Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по альтернативному пути

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с9 комплемента человека по альтернативному пути

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Способ определения функциональной активности компонента С9 до настоящего времени не описан.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С9 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора альтернативного пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека и набора для его осуществления. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата лизоцима, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесения в лунки микропланшета сыворотки морской свинки, как источника всех активных компонентов комплемента, и анализируемой пробы, содержащей компонент С9 с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит формирование и сорбция на поверхности лунок микропанели мембраноатакующего комплекса С5b6789, содержащего в своем составе, наряду с компонентом С9 морской свинки, активный компонент С9 человека в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С9 в анализируемой пробе. Количество связавшегося в результате активации комплемента компонента С9 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С9 - фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного компонента С9 образовывать мембраноатакующий комплекс в результате активации комплемента. Тем самым достигается определение функциональной активности С9 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С9 комплемента человека, комплемент морской свинки, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С9 по альтернативному пути, обладающих хорошей воспроизводимостью результатов.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента С9 по альтернативному пути. Растворяют активатор альтернативного пути комплемента - аптечный препарат лизоцима в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 10 мМ этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусную кислоту и 5 мМ MgCl₂ (VBS-Mg-EGTA), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора VBS-Mg-EGTA, содержащего препарат морской свинки в количествах, соответствующих 0,1 мкл сыворотки морской свинки, и анализируемую пробу, содержащую компонент С9 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, (ЗФР-Т) и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С9 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С9 рассчитывают по стандартной кривой (рис.1). На рис.1 изображено определение содержания активного С9 в пробах методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С9 комплемента человека, комплемент морской свинки, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С9.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента С9, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С9 описанным способом с использованием описанного набора.

1. Способ определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека по альтернативному пути, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели для иммунологического анализа аптечного препарата лизоцима, внесение в лунки микропанели анализируемой пробы, содержащей компонент С9 комплемента человека с неизвестной активностью, и препарат комплемента морской свинки, инкубацию, осушение планшета и отмывку, внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С9 человека и субстрата этого фермента с последующим проведением расчета активности компонента С9 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным лизоцимом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С9 комплемента человека, комплемент морской свинки, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С9.