2448979 - Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека

Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к биохимии. Описано выделенное антитело человека или фрагмент антитела, которые специфическим образом связывают дельта-подобный лиганд-4 человека (hDII4), указанное антитело человека или фрагмент антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую три определяющие комплементарность области (CDR) тяжелой цепи, и вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую три CDR легкой цепи, где указанные три CDR тяжелой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:429 или SEQ ID NO:901, а указанные три CDR легкой цепи содержат CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности SEQ ID NO:437 или SEQ ID NO:903, и где указанное антитело или его фрагмент связывается с эпитопом в пределах N-концевого-DSL домена hDII4. Описана выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая описанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Представлены вектор экспрессии, содержащий описанную молекулу нуклеиновой кислоты, и система «хозяин-вектор» для получения описанного антитела. Представлен способ получения описанного антитела против DII4 человека или его антиген-связывающего фрагмента. Описана композиция для облегчения течения или ингибирования заболевания или расстройства человека, опосредованного DII4, содержащая описанное антитело или его фрагмент. 7 н. и 15 з.п. ф-лы, 16 табл., 9 пр.

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Notch-сигнальный путь представляет собой систему передачи информации между клетками, используемый широким спектром эукариот во многих биологических процессах, в том числе клеточной дифференциации, пролиферации и гомеостаза. Дельта-подобный 4 (Dl4) или дельта-подобный лиганд-4 (Dll4), далее именуемый “Dll4”) входит в дельта-семейство Notch-лигандов и с высокой селективностью экспрессируется сосудистым эндотелием (Shutter et al. (2000) Genes Develop. 14:1313-1318). Dll4 выполняет функции лиганда для Notch-рецепторов, в том числе рецепторов Notch-1 и Notch-4. Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности для Dll4 человека приведены в последовательностях SEQ ID №: 1-2 соответственно.

Способы получения антител, полезных в качестве лекарственных препаратов для человека, включают производство химерных антител и гуманизированных антител (см., например, патент US 6949245). См., например, WO 94/02602 (Abgenix) и патент US 6596541 (Regeneron Pharmaceuticals), где описаны способы создания не относящихся к человеку трансгенных мышей, способных производить антитела человека.

В заявке на патент Японии 2003/047470A2 (Asahi Kasei Kogyo) описаны антитела к внеклеточной части белка Notch-лиганда человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к антителам человека, предпочтительно рекомбинантным антителам человека, которые специфически связывают дельта-подобный лиганд-4 человека (hDll4). Для этих антител характерно связывание с hDll4 с высокой аффинностью и способность нейтрализовать активность Dll4. Антитела по изобретению способны блокировать связывание Dll4 с Notch-рецептором (рецепторами) и тем самым ингибировать передачу сигнала через Dll4. Антитела могут быть полноразмерными (например, антитела IgG1 или IgG4) или включать только антиген-связывающую часть (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv) и могут быть модифицированы с целью воздействовать на функциональность, например удалять остаточные эффекторные функции (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 и 947, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения HCVR является аминокислотной последовательностью SEQ ID №: 429 или 901.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 и 949, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения LCVR является аминокислотной последовательностью SEQ ID №: 437 или 903.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит HCVR, выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372, 397, 413, 429, 445, 461, 477, 493, 509, 525, 541, 557, 573, 589, 605, 621, 637, 653, 669, 685, 701, 717, 733, 749, 765, 781, 797, 813, 893, 897, 901, 905, 909, 913, 917, 921, 925, 935, 939, 943 и 947, или ее существенно идентичную последовательность, и LCVR, выбранную из группы, включающей SEQ ID №: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380, 405, 421, 437, 453, 469, 485, 501, 517, 533, 549, 565, 581, 597, 613, 629, 645, 661, 677, 693, 709, 725, 741, 757, 773, 789, 805, 821, 895, 899, 903, 907, 911, 915, 919, 923, 927, 937, 941, 945 и 949, или ее существенно идентичную последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения HCVR/LCVR являются парами аминокислотной последовательности SEQ ID №: 429/437 или 901/903.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 1 (CDR1) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711, 719, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 и 879, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 2 (CDR2) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 и 881, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится определяющая комплементарность область 3 (CDR3) тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 и 883, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278 294, 310, 326, 342, 358, 374, 399, 415, 431, 447, 463, 479, 495, 511, 527, 543, 559, 575, 591, 607, 623, 639, 655, 671, 687, 703, 711, 719, 735, 751, 767, 783, 799, 815, 831, 847, 863 и 879, или ее существенно идентичная последовательность; CDR2 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376, 401, 417, 433, 449, 465, 481, 497, 513, 529, 545, 561, 577, 593, 609, 625, 641, 657, 673, 689, 705, 721, 737, 753, 769, 785, 801, 817, 833, 849, 865 и 881, или ее существенно идентичная последовательность; и CDR3 тяжелой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 403, 419, 435, 451, 467, 483, 499, 515, 531, 547, 563, 579, 595, 611, 627, 643, 659, 675, 691, 707, 723, 739, 755, 771, 787, 803, 819, 835, 851, 867 и 883, или ее существенно идентичная последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, выбранные из группы, содержащей SEQ ID №: 431/433/435; 374/376/378; 783/785/787 и 799/801/803.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR2 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 и 889, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 и 891, или ее существенно идентичная последовательность.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382, 407, 423, 439, 455, 471, 487, 503, 519, 535, 551, 567, 583, 599, 615, 631, 647, 663, 679, 695, 711, 727, 743, 759, 775, 791, 807, 823, 839, 855, 871 и 887, или ее существенно идентичная последовательность; CDR2 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384, 409. 425, 441, 457, 473, 489, 505, 521, 537, 553, 569, 585, 601, 617, 633, 649, 665, 681, 697, 713, 729, 745, 761, 777, 793, 809, 825, 841, 857, 873 и 889, или ее существенно идентичная последовательность; и CDR3 легкой цепи, выбранная из группы, включающей SEQ ID №: 18, 34, 50, 66, 82, 98, 11, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 411, 427, 443, 459, 475, 491, 507, 523, 539, 555, 571, 587, 603, 619, 635, 651, 667, 683, 699, 715, 731, 747, 763, 779, 795, 811, 827, 843, 859, 875 и 891, или ее существенно идентичная последовательность. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, выбранные из группы, содержащей SEQ ID №: 439/441/443; 382/384/386; 791/793/795 и 807/809/811.

Во втором аспекте настоящего изобретения приводятся молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или антиген-связывающие области изобретения. Настоящее изобретение также охватывает рекомбинантные векторы экспрессии, несущие нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, которые кодируют антитела, и клетки-хозяева, в которые включаются такие векторы, а также способы приготовления антител настоящего изобретения путем культивирования клеток-хозяев изобретения.

В одном из осуществлений настоящего изобретения антитело содержит HCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 и 946, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит LCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 и 948, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит HCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 396, 412, 428, 444, 460, 476, 492, 508, 524, 540, 556, 572, 588, 604, 620, 636, 652, 668, 684, 700, 716, 732, 748, 764, 780, 796, 812, 892, 896, 900, 904, 908, 912, 916, 920, 924, 934, 938, 942 и 946, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%, и LCVR, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 404, 420, 436, 452, 468, 484, 500, 516, 532, 548, 564, 580, 596, 612, 628, 644, 660, 676, 692, 708, 724, 740, 756, 772, 788, 804, 820, 894, 898, 902, 906, 910, 914, 918, 922, 926, 936, 940, 944 и 948, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, содержащий CDR2 тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 и 880, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 тяжелой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 и 882, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373, 398, 414, 430, 446, 462, 478, 494, 510, 526, 542, 558, 574, 590, 606, 622, 638, 654, 670, 686, 702, 718, 734, 750, 766, 782, 798, 814, 830, 846, 862 и 878, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; CDR2 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 100, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375, 400, 416, 432, 448, 464, 480, 496, 512, 528, 544, 560, 576, 592, 608, 624, 640, 656, 672, 688, 704, 720, 736, 752, 768, 784, 800, 816, 832, 848, 864 и 880, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; и CDR3 тяжелой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377, 402, 418, 434, 450, 466, 482, 498, 514, 530, 546, 562, 578, 594, 610, 626, 642, 658, 674, 690, 706, 722, 738, 754, 770, 786, 802, 818, 834, 850, 866 и 882, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, содержащей SEQ ID №: 430/432/434; 373/375/377; 782/784/786 и 798/800/802.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, содержащий CDR1 легкой цепи, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 и 886, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR2 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 и 888, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR3 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 и 890, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения приводится антитело человека или фрагмент антитела, в котором содержится CDR1 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381, 406, 422, 438, 454, 470, 486, 502, 518, 534, 550, 566, 582, 598, 614, 630, 646, 662, 678, 694, 710, 726, 742, 758, 774, 790, 806, 822, 838, 854, 870 и 886, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%; CDR2 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383, 408, 424, 440, 456, 472, 488, 504, 520, 536, 552, 568, 584, 600, 616, 632, 648, 664, 680, 696, 712, 728, 744, 760, 776, 792, 808, 824, 840, 856, 872 и 888, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%, и CDR3 легкой цепи, кодируемая нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID №: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369, 385, 410, 426, 442, 458, 474, 490, 506, 522, 538, 554, 570, 586, 602, 618, 634, 650, 666, 682, 698, 714, 730, 746, 762, 778, 794, 810, 826, 842, 858, 874 и 890, или ее существенно аналогичной последовательностью с гомологией не менее 95%. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело или фрагмент антитела содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, кодируемые последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, содержащей SEQ ID №: 438/440/442; 381/383/385; 790/792/794 и 806/808/810.

В третьем аспекте настоящего изобретения приводится выделенное антитело человека или фрагмент антитела, с которым специфическим образом связывается hDll4 человека, и в котором содержатся CDR 1, 2 и 3, выбранные из группы, включающей (a) область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 928), где X¹ - Gly; X² - Phe или Tyr; X³ - Thr; X⁴ - Phe; X⁵ - Ser, Thr или Asn; X⁶ - Ser, Asn или Tyr; X⁷ - Tyr или Phe; и X⁸ - Gly или Ala; (b) область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 929), где X¹ - Ile или Leu; X² - Trp или Ser; X³ - Tyr, Ala или Gly; X⁴ - Asp, Ser или Tyr; X⁵ - Gly или Asp; X⁶ - Ser, Gly, Thr или Val; X⁷ - Asn или Asp; и X⁸- Lys или Arg; (c) область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶(SEQ ID №: 930), где X¹ - Ala или Ser; X² - Arg или Lys; X³ - Asp или Tyr; X⁴ - Ser, Gly или His; X⁵ - Asp, Ala или Trp; X⁶ - Asn или Phe; X⁷ - Tyr, Arg или Lys; X⁸- His или Ser; X⁹ - Gly или Trp; X¹⁰ - Tyr или Phe; X¹¹ - Glu или Asp; X¹²- Gly, His или Pro; X¹³- Tyr, Trp или отсутствует; X¹⁴- Phe или отсутствует; X¹⁵ - Asp или отсутствует; и X¹⁶ - Pro или отсутствует.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело человека или фрагмент антитела содержит последовательности CDR 1, 2 и 3 тяжелой цепи, выбранные из группы, включающей (a) область CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸(SEQ ID №: 928), где X¹ - Gly; X² - Phe; X³ - Thr; X⁴ - Phe; X⁵ - Ser или Asn; X⁶ - Ser или Asn; X⁷ - Tyr или Phe; и X⁸ - Gly или Ala; (b) область CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸ (SEQ ID №: 929), где X¹ - Ile или Leu; X² - Trp или Ser; X³ - Tyr или Gly; X⁴ - Asp или Ser; X⁵ - Gly; X⁶ - Ser, Thr или Val; X⁷ - Asn или Asp; и X⁸- Lys или Arg; (c) область CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹-X¹⁰-X¹¹-X¹²-X¹³-X¹⁴-X¹⁵-X¹⁶ (SEQ ID №: 930), где X¹ - Ala или Ser; X² - Arg или Lys; X³ - Asp; X⁴ - Gly или His; X⁵ - Asp или Ala; X⁶ - Phe; X⁷ - Tyr или Arg; X⁸- Ser; X⁹- Gly; X¹⁰- Tyr; X¹¹ - Glu; X¹²- Gly или His; X¹³- Tyr или Trp; X¹⁴- Phe или отсутствует; X¹⁵ - Asp или отсутствует; и X¹⁶- Pro или отсутствует.

В еще одном варианте осуществления изобретения выделенное антитело человека или фрагмент антитела также содержит (d) область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷ (SEQ ID №: 931), где X¹ - Gln; X² - Ser; X³ - Val; X⁴ - Arg, Ser или Thr; X⁵ - Ser или Gly; X⁶ - Ser или Tyr; и X⁷ - Tyr или отсутствует; (e) область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³ (SEQ ID №: 932), где X¹ - Gly или Asp; X² - Ala или Thr; и X³ - Ser; и (f) область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹ (SEQ ID №: 933), где X¹- Gln; X² - Gln или His; X³ - Tyr, Arg или Ser; X⁴ - Gly, Ser или Ala; X⁵ - Ser, Asn или Phe; X⁶ - Trp или Ser; X⁷ - Pro; X⁸ - Trp, Pro или Arg; и X⁹ - Thr.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения выделенное антитело человека или фрагмент антитела также содержит (d) область CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷ (SEQ ID №: 931), где X¹ - Gln; X² - Ser; X³ - Val; X⁴ - Arg или Ser; X⁵ - Ser; X⁶ - Ser или Tyr; и X⁷ - Tyr или отсутствует; (e) область CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³ (SEQ ID №: 932), где X¹ - Gly или Asp; X² - Ala или Thr; и X³ - Ser; и (f) область CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность формулы X¹-X²-X³-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-X⁸-X⁹ (SEQ ID №: 933), где X¹- Gln; X² - Gln или His; X³ - Tyr или Arg; X⁴ - Gly или Ser; X⁵ - Ser или Asn; X⁶ - Trp или Ser; X⁷ - Pro; X⁸- Pro или Arg; и X⁹ - Thr.

В четвертом аспекте настоящего изобретения приводится полностью человеческое антитело или фрагмент антитела, с которым связывается hDll4 с концентрацией IC₅₀менее 10 нМ, согласно результатам измерения in vitro или анализа блокирования Dll4 на основе ELISA (описано ниже). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения IC₅₀ антитела составляет приблизительно 500 пМ или менее. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения IC₅₀ антитела составляет приблизительно 100 пМ или менее.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения приводится полностью человеческое моноклональное антитело, которое специфическим образом связывает и ингибирует Dll4 человека и имеет IC₅₀ менее или равное приблизительно 150 пМ, 100 пМ, 75 пМ или 50 пМ, согласно результатам измерения биологической активности индуцируемой Notch-рецептором люциферазы с hDll4-Fc. Как показано в разделе примеров ниже, антитела против hDll4 настоящего изобретения не вступают в перекрестную реакцию с близкородственными дельта-белками, такими как hDll1 и hDll3.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу человека или его антиген-связывающей области, которые связывают hDll4 с константой аффинности (K_D) менее чем приблизительно 500 пМ, предпочтительнее менее чем приблизительно 300 пМ, еще предпочтительнее менее чем приблизительно 100 пМ, менее чем приблизительно 50 пМ, менее чем приблизительно 10 пМ, по данным поверхностного плазмонного резонанса (BIACORE™), например, с применением димерного hDll4 (таблица 2).

Настоящее изобретение относится к антителу против hDll4 с модифицированной картиной гликозилирования. В некоторых случаях может оказаться полезным удалить нежелательные сайты гликозилирования или использовать антитело без фукозного фрагмента в олигосахаридной цепи, например для усиления функции антителозависимой клеточно-обусловленной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других вариантах использования может осуществляться модификация галактозилирования, с тем чтобы изменить комплементзависимую цитотоксичность (CDC).

Настоящее изобретение относится к антителам против hDll4, которые связывают конкретные эпитопы hDll4 и способны блокировать биологическую активность hDll4. Внеклеточный домен Dll4 состоит из N-терминального домена, домена Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) и восьми тандемных ЭФР (эпидермальный фактор роста) - подобных повторов. В общем, ЭФР домены находятся примерно в области аминокислотных остатков 218-251 (домен 1), 252-282 (домен 2), 284-322 (домен 3), 324-360 (домен 4) и 362-400 (домен 5), домен DSL - примерно в области аминокислотных остатков 173-217, а N-терминальный домен - примерно в области аминокислотных остатков 27-172 hDll4 (SEQ ID №: 2).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения блокирующее антитело по изобретению связывается с аминокислотными остатками с 27 по 524 последовательности SEQ ID №: 2. В более конкретном варианте осуществления блокирующее антитело по изобретению связывается с эпитопом в N-терминальном-DSL доменах 27-217 последовательности SEQ ID №: 2; в еще более конкретном варианте осуществления блокирующее антитело связывается с эпитопом примерно в области аминокислотных остатков 27-172 (N-терминальный домен) или 173-217 (домен DSL). В другом варианте осуществления блокирующее антитело по изобретению связывается с эпитопом ЭФР-2 примерно в области аминокислотных остатков 252-282 последовательности SEQ ID №: 2.

В пятом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей рекомбинантное антитело против hDll4 человека и приемлемый носитель. Изобретение также включает векторы и состоящие из клеток-хозяев векторы, которые содержат молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитело против hDll4 человека по настоящему изобретению, а также способы получения таких новых антител, заключающиеся в культивировании клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против hDll4 человека по настоящему изобретению или фрагмент такого антитела, в условиях, допускающих продукцию белка и выделение продуцированного таким образом белка.

В шестом аспекте настоящее изобретение относится к способам ингибирования активности hDll4 с помощью приведенного в настоящем изобретении антитела или его антиген-связывающей области. В одном из вариантов осуществления способ включает взаимодействие hDll4 с антителом по настоящему изобретению или его антиген-связывающей областью таким образом, что при этом происходит ингибирование активности hDll4 в результате связи с Notch-рецептором, например рецептором Notch-1. В другом варианте осуществления способ включает введение антитела по настоящему изобретению или его антиген-связывающей области человеку, страдающему нарушением, состояние при котором улучшается при ингибировании активности Dll4. Такие нарушения включают болезни или патологические состояния, которые могут быть купированы, облегчены, ослаблены или предотвращены за счет блокирования, ингибирования или снижения активности Dll4, например патологическое развитие кровеносной сети, связанное с ангиогенезом в опухолях и раком, иммунодефицитные состояния, отторжение трансплантатов или воспаление, а также нейродегенеративные нарушения, например связанные с прионными заболеваниями. Настоящее изобретение также предусматривает использование антитела или антиген-связывающей области антитела в соответствии с приведенным выше описанием при производстве лекарственных препаратов, применяемых для смягчения или ингибирования заболеваний или нарушений в организме человека, опосредованных Dll4.

Другие цели и преимущества станут очевидными при ознакомлении с приведенным ниже подробным описанием.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем переходить к описанию представляемых способов, необходимо отметить, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными способами и изложенными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут меняться. Следует также понимать, что используемая в настоящем документе терминология предназначена исключительно для описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не носит ограничительного характера, поскольку охват настоящего изобретения будет лимитироваться только прилагаемыми пунктами формулы изобретения.

Использование в данном описании и в прилагаемых пунктах формулы изобретения единственного числа подразумевает ссылку на множественное число, за исключением случаев, когда из контекста явно следует обратное. Так, например, упоминание «способа» подразумевает один или несколько способов и/или стадий описанного в тексте типа, и/или методов или стадий, которые будут очевидны специалистам в данной области при ознакомлении с описанием настоящего изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, которое общеизвестно рядовым специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя на практике или при проверке настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, аналогичные или идентичные описанным в настоящем документе, ниже приводится описание предпочтительных способов и материалов.

Определения

Термины «дельта-подобный лиганд-4», «Dll4», «hDll4» являются взаимозаменяемыми при обозначении белка, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID №: 1, и белка, содержащего последовательность аминокислоты SEQ ID №: 2.

Используемый в настоящем документе термин «антитело» предназначен для обозначения молекул иммуноглобулина, составленных из четырех полипептидных цепей, при этом две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи связываются друг с другом дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе HCVR, или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно называемую в настоящем документе LCVR, или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена: CL. Области VH и VL могут далее подразделяться на области гипервариабельности, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми остовными областями (FR). Каждая область VH и VL образована тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Используемый в настоящем документе термин «антитело высокой аффинности» относится к антителам, имеющим аффинность связывания с hDll4 не менее 10^-8М; предпочтительно 10^-9М; еще более предпочтительно 10^-10М, по результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™, или результатам измерения аффинности в растворе методом иммуноферментного анализа (ELISA).

Под используемым в настоящем документе термином “медленно диссоциирующее” или “Koff” подразумевается антитело, комплекс которого с hDll4 диссоциирует с константой скорости 1×10^-3 сек^-1 или ниже, предпочтительно 1×10^-4сек^-1 или ниже, по результатам измерения методом поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE™.

Под используемым в настоящем документе термином «нейтрализующее», или «блокирующее» антитело понимается антитело, связывание которого с Dll4 приводит к ингибированию биологической активности Dll4. Такое ингибирование биологической активности Dll4 может оцениваться посредством измерения одного или нескольких показателей биологической активности Dll4. Данные показатели биологической активности Dll4 могут оцениваться при помощи одного или нескольких методов анализа in vitro или in vivo, известных специалистам (см. примеры ниже). Способность антитела нейтрализовать активность Dll4 предпочтительно должна оцениваться по ингибированию связывания Dll4 с Notch-рецептором.

Используемый в настоящем документе термин «антиген-связывающая область» антитела (или просто «часть антитела» или «фрагмент антитела») обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность к специфическому связыванию с антигеном (например, hDll4). Было показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами всей последовательности антитела. К примерам связывающих фрагментов, включенных в термин «антиген-связывающая область» антитела, относятся (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH отдельной области антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) изолированный CDR. Более того, несмотря на то что два домена во фрагменте Fv, VL и VH кодируются различными генами, их можно объединить, используя рекомбинантные технологии, посредством синтетического линкера, который позволяет построить из них единую белковую цепочку, в которой области VL и VH связываются с образованием моновалентных молекул (известных как одиночная цепь Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также включаются в сферу охвата термина «антиген-связывающая область» антитела. Сюда же входят и другие формы одноцепочечных антител, например диатела. Диатела представляют собой бивалентные биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но длина соединяющего их линкера слишком мала для связывания двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены одной цепи связываться с комплементарными доменами другой цепи, создавая тем самым два сайта связывания антигена (см., например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Далее, антитело или его антиген-связывающая область могут быть частью более крупной иммуноадгезивной молекулы, образованной ковалентной или нековалентной ассоциацией антитела или части антитела и одной или несколькими другими белковыми молекулами или пептидами. Примеры таких иммуноадгезивных молекул включают использование области ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101), и использование остатка цистеина, маркера-пептида и C-терминальной полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')₂, могут быть получены из цельных антител с помощью стандартных методик, таких как папаиновое и пепсиновое расщепление цельных антител соответственно. Кроме того, антитела, части антител и иммуноадгезивные молекулы могут быть получены с использованием стандартных технологий рекомбинантной ДНК, как описано в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «антитело человека» предназначен для обозначения антител с вариабельной и константной областями, полученных из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. Описываемые в данном изобретении антитела человека могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые иммуноглобулиновыми последовательностями зародышевых линий человека (например, мутации, вызванные случайным или сайт-специфичным мутагенезом in vitro или соматическими мутациями in vivo), например, в областях CDR, особенно в области CDR3. Однако используемый в настоящем документе термин "антитело человека" не подразумевает включения антител, в которых на зародышевые последовательности человека привиты CDR последовательности, полученные из зародышевых линий другого вида млекопитающих, например мыши.

Используемый в настоящем документе термин "рекомбинантное антитело человека" подразумевает включение всех типов антител человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных технологий, в том числе антител, экспрессируемых с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфектированного в клетку-хозяина (как описано ниже), антител, выделенных из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека (как описано ниже), антител, выделенных из животного (например, мыши), трансгенного по отношению к генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), а также антител, полученных, экспрессированных, созданных или выделенных с использованием любых других методов, использующих сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельную и константную области, полученные из иммуноглобулиновых последовательностей зародышевых линий человека. В ряде осуществлений, однако, такие рекомбинантные антитела человека подвергаются мутагенезу in vitro (либо, при использовании животных, трансгенных по иммуноглобулину человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител оказываются последовательностями, которые, хотя и получены из последовательностей VH и VL областей зародышевых линий человека, а также связаны с ними, могут отсутствовать в естественно существующем in vivo наборе последовательностей зародышевых линий человека.

Используемый в настоящем документ

Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека

Патент 2448979