Связанный с раком толстого кишечника ген том34

Связанный с раком толстого кишечника ген том34

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет по условной заявке США с серийным номером No.60/703265, поданной 27 июля 2005 года, содержание которой полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам обнаружения и диагностики рака толстого кишечника, а также к способам лечения и профилактики рака толстого кишечника.

Предпосылки изобретения

Рак ободочной и прямой кишки представляет собой одну из наиболее распространенных причин смерти от злокачественной опухоли во всем мире. Несмотря на различные достижения в диагностике и лечении рака ободочной и прямой кишки, у многих пациентов рак ободочной и прямой кишки на развернутой стадии приводит к высокой смертности. Для улучшения их прогноза требуется разработка чувствительных и специфичных диагностических биомаркеров для выявления карцином на ранней стадии и разработка более эффективных и менее вредных лекарственных средств для терапии. Для достижения этой цели требуется лучшее понимание молекулярных механизмов колоректального канцерогенеза. Последние молекулярные исследования показали, что колоректальный канцерогенез вовлекает накопление генетических изменений, которые включают генетические изменения в генах опухолевой супрессии и/или онкогенах, включая APC, p53, beta-catenin и K-ras (Nishisho I, et al. Science 253: 665-669, 1991; Baker SJ, et al., Science 244: 217-221, 1989; Morin PJ, et al., Science 275: 1787-1790, 1997; Forrester K, et al., Nature 327: 298-303, 1987). В дополнение к этим типам изменений, в образование опухолей ободочной и прямой кишки вовлечены эпигенетические явления, такие как измененное метилирование (Jones PA & Laird PW, Nat Genet 21: 163-167, 1999) и потеря импринтинга (Cui H, et al., Nat Med 4: 1276-1280, 1998), и/или ослабленная регуляция контроля транскрипции путем генетических изменений или другого неизвестного механизма(ов). Относительно вовлеченных в канцерогенез генов можно ожидать, что ингибирование генных продуктов, необходимых для пролиферации и/или выживания раковых клеток, приведет к ингибированию их роста или гибели клеток. Таким образом, молекулы, которые обладают онкогенной активностью и специфично экспрессируются в раковых клетках, представляют собой перспективные мишени для разработки новых противораковых лекарственных средств.

TOM34 человека был открыт с помощью баз данных EST и кДНК для человека, и был предсказан в качестве компонента митохондриального аппарата импорта белков, поскольку предсказанный белок обладает гомологией последовательности в участке мотива из 62 остатков с известным семейством митохондриальных рецепторов Tom70 дрожжей (Nuttall SD, et al., DNA Cell Biol 16: 1067-1074, 1997). Однако последние исследования показали, что после фракционирования тканей и клеток TOM34 входит в состав, главным образом, цитозольной фракции и, частично, митохондриальной и мембранной фракции (Chewawiwat N, et al., J Biochem (Tokyo) 125: 721-727, 1999). В другом исследовании посредством иммуногистохимического окрашивания была показана его субклеточная локализация в цитоплазме клеток HeLa (Chun-Song Yand Henry Y., Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 105-110, 2002; Abhijit M, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 97-104, 2002). C помощью дрожжевой двухгибридной системы скрининга было показано, что TOM34 взаимодействует in vitro с валосин-содержащим белком (VCP), членом семейства AAA (АТФаз, ассоциированных с множеством видов клеточной активности) (Chun-Song Y, et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 400: 105-110, 2002) или с белком теплового шока массой 90 кДа (hsp90) (Young JC, et al., J Biol Chem 273: 18007-18010, 1998). Однако биологическая роль TOM34 остается неясной.

Было показано, что CD8+ цитотоксические T-лимфоциты (CTL) распознают пептиды эпитопов, образованные из опухоль-ассоциированных антигенов (TAA), представленные на молекуле MHC I класса, и лизируют опухолевые клетки. После открытия семейства MAGE в качестве первого примера TAA с использованием иммунологических подходов были открыты многие другие TAA (Boon T., Int J Cancer. 1993; 54(2):177-80, Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med. 1996; 183(3):725-9, van der Bruggen P, et. al., Science. 1991; 254(5038):1643-7, Brichard V, et. al., J Exp Med. 1993; 178(2):489-95, Kawakami Y, et. al., J Exp Med. 1994; 180(1):347-52), и некоторые из них в настоящее время находятся в процессе клинической разработки в качестве мишеней для иммунотерапии. Открытые к настоящему времени TAA включают MAGE (van der Bruggen P, et. al., Science. 1991; 254(5038):1643-7), gp100 (Kawakami Y, et. al., J Exp Med. 1994; 180(1):347-52), SART (Shichijo S, et. al., J Exp Med. 1998; 187(3):277-88), NY-ESO-1 (Chen YT, et. al., Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94(5):1914-8). В то же время было показано, что генные продукты, для которых уже показана некоторая специфичная сверхэкспрессия опухолевыми клетками, распознаются в качестве мишеней для клеточных иммунных ответов. Они включают p53 (Umano Y, et. al., Br J Cancer. 2001; 84(8):1052-7), HER2/neu (Tanaka H, et. al., Br J Cancer. 2001; 84(1):94-9), CEA (Nukaya I, et. al., Int J Cancer. 1999; 80(1):92-7) и другие.

Несмотря на то, они представляют собой примеры существенного прогресса, который был достигнут в фундаментальных и клинических исследованиях (Rosenberg SA, et. al., Nat Med. 1998; 4(3):321-7, Mukherji B, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92(17):8078-82., Hu X, et. al., Cancer Res. 1996; 56(11):2479-83), существует очень ограниченное количество TAA-кандидатов, главным образом, для лечения аденокарцином, включая рак толстого кишечника. Если существуют TAA, которые экспрессируются в большом количестве только в раковых клетках, но не в нормальных клетках, то они могут быть перспективными кандидатами для иммунотерапевтических мишеней.

Сущность изобретения

Для подтверждения роли молекул в колоректальном канцерогенезе и выявления новых терапевтических мишеней для пациентов с колоректальной карциномой (CRC), авторы настоящего изобретения получили профили экспрессии с использованием микроматрицы кДНК, состоящей из 23040 генов (Lin YM, et al., Oncogene 21: 4120-4128, 2002). Среди генов, демонстрирующих повышенную экспрессию в опухолях ободочной и прямой кишки, авторы настоящего изобретения сосредоточили внимание на TOM34 (транслоказе наружной митохондриальной мембраны массой 34 кДа), поскольку уровни его экспрессии часто были повышены, в 16 из 20 исследуемых образцов CRC. Нозерн-блот-анализ множества тканей показал высокую экспрессию этого гена в яичке и яичнике и слабую в предстательной железе, селезенке и толстом кишечнике, но не показал ее в какой-либо другой из 11 исследованных нормальных тканей взрослых. Иммуногистохимическое окрашивание TOM34 показало значительное его накопление в тканях CRC по сравнению с соответствующей им нераковой слизистой тканью.

В настоящем изобретении была подтверждена частая повышенная экспрессия TOM34 человека в CRC и его экспрессия в яичке и яичнике, но не в других 15 исследованных нормальных тканях взрослых. Поскольку супрессия этого TOM34 посредством siRNA значительно снижала рост раковых клеток толстого кишечника, генный продукт может быть потенциальной терапевтической мишенью для опухолей человека, а также пригодным диагностическим маркером.

Кроме того, полагали, что TOM34 может служить в качестве TAA (опухоль-ассоциированного антигена), который может индуцировать выраженный клеточный иммунный ответ против рака толстого кишечника. Для проверки этого предположения авторы настоящего изобретения стимулировали PBMC, полученные от здоровых добровольцев, пептидами, образованными из TOM34, а затем получили пептид-специфичные клоны CTL, которые также распознают и уничтожают опухолевые клетки, экспрессирующие антиген.

Конкретно, трансфекция раковых клеток толстого кишечника HCT116 и RKO малой интерферирующей РНК (siRNA), специфичной к TOM34, эффективно подавляла его экспрессию и значительно ингибировала рост клеток.

Кроме того, авторами настоящего изобретения исследованы пептиды с последовательностями, образованными из TOM34, в отношении их способности выступать в качестве антигенных пептидов эпитопов и разработан новый пептид эпитопа для эффективной иммунотерапии рака, которая может индуцировать выраженный клеточный иммунный ответ против рака толстого кишечника. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) здоровых доноров стимулировали, используя пептиды, имеющие неполные последовательности TOM34. Были выбраны те пептиды, для которых было прогнозировано, что они связываются с HLA-A*2402. Авторами настоящего изобретения успешно идентифицирован определенный антигенный пептид, последовательность которого образована из TOM34, который может индуцировать клеточные линии цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), демонстрирующих специфичную цитотоксичность против клеток, которые представляют антиген с ограничением по HLA-A24. Из этих клеточных линий CTL были получены клоны CTL. Последующий анализ клонов CTL показал, что они обладают выраженной цитотоксической активностью не только против нагруженных пептидом клеток-мишеней, но также против клеток, которые эндогенно экспрессируют TOM34. Кроме того, анализ ингибирования "холодной" мишенью показал, что клоны CTL специфично распознают антигенный пептид в комплексе с молекулой MHC I класса. Эти результаты убедительно подтверждают, что пептид представляет собой пептид эпитопа, ограниченный по HLA-A24, который может индуцировать сильный и специфичный иммунный ответ против раковых клеток толстого кишечника, экспрессирующих TOM34.

Эти открытия подтверждают, что TOM34 вовлечен в рост раковых клеток и может внести вклад в разработку новых противораковых лекарственных средств и/или способа диагностики CRC.

Настоящее изобретение основано на открытии паттерна экспрессии гена TOM34. Нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность TOM34 указаны в SEQ ID NO:60 и 61, соответственно. Эти последовательности также доступны в Genbank под регистрационным номером NO. AB085681.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу диагностики рака толстого кишечника или выявления предрасположенности к нему у субъекта путем определения уровня экспрессии TOM34 в полученном от пациента биологическом образце, таком как образец ткани. Нормальная клетка представляет собой клетку, полученную из ткани толстого кишечника. Изменение, например, повышение уровня экспрессии гена по сравнению с нормальным контрольным уровнем гена, указывает на то, что субъект страдает раком толстого кишечника или обладает риском его развития.

Когда он используется в контексте настоящего изобретения, термин "предрасположенность к раку толстого кишечника" включает состояние субъекта, заключающееся в наличии предрасположенности, наличии тенденции, распространенности, склонности или чувствительности к раку толстого кишечника. Кроме того, указанный термин также включает наличие у субъекта риска возникновения рака толстого кишечника.

В контексте настоящего изобретения выражение "контрольный уровень" относится к уровню экспрессии белка, выявляемому в контрольном образце. Контрольный уровень может представлять собой отдельный паттерн экспрессии, образованный одной контрольной популяцией или множеством паттернов экспрессии. Например, контрольный уровень может представлять собой базу данных паттернов экспрессии ранее тестированных клеток. "Нормальный контрольный уровень" относится к уровню экспрессии гена, выявленному у нормального здорового индивида или у популяции индивидов, о которых известно, что они не страдают раком толстого кишечника. Нормальный индивид представляет собой индивид без клинических симптомов рака толстого кишечника.

Повышение уровня экспрессии TOM34, выявленное в тестируемом образце по сравнению с нормальным контрольным уровнем, указывает на то, что субъект (от которого получен образец) страдает CRC или обладает риском его развития.

В соответствии с настоящим изобретением уровень экспрессии гена считают "измененным", когда экспрессия гена возрастает на 10%, 25%, 50% по сравнению с контрольным уровнем. Альтернативно, уровень экспрессии считают "повышенным", когда экспрессия гена повышается с кратностью, по меньшей мере, 0,1, по меньшей мере, 0,2, по меньшей мере, 1, по меньшей мере, 2, по меньшей мере, 5 или, по меньшей мере, 10 или более от контрольного уровня. Экспрессию определяют путем детектирующей гибридизации, например, зонда TOM34 с транскриптом гена полученного от пациента образца ткани.

В контексте настоящего изобретения полученный от пациента образец ткани представляет собой любую ткань, полученную от тестируемого субъекта, например, пациента, о котором известно, что у него имеется рак толстого кишечника, или у которого подозревают его наличие. Например, ткань может содержать эпителиальную клетку. Более конкретно, ткань может представлять собой эпителиальную клетку из колоректальной карциномы.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способам идентификации средства, которое ингибирует экспрессию или активность TOM34, путем контактирования тестируемой клетки, экспрессирующей TOM34, с тестируемым соединением и определения уровня экспрессии TOM34 или активности его генного продукта. Тестируемая клетка может представлять собой эпителиальную клетку, такую как эпителиальная клетка, полученная из колоректальной карциномы. Снижение уровня экспрессии TOM34 или активности его генного продукта по сравнению с контрольным уровнем или активностью гена или генного продукта указывает на то, что тестируемое соединение является ингибитором TOM34, и его можно использовать для уменьшения симптомов рака толстого кишечника.

Настоящее изобретение также относится к набору, содержащему реагент для обнаружения, который связывается с нуклеиновыми кислотами или полипептидами TOM34.

Терапевтические способы по настоящему изобретению включают способ лечения или профилактики рака толстого кишечника у субъекта, включающий стадию введения субъекту антагониста или ингибитора TOM34, который представляет собой, например, антисмысловую композицию или композицию антитела. Антагонист или ингибитор может действовать либо на уровне нуклеиновой кислоты, либо на уровне белка, так чтобы происходило снижение или ингибирование экспрессии или активности TOM34.

В контексте настоящего изобретения антисмысловая композиция снижает экспрессию определенного гена-мишени. Например, антисмысловая композиция может содержать нуклеотид, который является комплементарным последовательности TOM34. Альтернативно, данный способ может включать стадии введения субъекту композиции малой интерферирующей РНК (siRNA). В контексте настоящего изобретения композиция siRNA снижает экспрессию TOM34. В другом способе лечение или профилактику рака толстого кишечника у субъекта можно проводить путем введения субъекту рибозимной композиции. В контексте настоящего изобретения композиция специфичного к нуклеиновой кислоте рибозима снижает экспрессию TOM34. В действительности, ингибирующий эффект siRNA на TOM34 был подтвержден. Например, в разделе "Примеры" отчетливо показано, что siRNA против TOM34 ингибирует клеточную пролиферацию раковых клеток толстого кишечника. Таким образом, в настоящем изобретении TOM34 представляет собой предпочтительную терапевтическую мишень рака толстого кишечника.

Настоящее изобретение также включает вакцины и способы вакцинации. Например, способ лечения или профилактики рака толстого кишечника у субъекта может включать введение субъекту вакцины, содержащей полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой TOM34, или иммунологически активный фрагмент такого полипептида. В контексте настоящего изобретения иммунологически активный фрагмент представляет собой полипептид, который обладает длиной, более короткой, чем длина полноразмерного встречающегося в природе белка, который, тем не менее, индуцирует иммунный ответ, аналогичный иммунному ответу, индуцируемому полноразмерным белком. Например, длина иммунологически активного фрагмента должна составлять, по меньшей мере, 8 остатков, и он должен быть способен стимулировать иммунную клетку, такую как T-клетка или B-клетка. Стимуляцию иммунных клеток можно выявлять путем определения клеточной пролиферации, выработки цитокинов (например, IL-2) или продукции антитела.

Если нет иных указаний, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое значение, какое обычно понимает специалист в области, к которой относится это изобретение. Хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут быть использованы способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем документе, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание путем ссылок. Ничто в настоящем документе не следует истолковывать как допущение того, что настоящее изобретение не дает права датировать такую публикацию более ранним числом на основании предшествующего изобретения.

В случае несоответствий, руководством будет служить настоящее описание, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.

Одним из преимуществ способов, описанных в настоящем документе, является то, что заболевание идентифицируют до выявления явных клинических симптомов рака толстого кишечника. Другие признаки и преимущества данного изобретения будут понятны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 представлен уровень экспрессии гена TOM34 в различных тканях. (A) Полуколичественный ОТ-ПЦР-анализ гена TOM34 в раковых тканях толстого кишечника и соответствующей им нераковой слизистой ткани. T, опухолевая ткань; N, нормальная ткань. Экспрессия GAPDH служила в качестве внутреннего контроля. (B) Нозерн-блот-анализ TOM34 во множестве тканей. Размер транскрипта TOM34 составляет приблизительно 2,0 т.п.н.

На фигуре 2 представлен уровень экспрессии белка, кодируемого геном TOM34 в различных тканях. (A) Вестерн-блот-анализ TOM34 в раковых тканях толстого кишечника и соответствующей им нераковой слизистой ткани. T, опухолевая ткань; N, нормальная ткань. (B) Экспрессия TOM34 в клеточных линиях рака толстого кишечника. Экспрессия бета-актина служила в качестве внутреннего контроля.

На фигуре 3 представлен результат иммуногистохимического окрашивания TOM34 в раковых тканях толстого кишечника. (A и B) Репрезентативные изображения окрашивания в раковых и нераковых клетках. Увеличение: X40, (C и D) Изображения нормальной слизистой оболочки и раковых тканей (C, нормальная, D, опухолевая). Увеличение: X200.

На фигуре 4 представлен супрессирующий эффект siRNA против TOM34 на экспрессию гена TOM34 или рост клеток клеточной линии CRC. (A) Эффект siRNA на экспрессию TOM34 в клетках HCT116. Экспрессию TOM34 анализировали вестерн-блот-анализом. Экспрессия бета-актина служила в качестве внутреннего контроля. Для отрицательного контроля получали EGFP-специфичную siRNA (siEGFP). (B) Эффект TOM34-siRNA на рост клеток HCT116. Жизнеспособность клеток HCT116 в ответ на EGFP-siRNA или TOM34-siRNA определяли посредством MTT-теста в трех повторах. Величины ошибки, SD; Звездочкой указано значимое отличие (P<0,0001), определенное с помощью F-критерия Шиффа.

На фигуре 5 представлен цитотоксический эффект линии CTL, индуцированной 10-мерным пептидом TOM34-299. Для линий CTL, стимулированных 10-мерным пептидом TOM34-299, показана пептид-специфичная цитотоксичность.

Для линий CTL показана высокая цитотоксическая активность против клеток-мишеней (TISI), нагруженных TOM34-299, в то время как для них не было показано значительной цитотоксической активности против тех же клеток-мишеней (TISI), не нагруженных пептидом. Это показывает, что линии CTL обладают пептид-специфичной цитотоксичностью.

На фигуре 6 представлена сильная и пептид-специфичная цитотоксичность линий CTL, стимулированных посредством TOM34-299.

Для линий CTL показана сильная и антиген-специфичная цитотоксичность, выявляемая уже при соотношении E/T, составляющем 1,2.

На фигуре 7 представлена выраженная цитотоксичность клонов CTL. Могут быть получены клоны CTL с очень сильной цитотоксичностью, которые являются специфичными в отношении TOM34-299.

Для клонов CTL, полученных из линий CTL против TOM34-299, показаны различные активности в отношении уничтожения, где некоторые из них обладают очень сильной активностью.

На фигуре 8 представлена HLA-специфичность клонов CTL, индуцированных посредством TOM34-299. Клоны CTL, индуцированные посредством TOM34-299, распознают и лизируют опухолевые клетки, эндогенно экспрессирующие TOM34, с ограничением по HLA.

Цитотоксическую активность в отношении клеточных линий рака толстого кишечника DLD-1 и HT29, которые эндогенно экспрессируют TOM34, тестировали с использованием клонов CTL, индуцированных посредством TOM34-299 в качестве эффекторных клеток. Клетки SNU-C2A использовали в качестве мишени, которая эндогенно экспрессирует TOM34, но не экспрессирует HLA-A24. Для клонов CTL показана высокая цитотоксическая активность как против клеток DLD-1, так и против клеток HT29, которые экспрессируют TOM34, а также HLA-A24. С другой стороны, для них не показано значительной цитотоксической активности против клеток SNU-C2A, которые экспрессируют TOM34, но не экспрессируют HLA-A24.

На фигуре 9 представлена HLA-специфичность клонов CTL, индуцированных посредством TOM34-299. Клон CTL, индуцированный посредством TOM34-299, специфично распознает TOM34 с ограничением по HLA-A24.

Анализ ингибирования "холодной" мишенью проводили, как описано в "Материалах и способах". Клетки HT29, меченные Na₂ ⁵¹CrO₄, получали в качестве "горячей" мишени, а клетки TISI, нагруженные или не нагруженные пептидом TOM34-299, использовали без мечения ⁵¹Cr в качестве "холодных" мишеней. Соотношение E/T было фиксировано на 20. Цитотоксическая активность клона CTL против клеток HT29 ингибировалась путем добавления клеток TISI, только когда они были нагружены пептидом.

На фигуре 10 представлена специфичность цитотоксической активности клона CTL, индуцированного посредством TOM34-299. Цитотоксическая активность клона CTL, индуцированного посредством TOM34-299, специфично блокировалась антителами, распознающими T-клеточные поверхностные антигены HLA I класса или CD8.

Цитотоксическую активность клона CTL против клеток HT29 определяли в присутствии антител, распознающих T-клеточные поверхностные антигены. Активность CTL заметно блокировалась добавлением антител, которые распознают HLA I класса или CD8, и на нее оказывало незначительное влияние добавление антител к HLA II класса или CD4, в то же время добавление контрольного антитела с совпадающим изотипом совсем ее не ингибировало.

Подробное описание изобретения

Как это используется в настоящем описании, форма единственного числа означает «по меньшей мере, один», если нет иных конкретных указаний. На протяжении этого описания и последующей формулы изобретения, если контекст не требует иного, слово "содержать" и его варианты, такие как "содержит" и "содержащий", следует понимать как заключающее в себе указанное число или стадию, или группу чисел или стадий, но не исключающее какого-либо другого числа или стадии, или группы чисел или стадий.

Настоящее изобретение основано, частично, на выявлении повышенной экспрессии TOM34 в клетках из тканей толстого кишечника пациентов с CRC. Повышенную экспрессию гена идентифицировали с использованием комплексной системы микроматриц кДНК.

Используя микроматрицу кДНК, содержащую 23040 генов, первоначально создавали комплексные профили экспрессии генов для 20 пациентов. У пациентов с CRC TOM34 экспрессируется на высоком уровне.

Идентифицированный в настоящем изобретении TOM34 используют для диагностических целей в качестве маркера CRC и в качестве гена-мишени, экспрессию которого изменяют для лечения или смягчения симптомов CRC.

Путем определения уровня экспрессии TOM34 в образце клеток диагностируют CRC. Аналогично, путем определения уровня экспрессии TOM34 в ответ на различные средства, можно идентифицировать и средства для лечения CRC.

Настоящее изобретение предусматривает определение (например, измерение) экспрессии TOM34. Используя информацию о последовательности, предоставляемую в записях базы данных GeneBank™ для последовательности TOM34, осуществляют выявление и количественное определение TOM34 с применением способов, хорошо известных специалисту в данной области. Например, последовательность в записях базы данных последовательностей, соответствующую TOM34, используют для конструирования зонда для определения последовательности РНК TOM34, например, в анализе нозерн-блот-гибридизации. В качестве другого примера, последовательности можно использовать для конструирования праймеров для специфичной амплификации TOM34, например, в способах определения на основе амплификации, таких как полимеразная цепная реакция на основе обратной транскрипции.

Затем уровень экспрессии TOM34 в тестируемой популяции клеток, например, в полученном от пациента образце тканей, сравнивают с уровнем экспрессии TOM34 в эталонной популяции. Эталонная популяция клеток включает одну или несколько клеток, для которых известен сравниваемый параметр, т.е. клетки CRC или клетки не CRC.

В любом случае, паттерн экспрессии генов в тестируемой популяции клеток по сравнению с эталонной популяцией клеток указывает на CRC или предрасположенность к нему, в зависимости от состава эталонной популяции. Например, если эталонная популяция клеток состоит из клеток не CRC, сходные паттерны экспрессии генов в тестируемой популяции клеток и эталонной популяции клеток указывает на то, что тестируемая популяция клеток представляет собой не CRC. Напротив, если эталонная популяция клеток состоит из клеток CRC, сходный профиль экспрессии генов между тестируемой популяцией клеток и эталонной популяцией клеток указывает на то, что тестируемая популяция клеток включает клетки CRC.

Уровень экспрессии TOM34 в тестируемой популяции клеток считают измененным по уровню экспрессии, если уровень его экспрессии отличается от эталонной популяции клеток с кратностью, составляющей более чем 1,0, 1,5, 2,0, 5,0, 10,0 или более, по сравнению с уровнем экспрессии соответствующего TOM34 в эталонной популяции клеток.

Отличающуюся экспрессию гена между тестируемой популяцией клеток и эталонной популяцией клеток нормализуют по отношению к контрольной нуклеиновой кислоте, например, к гену "домашнего хозяйства". Например, контрольная нуклеиновая кислота представляет собой кислоту, о которой известно, что она не отличается в зависимости от ракового или неракового состояния клетки. Уровни экспрессии контрольной нуклеиновой кислоты в тестируемой и эталонной нуклеиновой кислоте можно использовать для нормализации уровней сигнала в сравниваемых популяциях. Контрольные гены включают β-актин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу или рибосомальный белок P1.

Тестируемую популяцию клеток сравнивают с множеством эталонных популяций клеток. Каждая из множества эталонных популяций может отличаться по известному параметру. Таким образом, тестируемую популяцию клеток можно сравнивать со второй эталонной популяцией клеток, о которой известно, что она содержит, например, клетки CRC, а также со второй эталонной популяцией, о которой известно, что она содержит, например, клетки не CRC (нормальные клетки). Тестируемая клетка входит в состав типа ткани или образца клеток от субъекта, о котором известно, что он обладает клетками CRC, или который предположительно обладает клетками CRC.

Тестируемую клетку получают из ткани организма или жидкости организма, например, из биологической жидкости (такой как кровь или моча). Например, тестируемую клетку очищают из ткани. Предпочтительно, тестируемая популяция клеток содержит эпителиальную клетку. Эпителиальная клетка представляет собой клетку из ткани, о которой известно, что она представляет собой CRC, или которая предположительно представляет собой CRC.

Клетки в эталонной популяции клеток получают из типа ткани, который является сходным с тестируемой клеткой. Необязательно, эталонная популяция клеток представляет собой клеточную линию, например клеточную линию CRC (положительный контроль) или нормальную линию клеток не CRC (отрицательный контроль). Альтернативно, контрольную клеточную популяцию получают из базы данных молекулярной информации, полученной из клеток, для которых известен анализируемый параметр или состояние.

Субъект предпочтительно представляет собой млекопитающее. Млекопитающее может представлять собой, например, человека, не относящегося к человеку примата, мышь, крысу, собаку, кошку, лошадь или корову.

Экспрессию TOM34, описанного в настоящем документе, определяют на уровне белка или нуклеиновой кислоты с использованием способов, известных в данной области. Например, для определения экспрессии гена можно использовать анализ нозерн-гибридизации с использованием зондов, которые специфично распознают последовательность. Альтернативно, экспрессию измеряют с использованием ПЦР-анализов на основе обратной транскрипции, например, с использованием праймеров, специфичных к TOM34. Экспрессию также определяют на белковом уровне, т.е. определением уровней полипептида, кодируемого генным продуктом, описанным в настоящем документе, или его биологической активности. Такие способы хорошо известны в данной области и включают, например, способы иммунологического анализа на основе антител к белку, кодируемому TOM34. Биологическая активность белка, кодируемого геном, также хорошо известна.

Диагностика CRC

В контексте настоящего изобретения CRC диагностируют путем определения уровня экспрессии TOM34 в тестируемой популяции клеток (т.е. в полученном от пациента биологическом образце). Предпочтительно, тестируемая популяция клеток содержит эпителиальную клетку, например, клетку, полученную из ткани толстого кишечника. Экспрессию генов также можно измерять в крови или других жидкостях организма, таких как моча. Для измерения уровней белка можно использовать другие биологические образцы. Например, уровень белка в крови или сыворотке, полученной от субъекта, подлежащего диагностированию, можно измерять путем иммунологического анализа или другого общепринятого биологического анализа.

Экспрессию TOM34 определяют в тестируемой клетке или биологическом образце и сравнивают с нормальным контрольным уровнем экспрессии, ассоциированным с анализируемым TOM34. Нормальный контрольный уровень представляет собой профиль экспрессии TOM34, как правило, обнаруживаемый в популяции, о которой известно, что в ней отсутствует CRC. Изменение (например, повышение) уровня экспрессии TOM34 в полученном от пациента образце указывает на то, что субъект страдает CRC или обладает риском развития CRC. Например, повышение экспрессии TOM34 в тестируемой популяции по сравнению с нормальным контрольным уровнем указывает на то, что субъект страдает CRC или обладает риском развития CRC.

Изменение TOM34 в тестируемой популяции по сравнению с нормальным контрольным уровнем указывает на то, что субъект страдает CRC или обладает риском развития CRC.

Уровень экспрессии TOM34 в биологическом образце можно оценивать количественным определением мРНК, соответствующей белку, кодируемому TOM34. Количественные способы для мРНК известны специалистам в данной области. Например, уровни мРНК TOM34 можно оценивать нозерн-блоттингом или ОТ-ПЦР. Поскольку нуклеотидные последовательности TOM34 известны, любой специалист в данной области может сконструировать нуклеотидные последовательности зондов или праймеров для количественного определения TOM34. Например, специфичный для TOM34 набор праймеров, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:43 и 44, представляет собой предпочтительный набор праймеров.

Также уровень экспрессии TOM34 можно анализировать, исходя из активности или количества белка TOM34. Способ определения количества белка TOM34 представлен ниже. Например, для определения белков в биологических материалах пригодными являются способы иммунологического анализа. В качестве биологического образца для определения белка или его активности можно использовать любые биологические материалы, при условии, что ген TOM34 экспрессируется в образце пациента с раком толстого кишечника. Например, в качестве такого биологического образца можно назвать образец ткани толстого кишечника. Однако также можно анализировать жидкости организма, такие как кровь и моча. С другой стороны, для определения активности белка, кодируемого геном TOM34, подходящий способ может быть выбран в соответствии с активностью подлежащего анализу белка.

Уровень экспрессии гена TOM34 в биологическом образце оценивают и сравнивают с уровнем в нормальном образце (например, в образце, полученном от субъекта без заболевания). Когда такое сравнение показывает, что уровень экспрессии генов выше, чем в нормальном образце, делают заключение, что субъект страдает раком толстого кишечника. Уровень экспрессии гена TOM34 в биологических образцах от нормального субъекта и субъекта, подлежащего диагностированию, можно определять одновременно. Альтернативно, нормальные диапазоны уровней экспрессии можно определять статистическим способом, исходя из результатов, полученных анализом уровня экспрессии гена в образцах, ранее полученных от контрольной группы. Результат, полученный путем сравнения образца субъекта, сравнивают с нормальным диапазоном; когда результат не соответствует нормальном диапазону, делают заключение, что субъект страдает раком толстого кишечника или обладает риском развития рака толстого кишечника.

В настоящем изобретении также предусмотрены диагностические средства для диагностики рака толстого кишечника. Диагностическое средство по настоящему изобретению содержит соединение, которое связывается с полинуклеотидом или полипептидом гена TOM34. Предпочтительно, в качестве такого соединения можно использовать олигонуклеотид, который гибридизуется с полинуклеотидом гена TOM34, или антитело, которое связывается с полипептидом, кодируемым геном TOM34. Более того, в качестве такого соединения также можно использовать аптамер, такой как РНК-, ДНК- или пептидный аптамер. Предпочтительно, диагностическое средство содержит обнаруживаемую метку, такую как флуоресцентная, люминесцентная или биолюминесцентная метка, которые широко известны в данной области.

Данный способ диагностики рака толстого кишечника можно применять для оценки эффективности лечения рака толстого кишечника у субъекта. В соответствии со способом от субъекта, подвергнутого лечению от рака толстого кишечника, получают биологический образец, такой как тестируемая популяция клеток. Способ оценки можно проводить в соответствии с общепринятыми способами диагностики рака толстого кишечника.

При необходимости, биологические образцы получают от субъекта в различные моменты времени до, в ходе или после лечения. Затем определяют уровень экспрессии гена TOM34 в биологическом образце и сравнивают с контрольным уровнем, полученным, например, для эталонной популяции клеток, которая включает клетки, о которых известно их состояние в отношении рака толстого кишечника (т.е. раковую клетку или нераковую клетку). Контрольный уровень определяют в биологическом образце, в случае которого не проводили лечение.

Если контрольный уровень получен для биологического образца, который не содержит раковых клеток, сходство между уровнем экспрессии в полученном от субъекта биологическом образце и контрольным уровнем указывает на то, что лечение является эффективным. Различие между уровнем экспрессии гена TOM34 в полученном от субъекта биологическом образце и контрольным уровнем указывает на менее благоприятный клинический исход или прогноз.

Идентификация средств, которые ингибируют экспрессию TOM34

Средство, которое ингибирует экспрессию TOM34 или активность его генного продукта, можно идентифицировать путем контактирования тестируемой популяции клеток, экспрессирующих TOM34, с тестируемым средством и последующим определением уровня экспрессии TOM34 или активности его генного продукта. Снижение уровня экспрессии TOM34 или уровня активности его генного продукта в присутствии этого средства по сравнению с уровнем экспрессии или активности в отсутствие тестируемого средства указывает на то, что средство является ингибитором TOM34 и что оно применимо для ингибирования CRC.

Тестируемая популяция клеток может представлять собой любую клетку, экспрессирующую TOM34. Например, тестируемая популяция клеток может содержать эпителиальную клетку, такую как клетка, источником которой является ткан