Пептидная фармацевтическая композиция, средство на ее основе для лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемых helicobacter pylori, и способ его использования

Пептидная фармацевтическая композиция, средство на ее основе для лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемых helicobacter pylori, и способ его использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится лекарственным средствам для лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемых Helicobacter pylori. В частности, к соединениям, предназначенным для применения в фармацевтической промышленности, и касается средства на основе фармацевтической композиции, содержащей в качестве действующего вещества пептид, обладающий специфической активностью, которое может быть использовано в медицине для лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемых Helicobacter pylori.

В изобретении используется следующая, принятая в этой области терминология, а также сокращения.

Helicobacter pylori - короткая (2,5-0,4×0,5 мкм) грамотрицательная бактерия, которая является важным патогенным микроорганизмом, вызывающим у человека гастродуоденальные заболевания. Колонизация этой бактерией эпителиальной ткани желудка ведет к развитию воспаления и к прогрессирующему хроническому гастриту со значительно увеличенным риском формирования пептической язвы желудка. На основе проведенного эпидемиологического исследования Helicobacter pylori была отнесена Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) к категории 1 (явной) человеческих канцерогенов.

Связанными с инфекцией Helicobacter pylori гастродуоденальными заболеваниями являются: гастрит, пептическая язва, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофия желудка, кишечная метаплазия, неязвенная диспепсия, MALT лимфома.

Митохондриальный механизм апоптоза инициируется, главным образом, различными повреждающими воздействиями, вызывающими увеличение проницаемости митохондриальной мембраны и выход в цитоплазму ряда митохондриальных белков, в частности цитохрома С, который связывается с белком APAF-1 и стимулирует образование его олигомеров. Это, в свою очередь, вызывает рекрутирование на образовавшийся комплекс молекул прокаспазы-9, их агрегацию, аутопроцессирование и формирование активного комплекса каспазы-9. На следующем этапе происходит рекрутирование на этот комплекс молекул прокаспазы-3 и их процессирование до активных форм, которые расщепляют ключевые мишени и вызывают апоптоз.

Апоптоз - запрограммированная или индуцированная форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматической мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду. Апоптоз является общебиологическим механизмом, ответственным за поддержание постоянства численности клеточных популяций, а также формообразование и выбраковку дефектных клеток. Нарушение регуляции апоптоза приводит к возникновению различных заболеваний, связанных с усилением или, наоборот, ингибированием апоптоза.

Под антиапоптотическим эффектом подразумевается эффект, предотвращающий индуцированную гибель клеток, приводящий к нормализации регуляции апоптоза.

Необходимо отметить, что инфицированность населения Helicobacter pylori в различных странах варьируется от 50 до 90%. Причем у большинства людей отмечается бессимптомное носительство, тогда как в 10% случаев геликобактерная инфекция приводит к развитию язвенного эффекта. Экспериментально доказано, что Helicobacter pylori способен усиливать апоптоз не только клеток эндотелия, но также макрофагов и Т-лимфоцитов, что приводит к элиминации антигенспецифических клеток, снижает эффективность механизмов иммунной защиты и способствует персистенции инфекции [А.А.Останин и соавт. Характеристика апоптоза и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью. Бюллетень СО РАМН, №1(111), 2004].

В лечении микробактериальных инфекций для эрадикации бактерий рода Н. pylori широко применяют антибиотик кларитромицин [Cellini L., Marzio L. Rifabutin based triple therapy for eradication of Н. pylori primary and secondary resistant to tinidazole and clarithromycin. - Dig Liver Dis. 2005 Jan; 37(1):33-8]. Препарат Клацид (кларитромицин, кларитросин) является синтетическим антибиотиком, применяемым для эрадикации хеликобактерной инфекции [Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. Справочник. - М.: АстраФармСервич, 2010 г.- С.657-660].

Однако следует отметить, что применение препарата Клацид имеет и негативные свойства: со стороны пищеварительной системы: рвота, стоматит, боль в эпигастрии, глоссит, тошнота, изменение вкуса, обесцвечивание языка, грибковое поражение слизистой полости рта, псевдомембранозный колит, диарея; со стороны нервной системы: головокружение, спутанность сознания, головная боль, ощущение тревоги, тревожные сновидения, бессонница, шум в ушах, галлюцинации, дезориентация, деперсонализация и психозы, потеря слуха; со стороны сердечно-сосудистой системы: удлинение интервала QT, мерцание или трепетание желудочков, тахикардия. Лабораторные показатели: гипогликемия, преходящее повышение активности печеночных трансаминаз, тромбоцитопения и лейкопения. Аллергические реакции: сыпь на коже, крапивница, в единичных случаях - синдром Стивенса-Джонсона и анафилактический шок.

При этом помимо традиционно применяемых лекарственных средств известны также соединения, в том числе пептидные соединения, пригодные для борьбы с бактериями Helicobacter pylori.

Известны соединения (бензимидазольные и имида-зопиридиновые производные), пригодные для борьбы с бактериями Helicobacter pylori, описанные в международных заявках WO 94/13290, WO 94/19346, WO 95/01351, WO 95/15324, WO 96/00224, WO 95/34554, WO 95/34553, WO 96/02534.

Известен рекомбинантный полипептид, представляющий собой поверхностно-проявляющийся антиген Helicobacter pylori с приблизительной молекулярной массой 29 кДа, и фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующих указанный антиген [патент РФ №2195463]. Рекомбинантный полипептид, описанный в патенте РФ №2195463, может быть использован для диагностики инфекций Helicobacter pylori, а также для изготовления вакцинных композиций, которые способны элисировать защитный иммунный ответ против указанной инфекции. Рекомбинантные полипептиды полезны не только для диагностики инфекций, вызываемых Helicobacter pylori, но и для профилактического применения, которые будут вызывать (элисировать) защитный иммунный ответ против таких инфекций.

Известно применение пептида формулы (I): ((X)l(Y)m)n, где пептид содержит от 3 до 200 аминокислот и где 1, m и n представляют собой целые числа от 0 до 10; Х и Y, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой катионные аминокислоты, выбранные из аргинина и лизина, в изготовлении лекарственных средств для лечения микробной инфекции [патент РФ №2396273]. В предпочтительном аспекте в изобретении, описанном в патенте РФ №2396273, предложено применение пептида в изготовлении лекарственного средства для лечения микробной инфекции. При этом под "микробной инфекцией" подразумевают инфекцию, вызванную бактериальным патогеном, который может происходить от видов бактерий, включая Helicobacter spp., например Helicobacter pylori.

Известно применение (S)-(+)-2-[4-(2-фторбензилокси)-бензиламино]пропанамида в качестве противовоспалительного агента, а также фармацевтическая композиция, обладающая противовоспалительной активностью, включающая фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество и в качестве активного агента (S)-(+)-2-[4-(2-фторбензилокси)бензиламино]пропанамид в количестве, эффективном для уменьшения или предотвращения воспаления [патент РФ №2396251]. Воспалительные состояния у млекопитающих, включая людей, которые могут быть вылечены введением одного или более α-аминоамидных соединений формулы, включают заболевания желудочно-кишечного тракта, в том числе язвы, гингивит, болезнь Крона, атрофический гастрит, gastritis varialoforme, язвенный колит, глютеновая болезнь, местный илеит, пептические язвы, изжога и другие повреждения ЖК тракта, например Helicobacter pylori.

Известен полипептид, гомологичный полипептиду, экепрессируемому Eurotinium amstelodami, обладающий противомикробной активностью, и может быть использован для применения в качестве лечебного или профилактического средства человеку [патент РФ №2393224]. Противомикробные полипептиды, описанные в патенте РФ №2393224, пригодны также для составов для уничтожения микробов in vitro, в частности, когда нежелательно применять множество общепринятых антибиотиков. Например, противомикробные полипептиды согласно изобретению можно добавлять в пищевые препараты для животных и/или человека или их можно включать в качестве добавок в культуры клеток in vitro для предотвращения избыточного роста микробов в культуре ткани. При этом чувствительность конкретного микроба к уничтожению посредством противомикробных полипептидов согласно изобретению можно определять посредством анализа in vitro. Представляющие интерес микробы включают в том числе Helicobacter sp., например Helicobacter pylori.

Известно применение аллиламиновых производных, таких как тербинафин, в изготовлении лекарственного средства инфекции Helicobacter pylori или ассоциированных заболеваний [патент РФ №2193402].

Известно применение производных хинолон- и нафтиридонкарбоновой кислот, которые замещены в 7-положении радикалом 2-окса-5,8-диазабицикло-[4,3,0]-нон-8-ил, а также их солей для лечения Helicobacter pylori-инфекций и связанных с ними гастродуоденальных заболеваний [патент ЕА №2477].

К недостаткам известных средств и композиций можно отнести их неспецифическое действие.

Из уровня техники известен пептид глутамил-аспартил-глицин общей формулы: H-Glu-Asp-Gly-OH [Регистрационный номер RN-75007-24-8 согласно STN int. BD Registry Chemical abstract].

Известно также, что пептид H-Glu-Asp-Gly-OH обладает стресспротекторным действием [патент RU №2304444, 2006].

Кроме того, известно, что пептид H-Glu-Asp-Gly-OH обладает противоопухолевым действием [патент RU №2362579, 2009].

В процессе дальнейшего экспериментального изучения пептида глутамил-аспартил-глицин общей формулы: H-Glu-Asp-Gly-OH было выявлено его ранее неизвестное свойство, проявляющееся в оказании специфической активности, выражающейся в ингибирующем действии на митохондриальные механизмы апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемого Helicobacter pylori.

Учитывая распространенность (по оценкам ВОЗ, носителями Helicobacter pylori является примерно 50% населения Земли) связанных с инфекцией Helicobacter pylori гастродуоденальных заболеваний, разработка новых групп препаратов, в том числе биологически активных соединений, обладающих при этом специфической активностью, является актуальной.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения фармацевтической композиции, обладающей специфической активностью, средства на ее основе и способа его использования путем ингибирования митохондриальных механизмов апоптоза, индуцируемого Helicobacter pylori.

Технический результат изобретения заключается в проявлении пептидом глутамил-аспартил-глицин формулы: H-Glu-Asp-Gly-OH специфической активности, выражающейся в ингибирующем действии на митохондриальные механизмы апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемого Helicobacter pylori при применении его в качестве действующего вещества в фармацевтической композиции для изготовления средства для лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемых Helicobacter pylori, введение которого субъекту, нуждающемуся в этом, оказывает протекторное действие на митохондриальные механизмы апоптоза, индуцируемого Helicobacter pylori, препятствует действию микроба на клетки, путем ингибирования процесса апоптоза, индуцируемого Helicobacter pylori.

Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Одним из аспектов изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая специфической активностью, выражающейся в ингибирующем действии на митохондриальные механизмы апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемого Helicobacter pylori, характеризующаяся тем, что в качестве действующего вещества содержит эффективное в отношении Helicobacter pylori количество пептида формулы H-Glu-Asp-Gly-OH и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно изобретению фармацевтическая композиция содержит действующее вещество в количестве от 1 до 10 мкг/кг.

Согласно изобретению фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для перорального или парентерального введения.

Изобретение касается применения фармацевтической композиции для изготовления средства для лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемой Helicobacter pylori.

Другим аспектом изобретения является средство для лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемых Helicobacter pylori, содержащее в качестве действующего вещества эффективное в отношении Helicobacter pylori количество пептида формулы H-Glu-Asp-Gly-OH и фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно изобретению средство содержит действующее вещество в количестве от 1 до 10 мкг/кг.

Следующим аспектом изобретения является способ лечения гастродуоденальных заболеваний, вызываемых Helicobacter pylori путем ингибирования митохондриальных механизмов апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемого Helicobacter pylori, заключающийся в том, что субъекту, нуждающемуся в этом, вводят эффективное в отношении Helicobacter pylori количество пептида формулы H-Glu-Asp-Gly-OH в дозе от 1 до 10 мкг на 1 кг массы тела перорально ежедневно 3 раза в день в течение 10-20 дней или парентерально однократно ежедневно в течение 10 дней.

Согласно изобретению введение осуществляют перорально или парентерально.

Пептид глутамил-аспартил-глицин формулы: H-Glu-Asp-Gly-OH получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, содержащими сведения экспериментального характера, полученными по методикам, принятым в данной области.

Изучение биологической активности проводили на животных в экспериментальной модели язвенной болезни желудка, ассоциированной с Helicobacter pylori.

Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид, обладающий специфической активностью, выражающейся в действии на митохондриальные механизмы апоптоза, индуцируемого Helicobacter pylori, которые могут найти лечебное применение в качестве средства для профилактики и терапии инфекции, вызываемой Helicobacter pylori, и связанных с ней гастродуоденальных заболеваний.

Понятие «эффективное в отношении Helicobacter pylori количество пептида» подразумевает использование такого количества действующего вещества, которое определено в условиях эксперимента in vivo и которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме. Фармацевтически приемлемые носители выбирают из группы включенных в Государственную Фармакопею XII издания вспомогательных веществ, используемых для создания готовой лекарственной формы в виде таблеток или капсул (для перорального применения) или 0,9% раствор натрия хлорида (для парентерального введения).

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество пептида H-Glu-Asp-Gly-OH как действующее вещество смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Сущность изобретения поясняется фигурами.

На Фиг.1 представлена фотография, культура фибробластов, где а - 1 сутки культивирования; б - 3 сутки культивирования; в - 5 сутки культивирования. x600.

На Фиг.2 представлена экспрессия митохондриального GPF в фибробластах, где а - контроль; б - действие Helicobacter pylori; в - действие пептида H-Glu-Asp-Gly-OH. x1000.

На Фиг.3 представлена экспрессия митохондриального GPF в фибробластах, где а - контроль; б - действие Helicobacter pylori; в - действие пептида H-Glu-Asp-Gly-OH. x1000.

На Фиг.4 представлены показатели экспрессии митохондриального GFP в фибробластах при действии Helicobacter pylori и пептида H-Glu-Asp-Gly-OH.

На Фиг.5 представлена экспрессия митохондриального GPF в эпителиальных клетках желудка, а - контроль, б - действие Helicobacter pylori, в - действие пептида H-Glu-Asp-Gly-OH. Увеличение ×1000.

На Фиг.6 представлены показатели оптической плотности экспрессии mtxGFP в культурах эпителиоцитов желудка человека (Н.Руl-).

На Фиг.7 представлены показатели площади экспрессии mtxGFP в культурах эпителиоцитов желудка человека (Н.Руl+).

На Фиг.8 представлены показатели площади экспрессии mtxGFP в культурах эпителиоцитов желудка человека (Н.Руl-).

На Фиг.9 представлены показатели оптической плотности экспрессии mtxGFP в культурах эпителиоцитов желудка человека (Н.Руl+).

На Фиг.10 представлена экспрессия протеинов в ткани из края язвы. Исследование in vivo. Вестерн-блоттинг. Уровень экспрессии выражен в % по отношению к контрольным значениям, принятым за 100%.

На Фиг.11 представлена экспрессия мРНК протеинов в слизистой оболочке из края язвы желудка. Исследование in vivo. ПЦР-РВ. Значения экспрессии представлены в у.е., отражающих насыщенность окраски геля.

На Фиг.12 представлен патоморфоз индуцированной язвы желудка. А - 7 сутки (язва без введения пептида H-Glu-Asp-Gly-OH); Б - 21 сутки (язва без введения пептида H-Glu-Asp-Gly-OH); В - 21 сутки (полная эпителизация язвы после введения пептида H-Glu-Asp-Gly-OH в дозе 2,5 мкг/кг).

На Фиг.13 представлена экспрессия митохондриального GFP в эпителии желудка на 7-е сутки после индукции язвы.

На Фиг.14 представлена экспрессия митохондриального GFP в эпителиальных клетках желудка на 15 сутки после индукции язвы. А - интактные животные; Б - индукция язвы; В -действие пептида H-Glu-Asp-Gly-OH. ×1000.

На Фиг.15 представлена экспрессия митохондриального GFP в изолированных митохондриях эпителиальных клеток желудка на 21 сутки после индукции язвы. А - интактные животные; Б - индукция язвы; В - действие пептида H-Glu-Asp-Gly-OH. x1200.

На Фиг.16 представлена экспрессия митохондриального GFP в эпителии желудка на 15-е сутки после индукции язвы.

На Фиг.17 представлена экспрессия митохондриального GFP в эпителии желудка на 21-е сутки после индукции язвы.

Изобретение также иллюстрируется примерами: синтез пептида глутамил-аспартил-глицин общей формулы: H-Glu-Asp-Gly-OH (пример 1), изучение действия фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Gly-OH на молекулярно-клеточные механизмы апоптоза (пример 2), изучение биологической активности и эффектов пептида H-Glu-Asp-Gly-OH на митохондриальные механизмы апоптоза в эпителиоцитах желудка (пример 3), изучение биологической активности и эффектов пептида H-Glu-Asp-Gly-OH на митохондриальные механизмы апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемые микробом Helicobacter pylori, in vivo (пример 4), изучение токсичности пептида H-Glu-Asp-Gly-OH (пример 5).

Пример 1

Синтез пептида H-Glu-Asp-Gly-OH

1. Название соединения: глутамил-аспартил-глицин.

2. Структурная формула:Н-Glu-Аsр-Glу-ОН

3. Брутто-формула без противоиона: C₁₁H₁₇N₃O₈.

4. Молекулярный вес без противоиона: 319,27.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме:

BОС - третбутилоксикарбонильная группа,

OSu - N-оксисукцинимидный эфир,

DCC - N,N'-дициклогексилкарбодиимид,

OBzl - бензиловый эфир,

TFA - трифторуксусная кислота,

HOBt - N-оксибензотриазол.

Характеристики готового препарата:

- Содержание основного вещества: 97,93% (по ВЭЖХ, 220 нм),

- ТСХ - индивидуален, R_f=0,45 (ацетонитрил-вода 1:2),

- Содержание влаги: 6%,

- рН 0,01% раствора: 4,9,

- Удельное оптическое вращение: [α]_D ²²: -31° (с=1, Н₂O), "Polamat A", Carl Zeiss Jena. Пример синтеза:

1) BOC-Glu(OBzl)-OSu, N-оксисукцинимидный эфир N-третбутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутаминовой кислоты (I).

N-третбутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутаминовую кислоту BOC-Glu(OBzl)-OH (33,7 г, 0,1 моль) растворяли в 50 мл N,N'-диметилформамида, охлаждали до температуры -10°С, добавляли при перемешивании охлажденные (4-6°С) растворы N,N'-дициклогексилкарбодиимида (23,0 г, 0,11 моль) в 30 мл N,N'-диметилформамида и N-гидроксисукцинимида (13,0 г, 0,11 моль) в 20 мл N,N'-диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при охлаждении льдом и далее в течение 1 суток при комнатной температуре. Выпавшую N,N'-дициклогексилмочевину отфильтровывали и полученный раствор активированного эфира использовали без выделения на следующей стадии.

2) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH, N-третбутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартат (II).

(β-бензил) аспарагиновую кислоту H-Asp(OBzl)-OH (28,0 г, 0,12 моль) и 36 мл (0,12 моль) триэтиламина суспендировали в 50 мл N,N'-диметилформамида и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавили порциями раствор активированного эфира BOC-Glu(OBzl)-OSu (I), полученный на предыдущей стадии. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем подкисляли 0,5 н серной кислотой до рН 2-3 и экстрагировали этилацетатом 4×50 мл. Вытяжки объединяли и последовательно промывали 0,5 н Н₂SO₄ 3×50 мл, водой 2×50 мл, 5% раствором NаНСО₃ 2×50 мл, водой 2×50 мл, насыщенным раствором NaCl 2×50 мл. Органический слой сушили над Nа₂SO₄, упаривали растворитель в вакууме, остаток кристаллизовали под гексаном. Получено 50 г продукта (92%). R_f=0,34 (бензол-ацетон 2:1).

3) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (III), бензиловый эфир N-третбутилоксикарбонил-(γ-бензил)глутамил-(β-бензил)аспартил-глицина (III).

2,7 г (5 ммоль) дипептида и 0,95 г (7 ммоль) оксибензотриазола растворяли в тетрагидрофуране (10 мл) и охлаждали до температуры -10°С. 1,44 г (7 ммоль) дициклогексилкарбодиимида растворяли в 5 мл тетрагидрофурана и охлаждали до той же температуры. 3,4 г (10 ммоль) тозилата бензилового эфирав глицина растворяли в 10 мл тетрагидрофурана, добавляли 1,4 мл (10 ммоль) триэтиламина и охлаждали до той же температуры. При охлаждении на ледяной бане и интенсивном перемешивании объединяли растворы дипептида с оксибензотриазолом и карбодиимида, через 10 мин добавляли раствор тозилата бензилового эфира глицина. Реакционную смесь перемешивали в течение 3 ч при охлаждении льдом и в течение 1 суток при комнатной температуре. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме, остаток растворяли в этилацетате (100 мл). Раствор промывали последовательно 0,5 н серной кислотой, водой, 5% раствором бикарбоната натрия, водой, сушили над безводным сульфатом натрия. Этилацетат упаривали в вакууме, кристаллизация остатка в системе этилацетат/гексан. Перекристаллизация из изопропанола. Получено после сушки в вакууме 2,74 г продукта (85%). R_f=0,78 (бензол-ацетон 1:1).

4) H-Glu-Asp-Gly-OH (IV), глутамил-аспартил-глицин.

Защищенный трипептид BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (III) (2,7 г) растворяли в смеси метиловый спирт-вода (4:1) (50 мл) и гидрировали над катализатором Pd/C (5%) в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над KОН и Р₂O₅. Далее продукт растворяли в 15 мл смеси хлористый метилен-трифторуксусная кислота (5:1) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч. Полноту прохождения реакции деблокирования контролировали по ТСХ в системе ацетонитрил-вода (1:3). Растворитель упаривали в вакууме, остаток сушили в вакууме над KОН.

Для очистки 300 мг препарата растворяли в 4 мл 0,01% трифторуксусной кислоты и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50×250 мм Diasorb-130-C16T, 7mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования А: 0,1% TFA; В; MeCN/0,1% TFA, градиент В 0 → 50% за 100 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при 215 нм, сканирование 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию основного пика. Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С, упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты.

Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали. Получено 150 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.

5) Анализ готового препарата.

- Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex С 18 LUNA 4,6×150 mm. A: 0,1% TFA, В: MeCN; grad.B 0-100% in 10 min. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20µl. Содержание основного вещества 97,93%.

- ТСХ: индивидуален, R_f=0,45 (ацетонитрил-вода 1:2, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

- Содержание влаги: 6% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100°С).

- рН 0,01% раствора: 4,9 (потенциометрически).

- Удельное оптическое вращение: [α]_D ²²: -31° (с=1, Н₂О), "Polamat A", Carl Zeiss Jena.

Основное (или действующее) вещество, изготовленное в виде сухого препарата, может быть превращено в фармацевтическую композицию, отвечающую изобретению, путем добавления фармацевтически приемлемого носителя.

Для получения готовой лекарственной формы средства для профилактики или лечения инфекции, вызываемой Helicobacter pylori, фармацевтически приемлемые носители выбирают из группы включенных в Государственную Фармакопею XII издания вспомогательных веществ, используемых для создания готовой лекарственной формы в виде таблеток или капсул (для перорального применения) или 0,9% раствор натрия хлорида (для парентерального введения).

Пример 2. Изучение действия фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, на молекулярно-клеточные механизмы апоптоза

Изучение действия фармацевтической композиции, содержащей в качестве действующего вещества пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, на молекулярно-клеточные механизмы апоптоза проводили на диком типе мышиных эмбриональных фибробластов (MEF+/+, нокаутная линия мышей LMNA). Клетки культивировали при температуре 37°С во влажной инкубационной среде, содержащей 5% СO2 in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ICN Biomedicals) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Предварительное разделение клеток для пассирования в соотношении 1:3-1:5 проводили, используя смесь 0.125% трипсина, 0.02М EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.02% глюкозы, растворенной в фосфатном буфере. Клетки пассировали в культуральной среде в течение 5 суток, после чего забирали для исследования.

В культуральную среду на 5 сутки после начала пассирования клеток вводили пептид H-Glu-Asp-Gly-OH в дозе 10 µМ и через 30 мин клетки забирали для исследования.

Helicobacter pylori (Curtin Matheson Scientific Inc, штамм Cag J117, 100 микробных клеток) добавляли в культуральную среду, в которой культивировались мышиные эмбриональные фибробласты, на 5 сутки культивирования, инкубировали в течение 7 часов для деструкции митохондрий (известный эффект действия данного микроба приводит к разрыву мембраны митохондрий с образованием реактивных форм кислорода и высвобождением апоптогенных факторов, служащих сигналом для активации финальной эффекторной стадии апоптоза), после чего фибробласты забирали для исследования.

На 5 сутки культивирования мышиных эмбриональных фибробластов в культуральную среду вводили также пептид H-Glu-Asp-Gly-OH в дозе 10 µM за 30 мин до введения в культуральную среду Helicobacter pylori, после инкубации в течение 7 часов вместе в Helicobacter pylori фибробласты забирали для исследования.

Состояние изолированных митохондрий оценивали при помощи иммунофлюоресцентной конфокальной лазерной микроскопии.

Лизис клеток для изоляции митохондрий осуществляли в изотоническом буфере (200 mM маннитола, 70 mM сахарозы, 1 mM EGTA - ethylene glycol tetraacetic acid, 10 mM HEPES - 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), pH 6.9) в течение 30 мин. Неразрушенные клетки, ядра и мембраны отделяли центрифугированием (1000 g, 5 мин). Для получения обогащенной фракции митохондрий супернатант дополнительно центрифугировали (12000 g, 20 мин). Фракцию, содержащую изолированные митохондрий, помещали в двуслойные стекла с камерами 4.3 мм² (Nalge Nunc Inc.). В каждую камеру добавляли 2.0 мкл моноклональных антител к митохондриальному зеленому флуоресцентному протеину (mito-GFP, Clontech Laboratories, Inc.) и инкубировали в течение 1 часа.

Конфокальную микроскопию митохондрий с определением оптической плотности проводили в инвертированном конфокальном микроскопе Olympus Fluoview CM FV300-IХ70 с использованием апохроматического объектива 606 UPlan (Olympus). Для спецификации флуоресценции mito-GFP, верифицирующей структуру митохондрий в каждой камере использовали волну возбуждения аргонового лазера 488 нм.

Наблюдение за культурой фибробластов в контроле показало, что монослой через 1 сутки был целостным и равномерным, фибробласты сохраняли обычную форму и размеры. Плотность монослоя составляла 774 клетки/мм². Время удвоения культуры составило 24 часа. Вид монослоя и структура клеток не отличались от обычных в течение всех 5 суток наблюдения. Плотность монослоя на 3 сутки составила 1519 клеток/мм².

На 5 сутки эксперимента клетки достигали оптимальной для данной культуры плотности насыщения, которая составила 2020 клеток/мм², что обеспечило переход культуры в стационарную фазу роста, в которой фибробласты имели обычную для этих клеток удлиненную форму, 2-4 отростка, клеточная и ядерная оболочки четко контурировались (Фиг.1), цитоплазма клеток была гомогенной.

Большинство клеток имели 1 центрально расположенное ядро правильной округлой формы с 1 или 2 ядрышками. В этой фазе клетки находились в оптимальном состоянии для изучения их структуры и функции.

Helicobacter pylori индуцировал фрагментацию митохондрий, которые распадались на фрагменты различной формы и размеров, происходило разрушение мембраны и крист митохондрий, снижалась интенсивность флуоресценции митохондриального GFP, что отражалось на показателях оптической плотности (Фиг.2-4).

При действии фармацетивческой композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, отмечалась сохранность очертаний и структуры митохондрий, свечение митохондриального GFP по показателям оптической плотности даже превышало контрольные показатели, что свидетельствует о присутствии у исследуемого пептида выраженных свойств превенции нарушения митохондриального пути апоптоза под действием Helicobacter pylori.

Таким образом, проведенные исследования позволили детализировать механизм биологической активности фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, и ее действия на митохондриальный путь инициации апоптоза.

Установленный в процессе проведения исследований выраженный антиапоптотический эффект фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, реализуемый путем блокады митохондриального каскада выработки проапоптозных каспаз, является обнадеживающим для ее прикладного использования в терапии патологических состояний, связанных с гибелью клеток или извращением пути их нормальной дифференцировки, особенно для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (а также связанной с этой патологией возможной опухолевой метаплазии), ассоциированной с Helicobacter pylori, поскольку пептид препятствует действию микроба на клетки путем ингибирования митохондриальных механизмов апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемого Helicobacter pylori, демонстрируя мощный антиапоптотический эффект по отношению к клеткам.

Пример 3. Изучение биологической активности и эффектов пептида H-Glu-Asp-Gly-OH на митохондриальпые механизмы апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемые микробом Helicobacter pylori

Для оценки биологической активности и эффектов пептида H-Glu-Asp-Gly-OH на митохондриальные механизмы апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемые микробом Helicobacter pylori, изучали эпителиальные клетки желудка человека SGC7901. Клетки культивировали при температуре 37°С во влажной инкубационной среде, содержащей 50 mL/L СО₂ в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, ICN Biomedicals) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Предварительное разделение клеток для пассирования в соотношении 1:3-1:5 проводили, используя смесь 0.125% трипсина, 0.02М EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.02% глюкозы, растворенной в фосфатном буфере. Клетки размещали в количестве 10⁶ клеток на лунку в планшете из 24 лунок. Клетки пассировали в культуральной среде в течение 5 суток, после чего забирали для исследования.

В культуральную среду на 5 сутки после начала пассирования клеток вводили пептид Н-Glu-Asp-Gly-OH в дозе 10 µM и через 30 мин инкубации клетки забирали для исследования. В качестве позитивного контроля при тех же условиях в культуры вводили антибиотик клацид (Clarithromycin, Abbott) в дозе 500 ng/mL.

Helicobacter pylori (Curtin Matheson Scientific Inc, штамм Cag J117, 100 микробных клеток) добавляли в культуральную среду, в которой культивировались эпителиоциты желудка человека, на 5 сутки культивирования, инкубировали в течение 7 часов для деструкции митохондрий (известный эффект действия данного микроба приводит к разрыву мембраны митохондрий с образованием реактивных форм кислорода и высвобождением апоптогенных факторов, служащих сигналом для активации финальной эффекторной стадии апоптоза), после чего эпителиоциты забирали для исследования.

На 5 сутки культивирования эпителиоцитов желудка человека в культуральную среду вводили пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, что соответствует дозе 10 µМ, за 30 мин до введения в культуральную среду Helicobacter pylori, через 7 часов инкубирования после добавления в среду Helicobacter pylori (штамм Cag J117, 100 микробных клеток) эпителиоциты забирали для исследования. В качестве позитивного контроля при тех же условиях в культуры вводили антибиотик клацид (Clarithromycin, Abbott) в дозе 500 ng/mL.

Состояние изолированных митохондрий оценивалось при помощи иммунофлюоресцентной конфокальной лазерной микроскопии.

Лизис клеток для изоляции митохондрий осуществляли в изотоническом буфере (200 mM маннитола, 70 mM сахарозы, 1 mM EGTA - ethylene glycol tetraacetic acid, 10 mM HEPES - 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), pH 6.9) в течение 30 мин. Неразрушенные клетки, ядра и мембраны отделяли центрифугированием (1000 g, 5 мин). Для получения обогащенной фракции митохондрий супернатант дополнительно центрифугировали (12000 g, 20 мин). Фракцию, содержащую изолированные митохондрии, помещали в двуслойные стекла с камерами 4.3 мм² (Nalge Nunc Inc.). В каждую камеру добавляли 2.0 мкл моноклональных антител к митохондриальному зеленому флуоресцентному протеину (mito-GFP, Clontech Laboratories, Inc.) и инкубировали в течение 1 часа.

Конфокальную микроскопию митохондрий с определением оптической плотности проводили в инвертированном конфокальном микроскопе Olympus Fluoview CM FV300-IX70 с использованием апохроматического объектива 606 UPlan (Olympus). Для спецификации флуоресценции mito-GFP, верифицирующей структуру митохондрий в каждой камере, использовали волну возбуждения аргонового лазера 488 нм.

В контроле митохондрии в эпителиальных клетках желудка имели нормальную округлую или овальную форму с отчетливой флуоресценцией крист и матрикса. Экспрессия митохондриального GFP была выраженной и составляла 2.57±0.23 у.е. по показателю оптической плотности и 3.42±0.19% по показателю средней площади экспрессии (Фиг.5-9). Введение в культуральную среду Helicobacter pylori вызывало четкую фрагментацию митохондрий, которая сопровождалась разрушением мембраны и крист митохондрий, снижалась интенсивность флуоресценции митохондриального GFP, что приводило к резкому снижению показателей экспрессии маркера (0.35±0.05 у.е. по оптической плотности; 0.63±0.03% по средней площади экспрессии) (Фиг.5-9). При действии фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, отмечалась сохранность очертаний и структуры митохондрий, экспрессия митохондриального GFP практически не отличается от контрольных показателей (2.48±0.17 у.е. по оптической плотности; 3.84±0.20% по площади экспрессии), что свидетельствует о присутствии у фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, выраженных свойств превенции нарушения митохондриального пути апоптоза, возникающего под действием Helicobacter pylori. При этом следует отметить, описанная биологическая активность фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Gly-OH, сравнима по своей эффективности с активностью известного антибиотика клацида, применяемого в качестве антибактериального препарата при лечении патологии желудка, ассоциированной с микробом Helicobacter pylori.

Пример 4. Изучение биологической активности и эффектов пептида H-Glu-Asp-Gly-OH на митохондриальные механизмы апоптоза в эпителиоцитах желудка, индуцируемые микробом Helicobacter pylori, in vivo

Исследование проведено на 90 самцах крыс линии Спрэйг-Доули (180-220 г), которые методом рандомизации были разделены на 9 групп (по 10 животных):

- 1 группа - интактные крысы (введение физраствора)

- 2 группа - моделирование язвы+введение физраствора

- 3 группа (6 подгрупп) - моделирование язвы+введение H-Glu-Asp-Gly-OH

- 4 группа - моделирование язвы+введение антибиотика клацида

Язву моделировали путем трехкратного введения (через 4 часа) через зонд в желудок крысы цистамина-НСL(Аldricg, Milwannee, WI) в дозе 25 мг/100 г массы тела. При этом язва размером примерно 28 мм² возникала на границе антрального и фундального отдела желу