой нуклеотидной последовательности со второй нуклеотидной последовательностью, означает, что первая нуклеотидная последовательность идентична второй нуклеотидной последовательности, за исключением одной, двух или трех нуклеотидных замен (например, аденозин заменен урацилом). Используемое здесь выражение “по существу сохраняет способность ингибировать экспрессию вируса гриппа в культивированных клетках, экспрессирующих человеческий вирус гриппа”, если оно относится к иРНК-агенту, который не является идентичным одному из иРНК-агентов, указанных в таблицах 1A-1H, но происходит от одного из таких иРНК-агентов, указанных в таблицах 1A-1H, вследствие делеции, добавления или замены нуклеотидов, означает, что такой производный иРНК-агент обладает ингибирующей активностью, составляющей не менее чем 20% от ингибирующей активности ИРНК-агента, представленного в таблицах 1A-1H, от которого он происходит. Так, например, иРНК-агент, происходящий от иРНК-агента, представленного в таблицах 1А-1Н и на 70% снижающего количество мРНК вируса гриппа, присутствующего в культивированных человеческих клетках, инфицированных вирусом гриппа, сам может снижать количество мРНК вируса гриппа, присутствующей в культивированных человеческих клетках, инфицированных вирусом гриппа, по меньшей мере, на 50%, что означает, что он, по существу, сохраняет способность ингибировать репликацию вируса гриппа в культивированных человеческих клетках, инфицированных вирусом гриппа. иРНК-агент согласно изобретению может, но необязательно, снижать количество мРНК вируса гриппа, присутствующее в культивированных человеческих клетках, инфицированных вирусом гриппа, по меньшей мере, на 50%.

Используемый здесь термин “индивидуум” означает млекопитающее, подвергаемое лечению расстройства, опосредуемого инфицированием вирусом гриппа. Таким индивидуумом может быть любое млекопитающее, такое как корова, лошадь, мышь, крыса, собака, свинья, коза или примат. В предпочтительном варианте изобретения указанным индивидуумом является человек.

Свойства вируса гриппа

Вирусы гриппа представляют собой вирусы, имеющие оболочку и минус-цепь РНК и принадлежащие к семейству Ортомиксовирусов. Они подразделяются на подтипы A, B и C, из которых вирус гриппа А является наиболее патогенным и, вероятно, представляет собой один тип, способный подвергаться реассортации (перетасовке) со штаммами животных. Вирусы гриппа A, B и C могут отличаться друг от друга по их нуклеопротеинам и матриксным белкам. Как обсуждается ниже, подтипы вируса гриппа А определяются по отличию их генов гемаглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) и обычно идентифицируются по антителам, которые связываются с соответствующими белками.

Геном вируса гриппа A состоит из десяти генов, расположенных в восьми РНК-сегментах. Эти гены кодируют 10 белков: гликопротеины оболочки: гемаглютинин (HA) и нейраминидазу (NA); матриксный белок (обозначаемый здесь M1 или MP); нуклеопротеин (NP); три полимеразы (PB1, PB2 и PA), которые являются компонентами РНК-зависимой РНК-транскриптазы, также называемой здесь полимеразой или полимеразным комплексом; белок ионных каналов (M2) и неструктурные белки (NS1 и NS2). Более подробное описание вируса гриппа А и его молекулярного патогенеза можно найти в публикации Julkunen, I., et al., Cytokine and Growth Factor Reviews, 12: 171-180, 2001. См. также Fields, B., et al., Fields' Virology, 4.sup.th. ed., Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; ISBN: 0781718325, 2001. Организация генома вируса гриппа В очень похожа на организацию генома вируса гриппа А, а геном вируса гриппа С содержит семь РНК-сегментов и не содержит гена NA.

Классификацию вирусов гриппа A проводят на основе генов гемаглютинина (H1-H15) и нейраминидазы (N1-N9). В соответствии с номенклатурой, принятой Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), каждый штамм вируса идентифицируется по животному-хозяину, которое он инфицирует (обычно человек, если это не оговорено особо); географическому региону, в котором он был обнаружен; числу штаммов; году выделения; и по антигенным свойствам HA и NA. Так, например, A/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) означает штамм А, изолят 8, обнаруженный у человека в Пуэрто-Рико в 1934 году и имеющий антигены HA и NA подтипа 1. В другом примере A/куры/Гонконг/258/97 (H5N1) означает штамм А, изолят 258, обнаруженный у кур в Гонконге в 1997 г. и имеющий антиген HA подтипа 5 и антиген NA подтипа 1. Эпидемия у людей была вызвана вирусами, имеющими HA типов H1, H2 и H3 и NA типов N1 и N2.

Как упоминалось выше, генетические изменения в вирусе гриппа А происходят по двум основным механизмам. Антигенный дрейф происходит в результате точковых мутаций, которые часто возникают в антиген-специфических положениях вследствие давления отбора, вследствие иммунных ответов у хозяина и вследствие антигенной изменчивости (также называемой реассортацией), обусловленной заменой целого сегмента вирусного генома одного подтипа на сегмент другого подтипа. Многие различные типы животных, включая человека, свиней, птиц, лошадей, водных млекопитающих и т.п., могут быть инфицированы вирусами гриппа А. Некоторые вирусы гриппа A инфицируют животных конкретных видов и обычно не инфицируют животных других видов. Однако некоторые вирусы гриппа А могут инфицировать животных нескольких различных видов, главным образом птиц (в частности, перелетных водоплавающих птиц), свиней и человека. Считается, что такое свойство этого вируса ответственно за основную антигенную изменчивость вируса гриппа А. Так, например, было высказано предположение, что свинья инфицируется вирусом гриппа А, передаваемым от человека, и одновременно инфицируется другим вирусом гриппа А, передаваемым от уток. Если эти два различных вируса репродуцируются в клетках свиней, то гены человеческого и утиного штаммов могут “смешиваться”, что может приводить к образованию нового вируса с уникальной комбинацией РНК-сегментов. Этот процесс называется генетической реассортацией. (Следует отметить, что такой тип генетической реассортации отличается от изменения генетической информации, которое происходит между хромосомами в процессе мейоза).

Вирусы гриппа, подобно другим вирусам и некоторым бактериальным вирусам, реплицируются внутри клеток. Вирусы гриппа А реплицируются в эпителиальных клетках верхних дыхательных путей. Однако этим вирусом могут также инфицироваться моноциты/макрофаги и другие лейкоциты. Множество других клеток с поверхностными гликопротеинами, содержащими сиаловую кислоту, являются восприимчивыми к инфицированию in vitro, поскольку вирус использует эти молекулы в качестве рецептора.

Конструирование и отбор иРНК-агентов

Используемый здесь термин “расстройства, ассоциированные с экспрессией вируса гриппа” означает любое биологическое или патологическое состояние, (1) которое опосредуется, по меньшей мере, частично, присутствием вируса гриппа и (2) на исход которого влияет снижение уровня присутствующего вируса гриппа. Конкретные расстройства, ассоциированные с экспрессией вируса гриппа, приводятся ниже.

Настоящее изобретение основано на конструировании, синтезе и продуцировании иРНК-агентов, которые нацелены на гены вируса гриппа, и на выявление сайленсинга вирусного гена in vitro в культивированных клетках после их инкубирования с иРНК-агентом, а также на обеспечение защиты от инфекции, вызываемой вирусом гриппа.

иРНК-агент может быть соответствующим образом сконструирован, исходя из информации о последовательности и нужных свойствах этого агента. Так, например, иРНК-агент может быть сконструирован с учетом относительной температуры плавления дуплекса-кандидата. Обычно такой дуплекс должен иметь более низкую температуру плавления у 5'-конца, чем у 3'-конца антисмысловой цепи.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим киРНК и/или кшРНК, направленные на один или несколько транскриптов вируса гриппа. Как продемонстрировано выше в описании репликативного цикла вируса гриппа, в клетках, инфицированных вирусом гриппа, присутствуют различные типы вирусных РНК-транскриптов (первичная и вторичная вирусная РНК (вРНК), первичная и вторичная вирусная мРНК и вирусная кРНК), и эти вирусные транскрипты играют важную роль в жизненном цикле вируса. Любые из этих транскриптов являются соответствующими мишенями для киРНК-опосредуемого ингибирования по прямому или опосредуемому механизму, описанному в настоящем изобретении. киРНК и кшРНК, которые нацелены на любой вирусный МРНК-транскрипт, будут специфически и непосредственно снижать уровень самого транскрипта, то есть посредством инициации деградации транскрипта. Кроме того, как обсуждается ниже, киРНК и кшРНК, которые направлены на некоторые вирусные транскрипты (например, MP, PA, PB1), будут вызывать опосредуемое снижение уровней вирусных транскриптов, по отношению к которым они не являются специфическими. В случаях, когда возможен альтернативный сплайсинг, как в случае мРНК, кодирующей MP и M2, и мРНК, кодирующей NS1 и NS2, в качестве транскрипта-мишени может служить несплайсированный или сплайсированный транскрипт.

Потенциальными вирусными транскриптами, которые могут служить в качестве мишени для терапии на основе РНКи согласно изобретению, являются, например, 1) любой геномный сегмент вируса гриппа; 2) транскрипты, кодирующие любые вирусные белки, включая транскрипты, кодирующие белки PB1, PB2, PA, NP, NS1, NS2, MP, M2, HA или NA. Следует отметить, что одна из киРНК или кшРНК может быть направлена на транскрипты в форме вРНК, кРНК, и/или мРНК. Однако, по мнению Ge et al., WO 04/028471, такой вирусной мРНК может быть единственная или первичная мишень РНКи.

Для любого конкретно выбранного гена-мишени конструирование киРНК или кшРНК в целях их использования в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно, осуществляют в соответствии с некоторыми критериями. Вообще говоря, желательными являются последовательности-мишени, которые специфичны для данного вируса (по сравнению с последовательностями, специфичными для хозяина) и которые, предпочтительно, играют важную или главную роль в функционировании вируса. Хотя некоторые вирусные гены, особенно гены, кодирующие HA и NA, характеризуются высоким уровнем мутации и толерантны к мутациям, однако некоторые их области и/или последовательности имеют тенденцию к сохранению консервативности. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, такие последовательности могут быть особенно подходящими мишенями. Как будет подробно описано ниже, такие консервативные области могут быть идентифицированы, например, путем поиска в литературе и/или путем сравнения с генными последовательностями вируса гриппа, имеющимися в базах данных, большое число которых является общедоступным. Кроме того, во многих случаях агент, доставляемый в клетку в соответствии с настоящим изобретением, может подвергаться одной или нескольким стадиям процессинга с образованием активного супрессорного агента (как подробно обсуждается ниже); причем в таких случаях для каждого среднего специалиста в данной области очевидно, что подходящий агент, может быть предпочтительно сконструирован так, чтобы он включал последовательности, которые могут оказаться необходимыми для его процессинга. Одним из аспектов настоящего изобретения является распознавание, которое, в случае присутствия множества штаммов, подтипов и т.п. (называемых общим термином варианты) существующих инфекционных агентов с варьирующимися последовательностями геномов, часто оказывается желательным для отбора и/или конструирования киРНК и кшРНК, направленных на области, которые являются в высокой степени консервативными у различных вариантов. В частности, путем сравнения достаточного числа последовательностей и отбора высококонсервативных областей можно получить множество вариантов с одной киРНК, дуплексная часть которых включает такую высококонсервативную область. Вообще говоря, длина каждой области должна быть такой, чтобы она включала всю дуплексную часть киРНК (например, 19 нуклеотидов) и необязательно один или несколько выступающих 3'-концов, хотя могут быть также использованы области, длина которых короче длины полноразмерного дуплекса (например, 15, 16, 17 или 18 нуклеотидов). В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, область является высококонсервативной для множества вариантов, если она идентична для всех этих вариантов. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, область (независимо от длины дуплексной части киРНК, например, 15, 16, 17, 18 или, предпочтительно, 19 нуклеотидов) является высококонсервативной, если она отличается, самое большее, на один нуклеотид (то есть 0 или 1 нуклеотид) у различных вариантов. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, такая область является высококонсервативной для множества вариантов, если она отличается, самое большее, на два нуклеотида (то есть 0, 1 или 2 нуклеотида) у различных вариантов. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, область является высококонсервативной для множества вариантов, если она отличается, самое большее, на три нуклеотида (то есть 0, 1, 2 или 3 нуклеотида) для различных вариантов. В соответствии с некоторыми вариантами изобретения, киРНК включает дуплексную часть, которая направлена на область, являющуюся высококонсервативной, по меньшей мере, у 5 вариантов, по меньшей мере, 15 вариантов, по меньшей мере, 20 вариантов, по меньшей мере, 25 вариантов, по меньшей мере, 30 вариантов, по меньшей мере, 40 вариантов, по меньшей мере, 50 вариантов или более.

Для того чтобы определить, является ли область высококонсервативной для ряда вариантов, может быть проведена нижеследующая процедура. Один член ряда последовательностей отбирают как базовую последовательность, то есть последовательность, с которой сравнивают другие последовательности. Обычно длина базовой последовательности имеет длину, желательную для дуплексной части киРНК, например 15, 16, 17, 18 или, предпочтительно, 19 нуклеотидов. В соответствии с различными вариантами изобретения, базовой последовательностью может быть любая одна из последовательностей в наборе сравниваемых последовательностей, либо такой последовательностью может быть происходящая от нее консенсусная последовательность, например, выбранная путем определения каждого положения для каждого нуклеотида, где данный нуклеотид наиболее часто встречается в данном положении в наборе сравниваемых последовательностей.

После отбора базовой последовательности последовательность каждого члена набора из множества вариантов сравнивают с этой базовой последовательностью. Для того чтобы определить, является ли базовая последовательность высококонсервативной в конкретной пр