Штамм вируса гриппа а собак (варианты), иммуногенный полипептид, полинуклеотид, кодирующий его, вектор экспрессии полипептида, иммуногенная композиция, содержащая полипептид, и способ индукции иммунного ответа у животного

Штамм вируса гриппа а собак (варианты), иммуногенный полипептид, полинуклеотид, кодирующий его, вектор экспрессии полипептида, иммуногенная композиция, содержащая полипептид, и способ индукции иммунного ответа у животного

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США No. 60/673 443, зарегистрированной 21 апреля 2005 года, которая включена в настоящее описание полностью в виде ссылки, включая все приведенные в ней чертежи, таблицы, последовательности нуклеиновых кислот, последовательности аминокислот и рисунки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

"Кашель в условиях конуры", или инфекционный трахеобронхит (ITB), представляет собой острую контагиозную респираторную инфекцию у собак, характеризующуюся, в основном, кашлем (Ford et al, 1998). ITB собак рассматривается как наиболее распространенное в мире инфекционное респираторное заболевание собак, вспышки которого могут достичь масштабов эпидемии, если собаки содержатся в условия высокой плотности животных, какие имеются, например, в конурах. Большая часть таких вспышек заболевания связана с непосредственным контактом собак или определяется аэрозольным распространением респираторных выделений (Ford et al, 1998). Клинические признаки вызываются инфицированием одним инфекционным агентом или сочетанием бактериальных и вирусных агентов, которые населяют эпителий верхнего и нижнего отделов дыхательных путей. Вирус парагриппа собак (CPiV) и бактерии Bordetella bronchiseptica представляют организмы, чаще всего выделяемые из организма больных животных, однако на клиническое течение и исход заболевания могут оказать влияние и некоторые другие вирусы, такие как вирус чумы собак (CDV), аденовирус-1 и -2 собак (CAV-1, CAV-2), вместе с бактериями, такими как Streptococcus sp., Pasteurella multicoda и Escherichia coli (Ford et al, 1998). Несмотря на то, что вспышки заболевания протекают выраженно и быстро, с высоким уровнем заболеваемости, в популяциях с высокой плотностью проживания животных, осложненные респираторные инфекции и летальные исходы встречаются не часто. Хотя могут развиваться опасные для жизни вторичные бактериальные пневмонии, в большинстве случаев ITB являются самокупирующимися и разрешаются без какого-либо лечения (Ford et al, 1998).

В июле 1992 респираторная инфекция, которую, предположительно, отнесли к "кашлю в конуре", достигла эпидемических масштабов на нескольких участках выгула борзых собак в Новой Англии, Флориде, Западной Вирджинии, Висконсине, Канзасе, Колорадо, Оклахоме и Аризоне. Согласно заключению ветеринаров, большая часть пораженных собак имела умеренный кашель, который проходил, но более чем у десятка борзых развилась острая геморрагическая пневмония, которая привела к быстрой смерти животных (Greyhound Daily News, 1999).

С конца 1998 до начала 1999 несколько вспышек заболевания по типу "кашель в условиях конуры", возникшие по всей стране на скачках борзых, содержавшихся в конурах, привели к принудительному закрытию треков и введению карантина на всех соревнованиях борзых в США на несколько недель (Greyhound Daily News, 1999). На одном треке во Флориде (Palm Beach Kennel Club) в один день кашель был зарегистрирован примерно у 40% собак (личное сообщение от д-ра William Duggar). Как и в случае вспышки заболевания в 1992 году, кашель проходил у большинства борзых, но 10 собак во Флориде умерли от синдрома геморрагической пневмонии, нехарактерной для инфекции по типу "кашля в конуре" (Putnam, 1999).

В марте-апреле 2003 другая вспышка "кашля в конуре" возникла на участках выгула борзых на востоке США. Эта вспышка, которая, предположительно, возникла в конурах на четырех треках во Флориде, вызвала отмену скачек и карантин собак почти на три недели. Были поражены около 25% собак на треке в Западном Пальм-Бич, и почти у 50% из 1400 собак на озере Дерби в Санкт-Петербурге развился кашель. И, как и прежде, большая часть собак выздоровела, но несколько собак умерло от респираторной инфекции. Экономический ущерб вспышки респираторной инфекции только на треке в районе озера Дерби составил, по оценкам, 2 миллиона долларов.

В настоящее время отсутствуют документальные отчеты с описанием этиологии или клинической картины эпидемии "кашля в конуре", возникшей в собачьих конурах во время скачек борзых в 1992, 1998-1999 или 2003 гг. Было высказано предположение о связи данной инфекции с CPiV и/или B. bronchiseptica, которые являются наиболее частой причиной кашля в конуре. Не подкрепленные соответствующими обоснованиями сообщения, типа информации, появляющейся на веб-сайтах, связывают фатальные случаи геморрагической пневмонии, развившейся у некоторых кашляющих собак, с инфекцией β-гемолитическим стрептококком Streptococcus equi, подвид zooepidemicus, и относят эти случаи к синдрому так называемого "стрептококкового токсического шока собак".

Передача вируса от одного организма-хозяина к другому является ключевым моментом экологии и эпидемиологии вируса гриппа (Webster, 1998). Возможны два основных механизма межвидовой передачи вируса гриппа (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004). Один из них относится к непосредственной передаче по существу не измененного вируса от одного вида к другому. Примеры такого механизма включают идентифицированные недавно инфекции человека вирусом птичьего гриппа подтипа H5N1 (Subbarao et al., 1998; Peiris et al., 2004; Guan et al., 2004) и, возможно, также пандемию 1918 года, известную как «испанка» (Reid et al., 2004). Второй механизм имеет отношение к сегментированной природе генома вируса гриппа. Совместная инфекция организма-хозяина вирусами из разных видов может привести к перегруппировке сегментированных вирусных генов и образованию рекомбинанта, который способен инфицировать другой вид. Так, например, новые вирусы, образующиеся при генной перегруппировке между вирусами птичьего гриппа и гриппа человека, привели к пандемии гриппа у людей в 1957 и 1968 гг. (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004; Kawaoka et al., 1989).

В основном, непосредственная передача не измененных вирусов гриппа от природного организма-хозяина к другому виду представляет собой завершенный процесс, поскольку длительная передача между индивидуумами нового вида не происходит. Множественные взаимодействия по типу вирус-организм-хозяин необходимы для репликации и горизонтальной передачи и обеспечивают непреодолимый барьер для длительного пребывания вирусов гриппа в новом организме-хозяине (Webby et al., 2004). В этой связи установление новых линий вируса гриппа, специфичных для организма-хозяина, является необычным процессом и происходит только на птицеводческих фермах, в свинарниках, конюшнях и в человеческих сообществах (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004).

В связи с серьезностью инфекции вирусом гриппа остается потребность в способах диагностики, профилактики и лечения инфекции вирусом гриппа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенному вирусу гриппа, который способен инфицировать представителей группы псовых и вызывать респираторное заболевание у представителей группы псовых. Настоящее изобретение также относится к композициям и способам, подходящим для индукции иммунного ответа против вируса гриппа согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к композициям и способам, подходящим для идентификации вируса согласно настоящему изобретению, и диагностики наличия у животного инфекции вирусом согласно настоящему изобретению.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Патент или зарегистрированная заявка содержит по меньшей мере один рисунок, выполненный в цвете. Копии данного патента или публикация по патентной заявке с цветными рисунками будут предоставлены Патентным Бюро при направлении соответствующего запроса и оплате необходимой суммы.

Фиг.1A-1B иллюстрируют филогенетическое родство, имеющееся между генами гемагглютинина. На фиг.1A показано дерево генов HA из репрезентативных изолятов из организма собаки, человека, птицы, свиньи и лошади, включая A/Budgerigar/Hokkaido/1/77 (H4), как варианта за пределами рассматриваемой группы. На фиг.1B показано дерево генов HA из вируса гриппа собаки, в сочетании с современными и более древними генами НА лошади A/Duck/Ukraine/63 (H3), как варианта за пределами рассматриваемой группы. Филогенетические деревья были построены на основе нуклеотидных последовательностей, определенных по методу «ближайших соседей», и показаны результаты анализа по методу «расшнурованной выборки» ≥90%. Стрелка указывает число нуклеотидных изменений на единицу длины горизонтальных ветвей дерева.

На фиг.2A-2B проиллюстрировано выявление иммуногистохимическим методом вирусного антигена H3 в легких. Срезы из ткани легкого зондируют мышиным моноклональным антителом против H3 гемагглютинина и выявляют наличие связывания по результатам иммунопероксидазной реакции (коричневый осадок). На фиг.2A показан бронхиальный эпителий, взятый от борзой со спонтанным заболеванием. Вирусный антиген H3 выявляется в цитоплазме эпителиальных клеток бронхов и в макрофагах в просвете дыхательных путей и в альвеолярном пространстве. На фиг.2B показан бронхиальный эпителий, взятый у собаки через 5 дней после инокуляции A/canine/Florida/43/04 (H3N8). Вирусный антиген H3 выявляется в цитоплазме эпителиальных клеток бронхов. Масштаб: 66 мкм.

На фиг.3 показаны характерные гистологические изменения в бронхах борзых, умерших от геморрагической пневмонии, ассоциированной с инфекцией вирусом гриппа. Ткани окрашивают красителем H&E. На верхней панели показаны: нормальный бронх с реснитчатыми клетками, слизистыми клетками и базальными клетками. На нижней панели показаны: бронх от борзой со спонтанным заболеванием. Отмечается некроз и эрозия реснитчатых клеток бронхиального эпителия. Масштаб: 100 мкм.

На фиг.4A-4B проиллюстрировано филогенетическое родство между генами H3 гемагглютинина. На фиг.4A показано филогенетическое дерево генов НА вируса гриппа собаки вместе с современными и более древними генами НА лошади. На фиг.4B показано филогенетическое дерево белка НА вируса гриппа собаки, вместе с современными и более древними НА лошади. Филогенетические деревья построены на основе нуклеотидных последовательностей, определенных по методу «ближайших соседей», и показаны результаты анализа по методу «расшнурованной выборки» ≥80%. Стрелка указывает число нуклеотидных изменений на единицу длины горизонтальных ветвей дерева.

На фиг.5 показан белок H3 из вируса гриппа в эпителиальных клетках бронхов и бронхиальных желез в легких собак, которые умерли от пневмонии, ассоциированной с инфекцией вирусом гриппа. На верхней панели показаны: эрозия реснитчатых клеток бронхиального эпителия в бронхах. Ткани окрашивают красителем H&E. На нижней панели показаны: белок H3 из вируса гриппа в цитоплазме эпителиальных клеток бронхов (слева) и бронхиальной железы (справа). Ткани окрашивают с использованием моноклонального антитела против H3 вируса гриппа, при выявлении результатов иммунопероксидазной реакцией (коричневый осадок) и при проведении контрастного окрашивания гематоксилином.

На фиг.6A-6D приведены графики, описывающие амплификацию H3 и Matrix генов (фиг.6A и фиг.6B), полученных при амплификации 10-кратных серийных разведений транскрибированных in vitro стандартных препаратов РНК. Стандартные кривые для H3 и Matrix генов (фиг.6C и фиг.6D) получают при построении графика зависимости log исходных концентраций РНК от порогового значения цикла (Ct), полученного для каждого разведения.

На фиг.7 проиллюстрирована чувствительность Directigen Flu A, при анализе 10-кратных серийных разведений стандартных вирусных препаратов, включая A/Wyoming/3/2003 и A/canine/FL/242/2003. Фиолетовый треугольник указывает на положительный результат.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Florida/43/04), кодирующую белок PB2, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Florida/43/04), кодирующую белок PB1, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Florida/43/04), кодирующую белок PA, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Florida/43/04), кодирующую белок NS, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Florida/43/04), кодирующую белок NP, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Florida/43/04), кодирующую белок NA, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Florida/43/04), кодирующую белок МА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 14 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Florida/43/04), кодирующую белок НА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 16 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 17 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (FL/242/03), кодирующую белок РВ2, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO: 19 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (FL/242/03), кодирующую белок РВ1, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 19.

SEQ ID NO: 21 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (FL/242/03), кодирующую белок РА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 21.

SEQ ID NO: 23 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (FL/242/03), кодирующую белок NS, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 23.

SEQ ID NO: 25 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (FL/242/03), кодирующую белок NP, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 26 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 27 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (FL/242/03), кодирующую белок NA, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 28 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 27.

SEQ ID NO: 29 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (FL/242/03), кодирующую белок МА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NO: 31 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (FL/242/03), кодирующую белок МА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 32 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 33 представляет собой зрелую форму белка HA, показанного в виде SEQ ID NO: 16, в котором удалена N-концевая сигнальная последовательность из 16 аминокислот.

SEQ ID NO: 34 представляет собой зрелую форму белка HA, показанного в виде SEQ ID NO: 32, в котором удалена N-концевая сигнальная последовательность из 16 аминокислот.

SEQ ID NO: 35 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 36 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 37 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 38 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 39 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 41 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 42 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 43 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 44 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 45 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 46 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 47 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Miami/2005), кодирующую белок PB2, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 48 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 47.

SEQ ID NO: 49 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Miami/2005), кодирующую белок PB1, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 50 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 49.

SEQ ID NO: 51 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Miami/2005), кодирующую белок PA, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 52 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 51.

SEQ ID NO: 53 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Miami/2005), кодирующую белок NS, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 54 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 53.

SEQ ID NO: 55 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Miami/2005), кодирующую белок NP, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 56 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 55.

SEQ ID NO: 57 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Miami/2005), кодирующую белок NA, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 58 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 57.

SEQ ID NO: 59 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Miami/2005), кодирующую белок МА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 60 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 59.

SEQ ID NO: 61 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Miami/2005), кодирующую белок НА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 62 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 61.

SEQ ID NO: 63 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Jacksonville/2005), кодирующую белок РВ2, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 64 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 63.

SEQ ID NO: 65 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Jacksonville/2005), кодирующую белок РВ1, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 66 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 65.

SEQ ID NO: 67 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Jacksonville/2005), кодирующую белок РА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 68 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 67.

SEQ ID NO: 69 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Jacksonville/2005), кодирующую белок NS, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 70 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 69.

SEQ ID NO: 71 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Jacksonville/2005), кодирующую белок NP, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 72 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 71.

SEQ ID NO: 73 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Jacksonville/2005), кодирующую белок NA, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 74 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 73.

SEQ ID NO: 75 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Jacksonville/2005), кодирующую белок МА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 76 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 75.

SEQ ID NO: 77 представляет собой нуклеотидную последовательность из вируса гриппа собаки (Jacksonville/2005), кодирующую белок НА, который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением.

SEQ ID NO: 78 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 77.

SEQ ID NO: 79 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 80 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 81 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 82 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 83 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 84 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 85 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 86 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 87 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 88 представляет собой олигонуклеотид, который может использоваться согласно настоящему изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к выделенному вирусу гриппа, который способен инфицировать псовых и вызывать респираторное заболевание. В одном варианте вирус гриппа согласно настоящему изобретению включает полинуклеотид, который кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в виде любой из последовательностей SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78, или их функциональный и/или иммуногенный фрагмент или вариант. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность, показанную в виде любой из последовательностей SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 или 77, или их фрагмент или вариант. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вирус гриппа согласно настоящему изобретению относится к подтипу H3. Вирус может быть выделен от инфицированных собак и из культуральных клеток или яиц, в соответствии с приведенными в настоящем описании методами. В репрезентативном варианте осуществления настоящего изобретения вирус гриппа представляет собой вирус гриппа A.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, которые включают полностью или часть одного или нескольких генов или геномного сегмента из вируса гриппа согласно настоящему изобретению. В одном варианте полинуклеотид согласно настоящему изобретению включает ген гемагглютинина вируса (HA), ген нейраминидазы (NA), ген нуклеопротеина (NP), ген матричного белка (MA или M), ген белка щелочной полимеразы (PB), ген белка кислой полимеразы (PA), ген неструктурного белка (NS) или функциональный фрагмент или вариант любого из указанных генов. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид согласно настоящему изобретению включает ген гемагглютинина (HA) или его функциональный фрагмент или вариант. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ген HA кодирует белок гемагглютинин, включающий одну или несколько следующих характеристик: серин в положении 83; лейцин в положении 222; треонин в положении 328 и/или треонин в положении 483, в сравнении с аминокислотной последовательностью консенсусной последовательности лошади H3. В одном варианте осуществления настоящего изобретения ген HA кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в виде SEQ ID No: 16, 32, 62 или 78, или их функциональный и/или иммуногенный фрагмент или вариант. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ген HA включает нуклеотидную последовательность, показанную в виде SEQ ID No: 15, 31, 61 или 77.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид согласно настоящему изобретению кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в виде SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78, или их функциональный и/или иммуногенный фрагмент или вариант. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, показанную в виде SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78, включает нуклеотидную последовательность, показанную в виде SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 или 77, соответственно, или последовательность, кодирующую функциональный и/или иммуногенный фрагмент или вариант любой из SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78. Таким образом, настоящее изобретение относится к полинуклеотидным последовательностям, включающим нуклеотидную последовательность, показанную в виде любой из SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 или 77, или фрагмент или вариант, включая вырожденный вариант, любой из SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 или 77. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид согласно настоящему изобретению может включать: нуклеотиды 1-2271 из SEQ ID NO: 3; нуклеотиды 1-2148 из SEQ ID NO: 5; нуклеотиды 1-657 из SEQ ID NO: 7; нуклеотиды 1-1494 из SEQ ID NO: 9; нуклеотиды 1-1410 из SEQ ID NO: 11; нуклеотиды 1-756 из SEQ ID NO: 13; нуклеотиды 1-1695 из SEQ ID NO: 15; нуклеотиды 1-2271 из SEQ ID NO: 19; нуклеотиды 1-2148 из SEQ ID NO: 21; нуклеотиды 1-657 из SEQ ID NO: 23; нуклеотиды 1-1494 из SEQ ID NO: 25; нуклеотиды 1-756 из SEQ ID NO: 29; нуклеотиды 1-1695 из SEQ ID NO: 31; нуклеотиды 1-2277 из SEQ ID NO: 47; нуклеотиды 1-2271 из SEQ ID NO: 49; нуклеотиды 1-2148 из SEQ ID NO: 51; нуклеотиды 1-690 из SEQ ID NO: 53; нуклеотиды 1-1494 из SEQ ID NO: 55; нуклеотиды 1-1410 из SEQ ID NO: 57; нуклеотиды 1-756 из SEQ ID NO: 59; нуклеотиды 1-1695 из SEQ ID NO: 61; нуклеотиды 1-2277 из SEQ ID NO: 63; нуклеотиды 1-2271 из SEQ ID NO: 65; нуклеотиды 1-2148 из SEQ ID NO: 67; нуклеотиды 1-690 из SEQ ID NO: 69; нуклеотиды 1-1494 из SEQ ID NO: 71; нуклеотиды 1-1410 из SEQ ID NO: 73; нуклеотиды 1-756 из SEQ ID NO: 75; и нуклеотиды 1-1695 из SEQ ID NO: 77. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вирусных полинуклеотидных и полипептидных последовательностей, входящие в область настоящего изобретения, депонированы в GenBank с номерами доступа No. DQ124147 - DQ124161 и DQ124190, полное раскрытие которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам, кодируемым полинуклеотидами вируса гриппа согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к функциональным и/или иммуногенным фрагментам и вариантам рассматриваемых полипептидов. Рассматриваемые полипептиды включают белок HA, белок NA, белок NS, нуклеопротеин, белок щелочной полимеразы, белок кислой полимеразы и матричный белок вируса гриппа согласно настоящему изобретению. В репрезентативном варианте, полипептид согласно настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, показанную в виде любой из SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78, или их функциональный и/или иммуногенный фрагмент или вариант.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидным экспрессирующим конструкциям, включающим полинуклеотидную последовательность согласно настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемая в нем экспрессирующая конструкция включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий аминокислотную последовательность, показанную в виде любой из SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78, или их функциональный и/или иммуногенный фрагмент или вариант. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, показанную в виде SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78, включает нуклеотидную последовательность, показанную в виде SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 или 77, соответственно, или последовательность, кодирующую функциональный и/или иммуногенный фрагмент или вариант любой из SEQ ID No: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 или 78. Таким образом, настоящее изобретение относится к экспрессирующим конструкциям, включающим полинуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, показанную в виде любой из SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 или 77, или фрагмент или вариант, включая вырожденный вариант, любой из SEQ ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 или 77. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемая в нем экспрессирующая конструкция обеспечивает суперэкспрессию оперативно связанного полинуклеотида согласно настоящему изобретению.

Экспрессирующая конструкции согласно настоящему изобретению в основном включают регуляторные элементы, функционирующие в целевой клетке-хозяине, в которой должна экспрессироваться указанная экспрессирующая конструкция. При этом любой специалист со средним уровнем знаний в данной области может выбрать регуляторные элементы для целей использования, например, в человеческих клетках-хозяевах, клетках-хозяевах других млекопитающих, клетках-хозяевах насекомых, дрожжевых клетках-хозяевах, бактериальных клетках-хозяевах и растительных клетках-хозяевах. В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые в нем регуляторные элементы включают такие регуляторные элементы, которые функционируют в клетках собаки. Указанные регуляторные элементы включают промоторы, последовательности терминации транскрипции, последовательности терминации трансляции, энхансеры и сигналы полиаденилирования. В контексте настоящего описания термин "экспрессирующая конструкция" относится к сочетанию последовательностей нуклеиновых кислот, которая обеспечивает транскрипцию оперативно связанной последовательности нуклеиновой кислоты. В контексте настоящего описания термин "оперативно связанный" относится к такому взаимному расположению описанных компонентов, при котором указанные компоненты находятся в определенной взаимосвязи, позволяющей им функционировать заданным образом. В основном оперативно связанные компоненты расположены непосредственно вблизи друг от друга.

Экспрессирующая конструкция согласно настоящему изобретению может включать промоторную последовательность, оперативно связанную с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид согласно настоящему изобретению. Промоторы могут быть введены в состав полинуклеотида с использованием стандартных методик, известных в данной области. В экспрессирующей конструкции согласно настоящему изобретению могут использоваться множественные копии промоторов или множественные промоторы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения промотор может быть расположен примерно на том же примерно расстоянии от сайта старта транскрипции в экспрессирующей конструкции, как это имеет место применительно к сайту старта транскрипции в его природном генетической окружении. Допускаются некоторые вариации в этом расстоянии, которые не снижают в заметной мере промоторную активность. В экспрессирующую конструкцию в типичном случае включается сайт старта транскрипции. Предпочтительно, промотор, ассоциированный с экспрессирующей конструкцией согласно настоящему изобретению, обеспечивает суперэкспрессию оперативно связанного полинуклеотида согласно настоящему изобретению.

Промоторы, используемые в экспрессирующих конструкциях в эукариотических клетках, согласно настоящему изобретению, могут быть вирусного или клеточного происхождения. Вирусные промоторы включают, без ограничения, генные промоторы цитомегаловируса (CMV), ранние или поздние промоторы SV40 или генные промоторы вируса саркомы Рауса (RSV). Промоторы клеточного происхождения включают, без ограничения, промотор гена десмина и промотор гена актина. Промоторы, подходящие для использования в сочетании с конструкцией, экспрессируемой в дрожжевых клетках, включают, без ограничения, промотор 3-фосфоглицерилкиназы, промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, промотор металлотионеина, промотор алкогольдегидрогеназы-2 и промотор гексокиназы.

Если экспрессирующая конструкция находится в растительной клетке или встраивается в нее, то могут также использоваться промоторы вирусов растений, такие как, например, вирус табачной мозаики (CaMV) 35S (включая усиленный промотор CaMV 35S (см., например, патент США No. 5 106 739 и An, 1997)) или промотор CaMV 19S. Другие промоторы, которые также могут использоваться в конструкциях, экспрессируемых в растениях, включают, например, промотор prolifera, Ap3 промотор, промоторы белков теплового шока, T-ДНК 1'- или 2'- промотор из A. tumefaciens, промотор полигалактуроназы, промотор халконсинтазы A (CHS-A) из петуньи, промотор PR-1a из табака, убихитиновый промотор, промотор актина, промотор гена alcA, промотор pin2 (Xu et al., 1993), промотор WipI из кукурузы, промотор гена trpA из кукурузы (патент США No. 5 625 136), промотор гена CDPK из кукурузы и промотор RUBISCO SSU (патент США No. 5 034 322). В конструкциях согласно настоящему изобретению могут использоваться корне-специфические промоторы, такие как промоторные последовательности, описанные в патенте No. 6 455 760, или в патенте США No. 6 696 623, или в публикациях заявок на патент США No. 20040078841; 20040067506; 20040019934; 20030177536; 20030084486 или 20040123349. Конститутивные промоторы (такие как промотор CaMV, убихина, актина или NOS), промоторы, регулируемые в процессе развития, и индуцибельные промоторы (такие как промоторы, которые могут быть индуци