Способ получения отличного от аденовируса вируса-мишени или белков-мишеней, экспрессирующая клетка и клетка-хозяин и способы их получения, применение экспрессирующей клетки

Способ получения отличного от аденовируса вируса-мишени или белков-мишеней, экспрессирующая клетка и клетка-хозяин и способы их получения, применение экспрессирующей клетки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПРИМЕНЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу получения не являющегося аденовирусом вируса-мишени или белков-мишеней с использованием сильной экспрессирующей клеточной линии, обладающей стабильно интегрированным в ее геном геном, кодирующим специфичный гетерологичный регуляторный белок.

Известный уровень техники

Биофармацевтические продукты из эукариотических клеток являются составной частью современной медицины. Однако повышенная продуктивность и повышенная безопасность представляют собой важные параметры, которые все еще требуют существенной оптимизации. Наиболее значимым узким местом в попытках оптимизации является сам клеточный субстрат. Безопасный трансген, который может быть введен в клеточные линии, уже выпущенный для применения в биофармацевтических процессах для повышения выхода продуктов из таких обработанных клеток, является предельно дорогим.

Аденовирусы являются безоболочечными (голыми) вирусами с двухцепочечной ДНК, которые инфицируют широкий спектр животных. Среди наиболее хорошо охарактеризованных членов можно назвать аденовирус серотипа 5 (Ad5). Этот вирус является частой причиной общих симптомов охлаждения, и инфицирование часто происходит в детстве.

Аденовирусы поддаются генетическим манипуляциям, и не способные к репликации аденовирусы, включая Ad5 (номер поступления в GenBank для последовательности: AC_000008), используются в качестве векторов для генной терапии и для терапевтической вакцинации. Для получения не способных к репликации вирусов большие области геномной ДНК замещают невирусными последовательностями. Потеря вирусных функций обеспечивается транс-действием линий клеток-хозяев, которые стабильно трансфицированы генами, которые удалены в векторе. Одна из ранних систем, которые были разработаны, состоит из аденовирусных векторов с делецией регуляторной области E1, созданной в клеточных линиях, обеспечивающих соответствующими белками E1.

Наиболее обычной клеточной линией для этой цели является клеточная линия 293. Эта линия была создана в 1977 г. путем трансфекции фрагментированной аденовирусной геномной ДНК в первичные клетки человека (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59-74 (1977)), как раз перед тем как было обнаружено, что аденовирусы могут служить в качестве векторов для генной терапии. Полученная клеточная линия, как показано впоследствии, содержала нуклеотиды с 1 по 4344 геномной ДНК (Louis et al., Virology 233, 423-429 (1997)), которая включает область E1; эта характеристика показала, что область E1 может быть использована для иммортализации и трансформации первичных клеток.

Сразу за областью E1 следует ген для pIX («белка 9»; нуклеотиды с 3609 до 4031 в геномной ДНК). Промотор для pIX встроен в компонент E1B области E1. Механизм, называемый окклюзией промотора, позволяет экспрессироваться pIX в раннее отставленное время в цикле инфицирования вирусом при начале репликации вирусной ДНК с увеличивающимся числом копий вирусной ДНК (Fessler and Young, J. Virol. 72, 4049-4056 (1998)). Хотя ген присутствует в пределах 4344 нуклеотидов, интегрированных в клетки 293, экспрессия pIX не может быть определена даже чувствительными методами с радиоактивной меткой (Spector et al., J. Virol. 36, 860-871 (1980)).

Как описано выше, аденовирусные векторы с недостаточной репликацией созданы с помощью делеции области E1 из вирусного генома. Продукты E1 существенны для репликации вирусов, и функция области E1, следовательно, должна состоять в обеспечении транс-действия через стабильные трансгены E1 в клетке, упаковывающей аденовирус (такой как клеточная линия 293). Благодаря проксимальному положению в отношении области E1 ген pIX вызывал частую рекомбинацию между аденовирусными векторами с делецией и E1 в геноме хозяина. Это событие рекомбинации создавало компетентный в отношении репликации аденовирус (RCA), существенное загрязнение при получении векторов. Для подавления этого события рекомбинации pIX удаляли из аденовирусного генома. В ходе этих экспериментов было установлено, что pIX стабилизирует аденовирусный капсид в отношении термического и стерического стресса путем усиления взаимодействия главных строительных блоков, гексонов (Colby and Shenk, J. Virol. 39, 977-980 (1981); Ghosh-Choudhury et al., EMBO J. 6, 1733-1739 (1987)). Морфогенез в отсутствие pIX дает чувствительные к температуре вирусы, которые не могут доставлять молекулы геномной ДНК более крупные, чем 105% от 35938 пар оснований у дикого типа. Для того чтобы все еще придать нормальную упаковывающую способность и термическую стабильность, белок pIX стабильно вводят в клеточные линии, предназначаемые в качестве упаковывающих клеток для аденовирусных векторов (Krougliak and Graham, Hum. Gene Ther. 6, 1575-1586 (1995); патент WO 99/57296 и Imler et al., Gene Therapy 3, 75-84 (1996)).

Также при выяснении того, что pIX отделывает поверхность вирионов, были созданы слитые белки pIX с целью расширения диапазона хозяев аденовирусных векторов или для прослеживания морфогенеза и внутриклеточного перемещения вирусных частиц (суммировано Parks, Mol. Ther. 11, 19-25 (2005)).

Несмотря на то, что он является чисто структурным белком, pIX как регуляторный белок вовлечен также в репликацию аденовирусов. PIX, как предполагается, функционирует в качестве трансактиватора транскрипции для усиления экспрессии E1A, функции, возможно, даже оказывающей влияние в качестве вирокина путем поступления белка PIX из капсида на стадии инфицирования (суммировано Parks, Mol. Ther. 11, 19-25 (2005)). PIX совместно с ранним белком E4 Orf3 так же, как описано, взаимодействует с субъядерными включениями, называемыми тельцами PML (Puvion-Dutilleul et al., Exp. Cell. Res. 218, 9-16 (1995); Leppard and Everett, J. Gen. Virol. 80, 997-1008 (1999)). Они представляют собой динамические агрегаты размером от 250 нм до 500 нм и, как предполагается, участвуют в регуляции клеточной дифференцировки (Wang et al., Science 279, 1547-1551 (1998)), контроле апоптоза (Quignon et al., Nature Gen. 20, 259-265 (1998)) и в ответ на вирусную инфекцию (Moller and Schmitz, Arch Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 51, 295-300 (2003)).

Из-за его плейотропных эффектов заявители ввели белок PIX в клеточные линии для изучения того, будет ли PIX обладать свойствами усиления клеточной пролиферации или продукции для биофармацевтических продуктов, которые не относятся к аденовирусу или аденовирусным векторам. Существует повсеместная потребность в факторах, которые модулируют эти свойства в устоявшихся клеточных линиях.

Например, аттенуированные (ослабленные) вирусы являются многообещающими кандидатами для вакцин: при инокуляции они имитируют природную инфекцию, но предоставляют больше времени для установления желаемого защитного иммунного ответа путем вакцинации. При растущем количестве иммунодефицитных больных (например, из-за ВИЧ-инфекции) желательны крайне ослабленные штаммы. Поскольку ослабленные штаммы все еще продолжают инфицировать (обычно в легкой форме), высоко ослабленные штаммы блокируются на клеточном уровне даже в отсутствие функционирующей иммунной системы. Часто используемым методом для установления и поддержания аттенуации являются пассажи вирусов на различных тканях хозяина. Например, вирусы кори и свинки, предназначенные для вакцинации человека, пассируют в первичных клетках либо яиц с эмбрионами цыплят, либо происходящих из них культур. Новая генерация вакцин основана на сильно ослабленных поксвирусах, продукция которых также зависит от первичных клеток цыплят. Клеточная линия, которая может заменить первичные клетки цыплят и в то же время которая даже менее эффективно защищает себя против вирусной инфекции из-за вторичных манипуляций, таких как введение трансгена PIX, следовательно, дает крайне желаемый субстрат.

Для других целей может быть предпочтительна клеточная линия млекопитающих (а не птиц). Такие предпочтительные клеточные линии уже существуют и прошли проверку органов здравоохранения в отношении безопасности и рисков, установленных для производных биофармацевтических продуктов. Здесь также крайне желательна вторичная манипуляция (такая как введение трансгена PIX) для повышения спектра доступных применений или эффективности продукции без компрометации характеристик безопасности.

Краткое изложение существа изобретения

При получении клеточных линий, которые стабильно трансфицированы аденовирусным геном pIX (или его химерным гибридным аналогом), заявители неожиданно обнаружили, что pIX проявляет фенотипический эффект в клетках птиц и человека. Для клеток птиц это особенно удивительно, потому что клетки птиц не могут быть инфицированы аденовирусами человека и авиаденовирусы (такие как CELO или аденовирус типа 8 домашней птицы) не кодируют гомолог PIX (Ojkic and Nagy, J. Gen. Virol. 81, 1833-1837 (2000)). Более того, заявители обнаружили, что стабильное присутствие PIX повышает восприимчивость клетки к индукции аналогом двухцепочечной РНК, вероятно, через толл-подобный рецептор 3. В этом контексте, вероятно, заявители также неожиданно обнаружили, что присутствие белка PIX повышает выходы высоко ослабленного поксвируса в клетках-хозяевах птиц. Так как клетки, инфицированные поксвирусом, меньше страдали от индукции аналогом двухцепочечной РНК, заявители могли найти взаимодействие между белком PIX и антиинтерфероновыми генами поксвируса, которое не было описано ранее. Заявители также выявили неожиданное увеличение выхода белкового продукта (не только вируса), секретируемого стабильно трансфицированной клеточной линией.

Таким образом, настоящее изобретение относится к

(1) способу получения неаденовирусного вируса-мишени или одного или более белков-мишеней, включающему

(a) культивирование экспрессирующей клетки, получаемой с помощью инфицирования или трансфекции клетки-хозяина, обладающей стабильно интегрированным в ее геном геном, кодирующим PIX аденовируса или его функциональный вариант в качестве гетерологичного регуляторного белка, и стабильно экспрессирующей указанный регуляторный белок или его функциональный вариант, с указанным вирусом-мишенью или с вектором, несущим последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие указанный вирус-мишень, или с вектором, несущим последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие указанные один или более белки-мишени (где не аденовирусный вирус-мишень не содержит указанный регуляторный белок, и белок(и)-мишень(и) отличаются от указанного регуляторного белка или его функционального варианта), и

(b) выделение вируса-мишени или белка(ов)-мишени(ей);

(2) предпочтительному варианту осуществления (1), указанного выше, где указанный белок PIX или его функциональный вариант кооперируется с неродственными вирусными факторами, модулирует субклеточное распределение факторов, отличных от указанного белка, модулирует транскрипцию и/или рост клеток и повышает продуктивность клетки в отношении продукции вируса, не содержащего указанный регуляторный белок, и в отношении продукции белка, отличающегося от указанного регуляторного белка или его функционального варианта;

(3) предпочтительному варианту осуществления (1) или (2), указанных выше, где pIX аденовируса предлагается как слитый белок с другим белком, который модулирует или увеличивает активность или субклеточное распределение pIX аденовируса, например, гибридизованный с рецептором альфа-ретиноевой кислоты, предпочтительно, представляет собой слитый белок, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, или гибридизованный с GFP и содержащий NLS, предпочтительно, представляет собой слитый белок, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:23;

(4) предпочтительному варианту осуществления с (1) по (3), указанных выше, где хозяин и экспрессирующая клетка представляют собой клетку позвоночных, включая клетки млекопитающих и клетки птиц, предпочтительно клетка млекопитающих представляет собой клетку, происходящую из мозга человека, и клетка птиц представляет собой клетку, происходящую из сетчатки уток, или клетку, происходящую из сомитов утки;

(5) предпочтительному варианту осуществления с (1) по (4), указанных выше, где хозяин и экспрессирующая клетка происходят из мозга человека, предпочтительно из мозга плода человека, и наиболее предпочтительно представляют собой клетку NC5T11, и указанная клетка несет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую PIX аденовируса или его функциональный вариант в качестве гетерологичного регуляторного белка, предпочтительно указанный гетерологичный регуляторный белок кодируется нуклеиновой кислотой, представленной SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:22;

(6) предпочтительному варианту осуществления по (5), указанному выше, где клетка-хозяин представляет собой клетку NC5T11#34 и экспрессирующая клетка происходит от клетки NC5T11#34, причем указанная клетка NC5T11#34 депонирована с DSMZ под номером поступления DSM ACC2744;

(7) предпочтительному варианту осуществления с (1) по (4), указанных выше, где хозяин и экспрессирующая клетка представляют собой клетку птиц, предпочтительно происходящую из сетчатки утки или сомита утки, и указанная клетка несет последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую PIX аденовируса или его функциональный вариант в качестве гетерологичного регуляторного белка, предпочтительно указанный гетерологичный регуляторный белок кодируется нуклеиновой кислотой, представленной SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:22;

(8) предпочтительному варианту осуществления по (7), указанному выше, где клетка-хозяин представляет собой клетку CR.PIX (17a11b) и экспрессирующая клетка происходит от клетки CR.PIX (17a11b), причем указанная клетка CR.PIX (17a11b) депонирована с DSMZ под номером поступления DSM ACC2749;

(9) экспрессирующей клетке для продукции вируса-мишени или одного или более белков-мишеней, как определено в с (1) по (8) выше, предпочтительно экспрессия является такой, как определено в с (5) по (8) выше;

(10) способу получения экспрессирующей клетки, как определено в (9) выше, который включает инфицирование или трансфекцию линии клеток-хозяев, как определено в с (1) по (8) выше, вирусом или вектором, несущим последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие указанный вирус, или вектором, несущим последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие указанный один или более белков-мишеней;

(11) клетке-хозяину, как определено в с (5) по (8) выше;

(12) способу получения клетки-хозяина по (11) выше, который включает трансфекцию подходящей исходной клетки вектором, несущим указанный регуляторный белок или его функциональный вариант;

(13) применению экспрессирующей клетки, как определено в (7) выше, для получения вируса-мишени или одного или более белков-мишеней;

(14) слитому белку, включающему по меньшей мере один первый домен, включающий регуляторный белок, и по меньшей мере один второй домен, включающий белок или пептид, действующий в качестве модулятора транскрипции и/или в качестве сигнала для субклеточной направленности, как определено в (2) или (3) выше; и

(15) нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, как определено в (14) выше.

Краткое описание фигур

Фиг.1: история клеточной линии NC5T11. A - Нейросферы первичных клеток, выращенных в бессывороточных условиях. B - Монослой первичных клеток, выращенных в DMEM/F12 с 5% FCS. C - Первичный фокус через две недели после трансфекции p79. Стрелки указывают границу между первичными и иммортализованными клетками. D - Гомогенная адгезивная культура иммортализованных клеток в DMEM/F12 с 5% FCS. E - Суспензионная культура NC5T11 во встряхиваемых пробирках в EXcell VPRO.

Фиг.2: Иммунофлуоресцентное определение E1A и E1B в NC5T11. После фиксации в метаноле клетки обрабатывали крысиными антителами, направленными против E1A и E1B 55k соответственно с последующей обработкой техасским красным, конъюгированным с антикрысиными антителами. Как показано на фиг.2, все клетки в образце демонстрируют ядерное окрашивание, типичное E1A и цитоплазматическое окрашивание для E1B. После фиксации метанолом клетки обрабатывали крысиными антителами, направленными против E1A и E1B 55k соответственно с последующей обработкой техасским красным, конъюгированным с антикрысиными антителами. Как здесь показано, все клетки в образце демонстрируют ядерное окрашивание, типичное E1A и цитоплазматическое окрашивание для E1B.

Фиг.3: Конкретная продуктивность отобранных клонов aat. Клеточные клоны NC5T11, трансфицированные C55 и отобранные с помощью пуромицина, высевали по 7×10⁴ клеток в 12-луночные планшеты, число клеток и титр aat определяли на 1, 2 и 3 день после высевания и рассчитывали максимальную продуктивность конкретных клеток в день.

Фиг.4: Экспрессионный анализ NC5T11puro#8 во встряхиваемой суспензионной культуре. Клетки высевали в 12 мл EXCELL VPRO при 6×10⁴ клеток/мл в 50-мл полипропиленовых пробирках для встряхивания (TPP, Switzerland) и подвергали вращению с радиусом 1 см и скоростью 160 об/мин. Образцы 200 мкл отбирали на 4, 7, 9, 11, 15, 18 и 21 дни. Плотность и жизнеспособность клеток определяли после окрашивания трипановым-синим с применением гемоцитометра.

Фиг.5: Определение кДНК pIX-RARA в пуле клонов с помощью ПЦР. Пул клонов, несущих ген pIX-RARA, создавали из NC5Tllpuro#8 с помощью трансфекции F67 и отбора с помощью гигромицина. РНК экстрагировали с применением набора для экстракции РНК (Machery Nagel, Germany) и кДНК синтезировали с применением обратной транскриптазы AMV (Invitrogen). кДНК для одного фрагмента pIX или целого гена pIXRARA амплифицировали с праймером 1 и 1 и 164 соответственно.

Фиг.6: Определение последовательностей pIX как части слитого белка в устойчивых к гигромицину субклонах NC5T11puro#8 и NC5T11 (#34, 35, 36, 37, 38) с помощью ПЦР. ДНК выделяли из клеточных клонов, выращенных в 6 лунках с помощью лизиса в ДДС-Na, с последующей экстракцией фенолом и преципитацией. ДНК амплифицировали с помощью праймеров 1 и 2 в течение 28 циклов.

Фиг.7: Стабильность генов pIXRARA и pIX в стабильно трансфицированных NC5T11 определяли относительно E1B: E1A+E1B и pIXRARA вводили в отдельных трансфекциях, и гены E1 поддерживались в отсутствие селекции в течение >2 лет и, следовательно, рассматривались как стабильно интегрированные. Геномную ДНК выделяли из выбранных клеточных клонов в 2 временные точки: непосредственно сразу после прекращения селекции hyg (ранняя); через 2 месяца в отсутствие процедуры селекции (поздняя). Уровни ДНК PIX и E1B определяли с помощью ПЦР в реальном времени.

Фиг.8: Задержка роста, индуцированная обработкой RA в рекомбинантных pIXRARA клонах NC5T11 и NC5T11puro#8. Клетки высевали при 2×10⁵ в 6-луночные планшеты в присутствии или в отсутствие 6 мкг/мл ретиноевой кислоты. Фотографии, демонстрирующие задержку роста в обработанных RA клонах #12 и #34, но не в NC5T11, были получены через 4 дня после высевания с использованием фазово-контрастного изображения при увеличении х4.

Фиг.9: PIXRARA предотвращает ингибирование репликации вируса интерфероном. Клетки NC5T11 и NC5T11#34 инфицировали EMCV, чувствительным к интерферону вирусом, при MOI 0,004 в клетках, обработанных интерфероном-бета. Лизаты клеток подвергали титрованию по образованию бляшек на клетках A549.

Фиг.10: Экспрессионный анализ клеточной линии NC5T11puro#8, экспрессирующей альфа-1-антитрипсин с вектора C55, и ее субклонов #10, #12, #14, несущих вектор F67 (pEFpIX-RARA) в дополнение к C55. Клетки высевали в EXCELL VPRO (JRH Biosciences) при 6×10⁴ клеток/мл в 50 мл полипропиленовых пробирках для встряхивания (TPP, Switzerland) в суммарном объеме 12 мл и подвергали вращению с радиусом 1 см и скоростью 160 об/мин.

Фиг.11: Экспрессия PIX в клетках CR сетчатки утки. Левая панель: реакция ПЦР против гена PIX в геномной ДНК клеток pIX. Нанесение на гель слева направо: маркер 1 т.п.н. (Invitrogen); ПЦР на геномной ДНК из CRpIX; нематричный контроль; позитивный контроль с плазмидой, применяемой при трансфекции CRpIX. Правая панель: вестерн-блоттинг для определения белка pIX в клетках CRpIX. Дорожка 1: клетки 293; дорожка 2: белок pIX в клетках CRpIX.

Фиг.12: Стабильное поддержание трансгена PIX в клетках сетчатки уток. Верхняя левая панель: MCX и DXS представляют собой независимые аликвоты клона CRpIX, культивируемые в течение >3 месяцев параллельно и без селекции. После трех месяцев ПЦР TagMan применяли для подсчета количества копий E1B и PIX трансгена в MCX и DXS. Так как трансген E1B поддерживается независимо от PIX, отношение двух генов является показателем поддержания трансгена PIX. Отношение не меняется между MCX и DXS. Более того, отношение мРНК PIX к мРНК E1B также не изменялось, и мРНК PIX была в избытке по отношению к мРНК E1B, что указывает на экспрессию PIX. Правая панель: MCX и родительские (PIX-негативные) CR. Клетки HS культивировали с или без давления селекции гигромицином в течение 2 недель (показано в виде черной полосы на оси X). В различные временные точки геномную ДНК выделяли (показано как “A”, “B” и “C”) и подвергали количественному определению с TaqMan (нижняя левая). В то время как родительские клетки уничтожались гигромицином, клетки MCX выживали. Отношение трансгенов оставалось постоянным, снова указывая на стабильное поддержание трансгена PIX также в присутствии давления селективного отбора. Время удвоения для родительских клеток составляет приблизительно 32 час, но только 41 час для клеток MCX.

Фиг.13: Эффект PIX на репликацию MVA в клетках CS. Клетки CS и CSpIX инфицировали MVA и тестировали на репликацию MVA через 48 час и 72 час после инфицирования. Выход MVA был значительно выше в PIX-позитивных клетках CS. Также, что очевидно в фазово-контрастном микроскопе, цитопатический эффект появлялся с задержкой у клеток CSpIX на 48 час. Однако обе культуры являются восприимчивыми к вирусу в сходной степени, так как полный лизис очевиден через 72 час после инфицирования.

Фиг.14: Эффект PIX на репликацию MVA в клетках CR. Клетки CR и CRpIX в суспензии инфицировали различными сочетаниями и при различной плотности высевания клеток. Выход MVA оценивали через 48 час после инфицирования, и он показан на оси Y. Размер пузырьков отражает плотность высевания клеток. Закрашенные пузырьки показывают величины для клеток CRpIX, белые пузырьки показывают величины для родительских клеток. Во всех конфигурациях PIX придает отчетливое увеличение скоростей амплификации MVA.

Фиг.15: Субклеточное распределение PIX-GFP в клетках уток. Меченый GFP PIX появляется в нескольких цитоплазматических ярких пятнах и диффузном цитоплазматическом окрашивании, практически исключая ядра. Другие клоны проявляют более сильное диффузное цитоплазматическое окрашивание и более интенсивную аккумуляцию непосредственно вокруг ядра.

Фиг.16: Субклеточное распределение вариантов PIX-GFP в клетках CHO. Для исследования индуцируемых изменений распределения PIX в клетках были созданы гибридные варианты, включая вставку сайта ядерной локализации (NLS) и гибридизацию с ретиноидным рецептором альфа, клеточным белком, который уже содержит NLS. Представлены клетки CHO, временно трансфицированные экспрессионными плазмидами для вариантов PIX-GFP.

Фиг.17: Эффект индукции интерферона в присутствии PIX. Клетки CSpIX и CRpIX обрабатывали поли I:поли C, известным индуктором ответа интерферона типа I, и сравнивали с родительскими клетками. Клетки CSpIX реагировали с более высокой восприимчивостью к поли I:поли C, чем клетки CS. Клетки CRpIX и CR реагировали сравнимо и в меньшей степени, чем клетки CS.

Фиг.18: Эффект инфицирования MVA и индукции интерферона в присутствии PIX-GFP. Клетки CSp9GFP и CRp9GFP обрабатывали поли I:поли C и инфицировали MVA при M.O.I. 0,1, как указано. Вновь происходящие от CS клетки реагировали на индукцию интерферона более сильно. Неожиданно оказалось, что количество ярких телец PIX, очевидно, снижается при индукции или инфицировании в обеих клеточных линиях, в то время как общая интенсивность сигнала PIX-GFP растет. Более того, эффект индукции поли I:поли C улучшается при параллельном инфицировании MVA, на что указывает большее количество клеток CS, все еще прикрепленных через 22 час после обработки.

Подробное описание изобретения

В способе согласно варианту осуществления (1) изобретения используют экспрессирующую клетку, обладающую интегрированным в ее геном геном, кодирующим гетерологичный регуляторный белок, называемый pIX или его функциональный вариант. Указанный регуляторный белок обладает следующими свойствами:

1. Он модулирует транскрипцию и, особенно, если связан с соответствующими модуляторами или регуляторами, также влияет на клеточный рост.

2. Он увеличивает продуктивность клеточной линии в отношении продукции вируса, не содержащего указанный регуляторный белок (т.е. регуляторный белок не замещает белок, удаленный из вируса), и/или в отношении продукции белка, отличающегося от указанного регуляторного белка или его функционального варианта.

В соответствии с изобретением гетерологичный регуляторный белок представляет собой белок pIX аденовируса серотипа 5 (например, имеющий последовательность а.к., представленную SEQ ID NO:2), его мутанты (включая мутанты с добавкой, заменой и/или делецией), его варианты (например, варианты, полученные из аденовируса другого серотипа) и тому подобное.

«Функциональный вариант гетерологичного регуляторного белка» в соответствии с изобретением включает гомологи из аденовируса серотипа, отличного от серотипа 5, все типы мутации (добавку, замену и/или делецию) конкретного(ых) аминокислотного(ых) остатка(ов) соответствующего регуляторного белка дикого типа, модификации путем слияния, которые дополнительно активируют белковую или пептидную последовательности и тому подобное. Особенно предпочтительными являются слитые белки, а именно слитые белки, включающие по меньшей мере один первый домен, включающий регуляторный белок, как определено здесь выше, и по меньшей мере один второй домен, включающий белок или пептид, действующий в качестве модулятора транскрипции. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный модулятор транскрипции представляет собой транскрипционный фактор, включая рецептор альфа ретиноевой кислоты, который может присутствовать в полной или неполной (т.е. усеченной) форме. Модулятор может также представлять собой переносящий пептид, который включает последовательности NLF, например, как представлено в SEQ ID NO:21. В соответствии с изобретением первый и второй домен(ы) либо прямо, либо через пептидный линкер ковалентно соединены друг с другом. Подходящие пептидные линкеры включают гибкие и гидрофильные структуры, такие как поли gly-ser.

Термины «клетка» и «клеточная линия», используемые в последующем подробном описании, относятся к экспрессирующим клеткам/экспрессирующим клеточным линиям и к клеткам-хозяевам/клеточным линиям-хозяевам.

В соответствии с изобретением предпочтительно, чтобы гетерологичный регуляторный белок или его функциональный вариант экспрессировался в клетке в количестве по меньшей мере 1 пг/мкг клеточного белка, предпочтительно в количестве по меньшей мере 10 пг/мкг клеточного белка, так, чтобы его экспрессия могла быть определена с помощью вестерн-блоттинга.

В клетке по изобретению гетерологичный регуляторный белок или его функциональный вариант находится предпочтительно под контролем стабильного гомологичного или гетерологичного промотора. Подходящими промоторами являются конститутивный клеточный промотор или его варианты, такие как промотор фактора 2 элонгации при транслокации человека. Конкретный вариант промотора фактора 2 элонгации при транслокации человека, применяемый в изобретении, имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:12. Представленная последовательность представляет собой «короткий» вариант промотора, который локализован на хромосоме человека 19:3935325-3936638 (собрание по геному человека, май 2004) и дает стабильный средний уровень экспрессии. Для более сильной экспрессии может быть использован «более длинный» вариант промотора, локализованный на хром. 19: 3935349-3938957 (собрание по геному человека, май 2004).

В соответствии с изобретением клетка представляет собой клетку позвоночных, включая клетки млекопитающих, клетки птиц и тому подобное. Подходящими клетками млекопитающих являются клетки человека и клетки грызунов, включая мышь, крысу, хомячка и т.п. Особенно предпочтительными клетками млекопитающих в соответствии с изобретением являются клетки, происходящие из мозга человека, особенно из мозга плодов человека, клетка NSO или Sp2/0 мыши, клетка BHk или CHO. Подходящими клетками птиц являются клетки утки, птенцов перепелки и гуся. Особенно предпочтительными клетками птиц в соответствии с изобретением являются клетки, происходящие из сетчатки утки или клетка сомита.

С другой стороны, клетка по изобретению может происходить от первичной клетки или от ранее иммортализованной клетки. Более того, клетка может нести дополнительные иммортализующие (вирусные) гены, включая белок E1 аденовируса, такой как белок E1 мастаденовируса группы C типа 5 и тому подобное. Особенно предпочтительным в соответствии с настоящим изобретением является то, что клетка дополнительно несет ген аденовируса E1A и/или E1B, представленный в SEQ ID NO:5.

Клетка, используемая в способе согласно варианту осуществления (1) изобретения, может дополнительно нести функциональные последовательности, например, последовательности, требуемые для ее применения в качестве экспрессирующей клетки, такие как последовательности маркера селекции, последовательности сайтов сплайсинга донора/акцептора и/или последовательности, узнаваемые рекомбиназой, обеспечивающие интеграцию последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, подлежащей экспрессии в клетке, и т.д.

«Инфицирование», «трансфекция» и «трансформирование», выполненные способами осуществлений (1), (10) и (12) изобретения, могут осуществляться в соответствии со стандартными процедурами, известными специалисту в данной области техники. Указанные способы могут дополнительно охватывать подходящие стадии селекции, выделения и экспансии, если это требуется.

В способе согласно варианту осуществления (1) вирус-мишень включает формы дикого типа, вирус с мутацией или делецией, адаптированный к холоду, или ослабленный вирус, штаммы вакцин, вирусные векторы, несущие гетерологичный(ые) ген(ы), вирусные векторы, такие как лентивирус, поксвирус, вирус, ассоциированный с аденовирусом (aav), вирус герпеса, флавивирус и тому подобное.

Далее в способе согласно варианту осуществления (1) один или более белков-мишеней включают антитела, рекомбинантные белки, такие как эритропоэтин, альфа-1-антитрипсин, факторы свертывания VIII и IX и интерфероны, вирусные антигены, такие как HA и NA гриппа и M, HBV-S, белок G герпеса и белок G бешенства, пептидные гормоны и тому подобное. Хотя способ позволяет продуцировать клетки, способные к одновременной экспрессии более одного белка-мишени, особенно предпочтительно, чтобы они кодировали только один белок-мишень.

Культивирование и выделение в способе согласно варианту осуществления (1) изобретения может быть осуществлено в соответствии со стандартными процедурами, легко доступными специалисту в данной области техники. Указанный способ может дополнительно включать стандартные стадии очистки, а также последующие стадии модификации вируса-мишени или белка(ов)-мишени(ей).

Что касается предпочтительных вариантов экспрессии клеточных линий-хозяев согласно вариантам осуществления (9) и (11) соответственно, а также способов продукции для указанных клеточных линий согласно вариантам осуществления (10) и (12), дается ссылка на подробное обсуждение, предложенное здесь выше в связи с вариантом осуществления (1).

В соответствии с вариантами осуществления (14) и (15) в изобретении предлагается слитый белок, включающий по меньшей мере один первый домен, включающий регуляторный белок, и по меньшей мере один второй домен, включающий белок или пептид, действующий в качестве модулятора транскрипции, как определено здесь выше, и нуклеотидная последовательность, кодирующая указанный слитый белок, соответственно. Изобретение также относится к применению указанного слитого белка (например, к диагностическому и фармацевтическому применению и т.д.) и нуклеотидной последовательности, кодирующей его в осуществлениях (14) и (15) соответственно, например, во всех типах векторных конструктов, клеточных линиях, тканевой культуре, трансгенных животных и т.д.

Клеточная линия NC5T11#34 была депонирована DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Germany, 4 ноября 2005 г. под номером поступления DSM ACC2744. Клеточная линия CR.PIX (17a11b) была депонирована DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Germany, 24 ноября 2005 г. под номером поступления DSM ACC2749.

Изобретение будет объяснено более подробно с помощью последующих примеров, которые, однако, не истолковываются как ограничивающие изобретение.

Примеры

Пример 1

Формирование клеточной линии ТС5Е11

Клеточную линию формировали из смеси клеток эмбрионального мозга путем иммортализации генами E1A и B аденовируса 5 с помощью невирусной трансфекции.

Образец ткани отбирали из перивентрикулярной зоны мозга плода после индуцированного аборта. Его вырезали ножницами и гомогенизировали отсасыванием пипеткой для культуры ткани в нейрональной культуральной среде на основе DEMEM/F12, содержащей 20 нг/мл ФРФч (Invitrogen, Carlsbad, CA 92008, США), 20 нг/мл ЭФРч (Invitrogen), добавку 1x N2 (Invitrogen) и 8 мкг/мл гепарина (Sigma Aldrich, St. Louis, США). Клетки осаждали при 200 г в течение 3 мин. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью трипанового синего и йодида пропидия с использованием проточного цитометра (BD Biosciences, Jose, CA 95131, США). Жизнеспособность составляла 75%. 0,5×10⁶ клеток высевали во флаконы T25. Клетки инкубировали при 37°С и 5% CO₂. К 5 дню культивирования клетки образовывали нейросферы. Нейросферы показаны на фиг.1A. На 8 день клетки переносили на DMEM/F12 с добавкой 5% FCS для обеспечения прикрепления и стимуляции пролиферации. Клетки образовывали однородный монослой, как показано на фиг.1B, и их пассировали 1:5 раз в неделю. Эта первичная нейрональная клеточная культура была названа NC5.

После 2 недель в среде с сывороткой клетки трансфицировали вектором p79 в субконфлюентных 6-луночных планшетах с использованием Effectene (Quiagen, 40724 Hilden, Германия) в качестве реагента трансфекции в соответствии с инструкциями производителя. Плазмида p79 содержит следующие элементы: в качестве основы плазмиды служит pBluescript (Stratagene, США), в которой маркер устойчивости к ампициллину был заменен геном устойчивости к канамицину под контролем бактериального промотора, который обеспечивает рост и селекцию в E.coli. Вектор несет фрагмент аденовируса типа 5 дикого типа (SEQ ID NO:5), содержащий открытые рамки считывания для E1A (сплайсинговые варианты 13S и 12S, включающие или не включающие домен CR3 соответственно) и E1B 55k и 19k, а также последовательности выше E1A. Гену E1A предшествует промотор фосфоглицераткиназы (мыши). После последовательностей аденовируса расположен сигнал полиаденилирования из гена тимидинкиназы Herpes simplex, служащий в качестве замены сигнала полиаденилирования E1B. Элементы были получены из соответствующих организмов или из донорных плазмид с помощью ПЦР и клонирования с использованием традиционных способов рекомбинантной ДНК и подтверждены секвенированием. Через два дня после трансфекции клетки трипсинизировали и переносили на 10-см чашку. Спустя две недели образовывались очаги небольших клеток с высоким соотношением ядро/цитоплазма и четко различимыми границами (фиг.1C) при использовании трансфицированных, но не ложнообработанных клеток. Из 11-й трансфекции было выделено восемь независимых очагов с использованием трипсина и цилиндров для клонирования (Corning, США), которые высевали в лунки 24-луночного планшета и наращивали в 12-луночном планшете, 6-луночном планшете и флаконах T25. Все выделенные очаги содержали два типа клеток: мелкие клетки с четкими границами и крупные фибробластоподобные клетки.

Через три недели после трансфекции стали видимыми 15 дополнительных клонов при трансфекции T11, некоторые из которых могли возникнуть из оставшихся клеток уже выделенных первичных клонов.

Клоны T11a.1 и T11a.6 проявили наиболее быстрый рост, и они были сохранены замораживанием в DMEM/F12, 10% ДМСО, 25% сыворотке через 8 недель после трансфекции. В это время все клоны все еще содержали фракцию клеток с увеличенной цитоплазмой, напоминающих исходный фенотип. Однако при отношении разделения 1:5 для T11a.1 и T11a.6 они переросли и элиминировались приблизительно через 3 месяца после трансфекции. Были проведены эксперименты с иммунофлуоресценцией для выявления связи между измененной морфологией и экспрессией E1A и E1B. После фиксации метанолом клетки обрабатывали антителами крысы против E1A и E1B 55k соответственно и затем техасским красным, конъюгированным с антикрысиными антителами. Как показано н