Вариантные формы уратоксидазы и их применение

Вариантные формы уратоксидазы и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущество по предварительной заявке на патент США № 60/670573, поданной 11 апреля 2005, описание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным белкам с уриколитическим действием. Конкретнее, данное изобретение относится к белкам, содержащим укороченную уратоксидазу, и способам их получения.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Термины уратоксидаза и уриказа используются в настоящем описании взаимозаменяемо. Уратоксидазы (уриказы; E.C. 1.7.3.3) представляют собой ферменты, которые катализируют окисление мочевой кислоты до более растворимого продукта, аллантоина, пуринового метаболита, который легче экскретируется. В организме человека не вырабатывается ферментативно активная уриказа в результате нескольких мутаций в гене урокиназы, приобретенных во время эволюции высших приматов. Wu, X, et al., (1992) J MoI Evol 34:78-84 в полном объеме включено в настоящее описание в качестве ссылки. Вследствие этого у предрасположенных индивидуумов избыточные концентрации мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) могут привести к тяжелому артриту (подагра), обезображивающим отложения солей мочевой кислоты (подагрический узел) и почечной недостаточности. У некоторых пораженных индивидуумов доступные лекарственные средства, такие как аллопуринол (ингибитор синтеза мочевой кислоты), вызывают побочные эффекты, ограничивающие лечение, или не облегчают эти состояния в достаточной мере. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76: 47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4: 177-192 каждый включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Инъекции уриказы могут снизить гиперурикемию и гиперурикозурию, по меньшей мере, временно. Поскольку уриказа является чужеродным белком для человека, даже первая инъекция неизмененного белка, выделенного из Aspergillus flavus, вызывала анафилактические реакции у некоторого процента получавших лечение пациентов (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemia 11: 1813-1816 включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), и иммунологические реакции ограничивают его применение для постоянного или периодического лечения. Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Med 10: 711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50: 553-554 каждая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Субоптимальный режим доступных схем лечения гиперурикемии принят в течение нескольких десятилетий. Kissel, P, et al., (1968) Nature 217: 72-74 включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Подобным образом, возможность того, что некоторым группам пациентов с тяжелой подагрой может быть полезна безопасная и эффективная форма инъецируемой уриказы, признана в течение многих лет. Davis, FF, et al., (1978) in GB Broun, et al., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, et al., (1979) Enzyme 24: 261-264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26: 49-53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2(8241): 281-283; Abuchowski, A, et al., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219: 352-354; Chen, RH-L, et al., (1981) Biochim Biophys Acta 660: 293-298; Chua, CC, et al., (1988) Ann Int Med 109: 114-117; Greenberg, ML, et al., (1989) Anal Biochem 176: 290-293, каждая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Уриказы, полученные из органов животных, являются практически нерастворимыми в растворителях, которые соответствуют безопасному введению посредством инъекции. Патент США № 3616231 включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Некоторые уриказы, полученные из растений или микроорганизмов, являются более растворимыми в приемлемых с медицинской точки зрения растворителях. Тем не менее, инъекция микробных ферментов быстро вызывает иммунологические реакции, которые могут привести к опасным для жизни аллергическим реакциям или к инактивированию и/или ускорению клиренса уриказы из кровообращения. Donadio, et al., (1981); Leaustic, et al., (1983). Ферменты, основанные на установленных аминокислотных последовательностях уриказ млекопитающих, в том числе свиньи и бабуина, или насекомых, например Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, et al., (1990) Mol Cell Biol 10: 5114-5127 включены в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме), не являются подходящими кандидатами для клинического применения по причине иммуногенности и нерастворимости при физиологическом рН.

Ранее исследователи использовали инъецируемую уриказу для катализа перехода мочевой кислоты в аллантоин in vivo. См. Pui, et al., (1997). Это лежит в основе применения во Франции и Италии уриказы, полученной из грибка Aspergillus flavus (Uricozyme®) для профилактики или временной коррекции гиперурикемии, связанной с цитотоксической терапией гематологических злокачественных новообразований и для временного уменьшения тяжелой гиперурикемии у больных подагрой. Potaux, L, et al., (1975) Nouv Presse Med 4: 1109-1112; Legoux, R, et al., (1992) J Biol Chem 267: 8565-8570; Патенты США №№ 5382518 и 5541098 каждый включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. По причине его короткого времени жизни в кровотоке необходимы ежедневные инъекции Uricozyme®. Более того, этот препарат не подходит для длительного применения по причине его иммуногенности.

Некоторые уриказы используются для получения конъюгатов с полиэтиленкликолем или полиэтиленоксидом (оба обозначены как PEG) для создания терапевтически эффективных форм уриказы, обладающих увеличенным временем полужизни белка и сниженной иммуногенностью. Патенты США 4179337, 4766106, 4847325 и 6576235; публикация патентной заявки США US2003/0082786A1 каждый включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Конъюгаты уриказы с полимерами, отличными от PEG, также описаны. Патент США 4460683 включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Практически во всех описанных попытках пегилирования уриказы (то есть ковалентного связывания PEG с уриказой), PEG присоединен, прежде всего, к аминогруппам, в том числе к аминоконцевому остатку и доступным остаткам лизина. В обычно используемых уриказах общее число лизинов в каждой из четырех идентичных субъединиц находится между 25 (Aspergillus flavus (Патент США 5382518 включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме)) и 29 (свинья (Wu, X, et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9412-9416 включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме)). Некоторые лизины недоступны для пегилирования в нативной конформации фермента. Наиболее распространенный подход к снижению иммуногенности уриказы состоит в соединении большого числа цепей низкомолекулярного PEG. Это всегда приводило к значительному снижению ферментативной активности полученных конъюгатов.

Однократное внутривенное введение препарата уриказы Candida utilis, соединенной с 5 кДа PEG, снижало содержание урата в сыворотке крови до неопределяемых уровней у пяти обследованных человек, у которых средняя концентрация урата в сыворотке до инъекции составляет 6,2 мг/дл, что находится в пределе нормы. Davis, et al., (1981). Этим пяти пациентам вводили дополнительную инъекцию четыре недели спустя, но об их реакциях на нее не сообщалось. Используя относительно нечувствительный метод диффузии в геле, не было выявлено антител к уриказе после второй (и последней) инъекции. В этом источнике не сообщается о результатах хронического и подострого лечения больных людей или экспериментальных животных.

Препарат уриказы, выделенной из Arthrobacter protoformiae, соединенной с 5 кДа PEG, применяли для временного контроля гиперурикемии у одного больного с лимфомой, у которого концентрация урата в сыворотке крови до введения препарата, составляла 15 мг/дл. Chua, et al., (1988). Вследствие критического состояния данного пациента и короткой продолжительности лечения (четыре инъекции в течение 14 дней) невозможно оценить долговременную эффективность и безопасность данного конъюгата.

Улучшенная защита от иммунологического распознавания возможна посредством модификации каждой субъединицы уриказы с помощью 2-10 цепей высокомолекулярного PEG (>5 кД-120 кД) Saifer, et al., (патент США 6576235; (1994) Adv Exp Med Biol 366: 377-387 каждая включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме). Этот подход делает возможным задержку >75% ферментативной активности уриказы, выделенной из различных биологических видов, после пегилирования, увеличивает время нахождения уриказы в кровотоке и делает возможным повторные инъекции фермента без выявления антител у мышей и кроликов.

Hershfield and Kelly (международная патентная публикация WO 00/08196; заявка США № 60/095489, включенные в настоящее описание в качестве ссылке в полном объеме) разработали средства для обеспечения рекомбинантных белков уриказы, выделенных из организмов разных видов млекопитающих, с оптимальным числом участков пегилирования. Они использовали методы ПЦР для увеличения числа доступных остатков лизина в выбранных участках фермента, что предназначено для уменьшения распознавания иммунной системой, после последующего пегилирования, существенно сохраняя уриколитическое действие фермента. Некоторые из их уриказных белков укорочены на карбокси- и/или аминоконцах. Они не обеспечивают введения других специфических генетически-опосредованных изменений в белке.

В данной заявке термин «иммуногенность» относится к индукции иммунной реакции посредством введения PEG-модифицированной ПЭГ или немодифицированной уриказы (антиген), тогда как термин «антигенность» относится к реакции антигена с предсуществующими антителами. Совместно, антигенность и иммуногенность называются «иммунореактивность». В предыдущих исследованиях PEG-уриказы иммунореактивность оценивали с помощью различных способов, в том числе: 1) реакция in vitro PEG-уриказы с предварительно сформированными антителами; 2) определение индуцированного синтеза антител; и 3) увеличенные иммунные клиренсы после повторных инъекций.

Предыдущие попытки устранения иммуногенности уриказ, выделенных из нескольких источников посредством соединения различного числа цепей PEG с помощью различных линкеров, имели ограниченный успех. Впервые PEG-уриказы были раскрыты FF Davis и Y Inada и их коллегами. Davis, et al., (1978); Патент США 4179337; Nishimura, et al., (1979); Патенты Японии 55-99189 и 62-55079, включенные в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме. Конъюгат, раскрытый в патенте США 4179337, синтезирован в результате реакции уриказы произвольного происхождения с 2000-кратным молярным избытком PEG 750 дальтон, означая, что большое число молекул полимера вероятно присоединено к каждой субъединице уриказы. В патенте США 4179337 раскрыто соединение либо PEG, либо поли(пропиленгликоля) с молекулярным весом от 500 до 20000 дальтон, предпочтительно приблизительно от 500 до 5000 дальтон, для обеспечения активных, растворимых в воде, неиммуногенных конъюгатов различных полипептидных гормонов и ферментов, в том числе оксидоредуктаз, среди которых уриказа является одним из трех примеров. Кроме того, в патенте США 4179337 подчеркивается соединение от 10 до 100 цепей полимера на молекулу фермента и задержка, по меньшей мере, 40% ферментативной активности. Не опубликовано никаких результатов относительно степени связывания PEG с доступными аминогруппами уриказы, остаточного специфического уриколитического действия или иммунореактивности конъюгата.

В предшествующих публикациях значительное снижение уриколитической активности, измеренное in vitro, было вызвано соединением различного числа цепей PEG с уриказой, выделенной из Candida utilis. Соединение большого числа цепей PEG 5 кДа с уриказой печени свиньи приводило к подобным результатам, что описано и в публикации Chen, и в докладе этой же научной группы на научной конференции. Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1978).

В семи предшествующих исследованиях сообщалось, что иммунореактивность уриказы снижена в результате пегилирования и была устранена в пяти других исследованиях. В трех из последних пяти исследований устранение иммунореактивности связано с основательным снижением уриколитической активности - самое большее до 15%, 28%, или 45% от первоначальной активности. Nishimura, et al., (1979) (15% активности); Chen, et al., (1981) (28% активности); Nishimura, et al., (1981) (45% активности). В четвертой работе сообщалось, что PEG связан с 61% доступных остатков лизина, но остаточная специфическая активность не указана. Abuchowski, et al., (1981). Тем не менее, исследовательская группа, в которую входили двое из тех же самых исследователей и которая использовала те же методы, в другом месте сообщала, что эта степень сцепления обеспечивает остаточную активность только 23-28%. Chen, et al., (1981). В публикациях 1981 Abuchowski et al., and Chen et al. указано, что для существенного уменьшения иммуногенности уриказы PEG должен быть связан приблизительно с 60% доступных остатков лизина. В пятой публикации, в которой сообщалось об устранении иммунореактивности уриказы, не раскрыта степень сцепления PEG, остаточная уриколитическая активность или природа связи PEG-белок. Veronese, FM, et al., (1997) в JM Harris, et al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Конъюгация PEG с меньшей долей остатков лизина в уриказе снижало, но не устраняло ее иммунореактивность у экспериментальных животных. Tsuji, J, et al., (1985) Int J Immunopharmacol 7: 725-730 включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме (связано 28-45% аминогрупп); Yasuda, Y, et al., (1990) Chem Pharm Bull 38: 2053-2056 включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме (связано 38% аминогрупп). Остаточные уриколитические активности соответствующих продуктов присоединения находились в пределах от <33% (Tsuji, et al.) до 60% (Yasuda, et al.) от их первоначальных значений. Tsuji, et al., синтезировали конъюгаты PEG-уриказа с 7,5 кДа и 10 кДа PEG, в дополнение к 5 кДа PEG. Все полученные конъюгаты являются до некоторой степени иммуногенными и антигенными, несмотря на то, что проявляют заметно сниженные ферментативные активности.

Сообщается, что пегилированный препарат уриказы, выделенной из Candida utilis, который безопасно вводили дважды каждому из пяти человек, сохранил только 11% от его начальной активности. Davis, et al., (1981). Несколько лет спустя, PEG-модифицированную уриказу, выделенную из Arthrobacter protoformiae, вводили четыре раза пациенту с генерализованной лимфомой и тяжелой гиперурикемией. Chua, et al., (1988). Несмотря на то, что остаточная активность этого препарата фермента не была измерена, Chua, et al., используя твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), продемонстрировали отсутствие антител против уриказы в сыворотке крови пациента через 26 дней после первой инъекции PEG-уриказы.

Предшествующие исследования пегилированной уриказы показали, что каталитическая активность заметно угнетена в результате связывания достаточного числа цепей PEG, для существенного уменьшения ее иммунореактивности. Кроме того, большинство ранних композиций PEG-уриказа синтезированы с использованием PEG, активированного хлорангидридом циануровой кислоты, производного триазина (2,4,6-трихлоро-1,3,5-триазин), который вносит новые антигенные детерминанты и индуцирует формирование антител у кроликов, Tsuji, et al., (1985).

В патенте Японии № 3-148298 A Sano, et al., включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, раскрыты модифицированные белки, в том числе уриказа, модифицированная PEG, имеющим молекулярную массу 1-12 кДа, которая проявляет уменьшенную антигенность и «улучшенное пролонгированное» действие, и способы получения таких производных пептидов. Тем не менее, нет раскрытия в отношении числа цепей, ферментативного анализа, биологических тестов или значения понятия «улучшенное пролонгирование». В патентах Японии 55-99189 и 62-55079, каждый включен в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме, оба принадлежат Y Inada, раскрыты конъюгаты уриказы, полученные с PEG-триазином или bis-PEG-триазином (обозначен как PEG₂), соответственно. См. Nishimura, et al., (1979 и 1981). В первом типе конъюгата молекулярная масса PEG составляет 2 кДа и 5 кДа, тогда как во втором использовали только 5 кДа PEG. Nishimura, et al., (1979) сообщали о восстановлении 15% уриколитической активности после модифицирования 43% доступных остатков лизина с помощью линейного 5 кДа PEG, тогда как Nishimura, et al., (1981) сообщали о восстановлении 31% или 45% уриколитической активности после модифицирования с помощью PEG₂ 46% или 36% остатков лизина, соответственно.

Ранее исследованные белки уриказы были либо природными, либо рекомбинантными белками. Однако исследования с использованием SDS-PAGE и/или вестерн-блоттинга выявили присутствие непредвиденных низкомолекулярных пептидов, которые, по-видимому, являются продуктами деградации и увеличиваются по частоте с течением времени. Настоящее изобретение относится к мутантным рекомбинантным белкам уриказы, имеющим укорочение и увеличенную структурную стабильность.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает новые рекомбинантные белки уриказы. В одном варианте осуществления белки по данному изобретению укорочены и имеют мутантные аминокислоты по сравнению с природными белками уриказы. В конкретных вариантах осуществления мутации находятся в или около областей аминокислот в положении 7, 46, 291 и 301. Консервативные мутации в любом участке пептида также рассматриваются как часть данного изобретения.

Данное изобретение обеспечивает мутантную рекомбинантную уриказу, где уриказа укорочена на 1-20 аминокислот и сохраняет уриколитическую активность природной уриказы. Укорочение проводят в или около областей окончания последовательности, таким образом, белок может содержать основные аминокислоты. Эти мутации и укорочения могут увеличивать стабильность белка, содержащего такие мутации.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает средства для метаболизирования мочевой кислоты, которые включают новый рекомбинантный белок уриказы, имеющий уриколитическую активность. Уриколитическая активность используется в настоящем описании в отношении ферментативного превращения мочевой кислоты в аллантоин.

Данное изобретение также обеспечивает клетку-хозяина, которая способна продуцировать уриказу, укороченную на 1-20 аминокислот, и имеет мутантные аминокислоты и сохраняет уриколитическую активность.

В одном варианте осуществления обеспечена изолированная укороченная уриказа млекопитающего, содержащая аминокислотную последовательность уриказы млекопитающего, укороченную на аминоконце или карбоксиконце, или и на амино- и на карбоксиконце, приблизительно на 1-13 аминокислот, и дополнительно содержащая аминокислотную замену приблизительно в положении 46. В конкретных вариантах осуществления уриказа содержит аминоконцевую аминокислоту, где данной аминоконцевой аминокислотой является аланин, глицин, пролин, серин или треонин. Также обеспечена уриказа, в которой существует замена на треонин или аланин приблизительно в положении 46. В одном варианте осуществления уриказа содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 8. В одном варианте осуществления уриказа конъюгирована с полимером с образованием, например, конъюгата полиэтиленгликоль-уриказа. В конкретных вариантах осуществления конъюгаты полиэтиленгликоль-уриказа содержат от 2 до 12 молекул полиэтиленгликоля на каждую субъединицу уриказы, предпочтительно от 3 до 10 молекул полиэтиленгликоля на субъединицу уриказы. В конкретных вариантах осуществления каждая молекула полиэтиленгликоля в конъюгате полиэтиленгликоль-уриказа имеет молекулярную массу приблизительно от 1 кД до 100 кД; приблизительно от 1 кД до 50 кД; приблизительно от 5 кД до 20 кД; или приблизительно 10 кД. Также обеспечены фармацевтические композиции, содержащие уриказу по данному изобретению, в том числе конъюгат полиэтиленгликоль-уриказа. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция пригодна для повторного введения.

Также обеспечен способ снижения уровней мочевой кислоты в биологической жидкости субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей уриказу по данному изобретению. В определенном варианте осуществления данной биологической жидкостью является кровь.

В одном варианте осуществления уриказа содержит пептид, имеющий последовательность от положения 44 до положения 56 Pig-KS-ΔN (SEQ ID № 14).

В одном варианте осуществления белок уриказы содержит на N-конце метионин. В конкретном варианте осуществления уриказа содержит аминокислотную последовательность SEQ ID № 7.

Также обеспечены изолированные нуклеиновые кислоты, в том числе последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют уриказу по данному изобретению, например уриказы, имеющие или содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID № 7, SEQ ID № 8, SEQ ID № 12 или SEQ ID № 13. В одном варианте осуществления изолированная нуклеиновая кислота функционально связана с гетерологичным промотором, например промотором osmB. Также обеспечены векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие уриказу, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота имеет последовательность SEQ ID № 7. Также обеспечен способ получения уриказы, включающий стадии культивирования такой клетки-хозяина в условиях, при которых эта уриказа экспрессируется данной клеткой-хозяином, и выделения экспрессированной уриказы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена структура плазмиды pOUR-P-ΔN-ks-1. Числа после сайтов рестрикции означают положение нуклеотида, относительно сайта HaeII, обозначенном как 1. Сайты рестрикции, которые исчезают во время клонирования, указаны в круглых скобках.

На фиг.2 представлена ДНК и экспериментально установленные аминокислотные последовательности уриказы Pig-KS-ΔN (SEQ ID № 9 и SEQ ID № 7, соответственно). Нумерация аминокислот на фиг.2 относительно полной последовательности уриказы свиньи. После инициирующего остатка метионина аспарагиновая кислота в положении 7 аминокислотной последовательности уриказы свиньи заменена на треонин. Обозначены сайты рестрикции, которые используются на различных этапах субклонирования, 3'-нетранслируемая последовательность обозначена строчными буквами. Стоп-кодон трансляции обозначен звездочкой.

На фиг.3 представлено взаимное выравнивание выведенных аминокислотных последовательностей различных последовательностей рекомбинантных уриказ свиньи (SEQ ID № 11), PBC-ΔNC (SEQ ID № 12) и Pig-KS-ΔN (SEQ ID № 7). Звездочками обозначены положения, в которых существуют отличия аминокислот в Pig-KS-ΔN по сравнению с опубликованной последовательностью уриказы свиньи; кружочками обозначены положения, в которых существуют различия аминокислот в Pig-KS-ΔN по сравнению с PBC-ΔN. Пунктирные линии обозначают делеции аминокислот.

На фиг.4 представлен SDS-PAGE уриказы свиньи и вариантов высокоочищенной уриказы, полученных в соответствии с примерами 1-3. Дата производства (месяц/год) и соответствующий номер линии для каждого образца указаны в пояснении к фигуре, ниже. Ось Y обозначает массы маркеров молекулярного веса, и верхняя часть данной фигуры обозначает номера линий. Данные линии означают следующее: Линия 1 - маркеры молекулярного веса; Линия 2 - Pig KS-ΔN (7/98); Линия 3 - Pig (9/98); Линия 4 - Pig KS (6/99); Линия 5 - Pig KS (6/99); Линия 6 - Pig-ΔN (6/99); Линия 7 - Pig KS-ΔN (7/99); Линия 8 - Pig KS-ΔN (8/99).

На фиг.5 представлены фармакокинетические профили пегилированной уриказы (9×10 кД) Pig-KS-ΔN у крыс после в/м (внутримышечной), п/к (подкожной) и в/в (внутривенной) инъекций, установленные в результате мониторинга ферментативной активности в образцах крови. Активность уриказы в образцах плазмы, которые были собраны в определенные моменты времени, определена с помощью колориметрического анализа. Значения активности (mAU = миллиединицы абсобции) означают скорость ферментативной реакции на 1 мкл образца плазмы. Биологическую доступность (количество лекарственного средства, которое попадает в системный кровоток после в/в инъекции) введенной уриказы вычисляли по площади под кривой.

На фиг.6 представлены фармакокинетические профили пегилированной (9×10 кД) уриказы Pig-KS-ΔN у кроликов после в/м (внутримышечной), п/к (подкожной) и в/в (внутривенной) инъекций, установленные в результате мониторинга ферментативной активности в образцах крови. Активность уриказы в образцах плазмы, которые были собраны в определенные моменты времени, определена с помощью колориметрического анализа. Значения активности (mAU = миллиединицы абсобции) означают скорость ферментативной реакции на 1 мкл образца плазмы. Биологическую доступность (количество лекарственного средства, которое попадает в системный кровоток после в/в инъекции) введенной уриказы вычисляли по площади под кривой.

На фиг.7 представлены фармакокинетические профили пегилированной (9×10 кД) уриказы Pig-KS-ΔN у собак после в/м (внутримышечной), п/к (подкожной) и в/в (внутривенной) инъекций, установленные в результате мониторинга ферментативной активности в образцах крови. Активность уриказы в образцах плазмы, которые были собраны в определенные моменты времени, определена с помощью колориметрического анализа. Значения активности (mAU = миллиединицы абсобции) означают скорость ферментативной реакции на 1 мкл образца плазмы. Биологическую доступность (количество лекарственного средства, которое попадает в системный кровоток после в/в инъекции) введенной уриказы вычисляли по площади под кривой.

На фиг.8 представлены фармакокинетические профили пегилированной (9×10 кД) уриказы Pig-KS-ΔN у свиней после в/м (внутримышечной), п/к (подкожной) и в/в (внутривенной) инъекций, установленные в результате мониторинга ферментативной активности в образцах крови. Активность уриказы в образцах плазмы, которые были собраны в определенные моменты времени, определена с помощью колориметрического анализа. Значения активности (mAU = миллиединицы абсобции) означают скорость ферментативной реакции на 1 мкл образца плазмы. Биологическую доступность (количество лекарственного средства, которое попадает в системный кровоток после в/в инъекции) введенной уриказы, вычисляли по площади под кривой.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предшествующие исследования показали, что если значительное снижение иммуногенности и/или антигенности уриказы достигнуто в результате пегилирования, это неизменно связано с существенной потерей уриколитической активности. Снижение их активности и, как результат, необходимость увеличения вводимой дозы неблагоприятно влияют на безопасность, удобство и рентабельность биофармацевтических препаратов. Таким образом, существует необходимость в безопасных и эффективных альтернативных средствах снижения повышенных уровней мочевой кислоты в жидкостях организма, в том числе в крови. Настоящее изобретение обеспечивает мутантную рекомбинантную уриказу, где уриказа укорочена на 1-20 аминокислот либо на аминоконце, либо на карбокси-конце, либо на обоих, и по существу сохраняет уриколитическую активность природной уриказы.

Уриказа, как используется в настоящем описании, включает отдельные субъединицы, а также тетрамер, если не указано иначе.

Мутантная уриказа, как используется в настоящем описании, относится к молекулам уриказы, имеющей аминокислоты, замененные на другие аминокислоты.

Консервативная мутация, как используется в настоящем описании, представляет собой мутацию одной или нескольких аминокислот, в положении или около положения, которое по существу не изменяет свойства белка. В предпочтительном варианте осуществления уриказа, содержащая, по меньшей мере, одну консервативную мутацию, имеет такую же уриказную активность, как уриказа, не имеющая такой мутации. В альтернативных вариантах осуществления уриказа, содержащая, по меньшей мере, одну консервативную мутацию, имеет по существу такую же уриказную активность, в пределах 5% активности, в пределах 10% активности или в пределах 30% активности уриказа без такой мутации.

Консервативная аминокислотная замена определяется как изменение аминокислотного состава посредством изменения аминокислот пептида, полипептида или белка, или его фрагмента. В конкретных вариантах осуществления в уриказе присутствуют одна, две, три или четыре консервативные мутации. Данной заменой являются аминокислоты, имеющие, как правило, аналогичные свойства (например, кислотность, основность, ароматичность, размер, положительный или отрицательный заряд, полярность, неполярность), таким образом, что данные замены по существу не изменяют свойства пептида, полипептида или белка (например, заряд, изоэлектрическое фокусирование, аффинность, авидность, конформация, растворимость) или активность. Типичные замены, которые могут быть осуществлены для такой консервативной аминокислотной замены, могут входить в следующие группы аминокислот:

глицин (G), аланин (A), валин (V), лейцин (L) и изолейцин (I)

аспарагиновая кислота (D) и глутаминовая кислота (E)

аланин (A), серин (S) и треонин (T)

гистидин (H), лизин (K) и аргинин (R)

аспарагин (N) и глутамин (Q)

фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W)

Белок, несущий одну или несколько консервативных замен, сохраняет свою структурную стабильность и может катализировать реакцию, даже если последовательность его ДНК отличается от последовательности исходного белка.

Укороченная уриказа, как используется в настоящем описании, относится к молекулам уриказы, имеющим укороченные первичные амикнокислотные последовательности. Среди возможных укорочений имеют место укорочения на или около амино- и/или карбоксиконца. Специфические укорочения такого типа могут быть такими, что крайние аминокислоты (те, которые находятся на амино- и/или карбоксиконце) природного белка присутствуют в укороченном белке. Укорочение аминоконца может начинаться с положения 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Предпочтительно, укорочения аминоконца начинаются с положения 2, оставляя аминоконцевой метионин. Этот метионин может быть удален в результате посттрансляционной модификации. В конкретных вариантах осуществления аминоконцевой метионин удален после продуцирования уриказы. В определенном варианте осуществления данный метионин удален с помощью эндогенной бактериальной аминопептидазы.

Укороченная уриказа, по отношению к последовательности полной длины, имеет одну или несколько исключенных аминокислотных последовательностей. Белок, содержащий укороченную уриказу, может включать любую аминокислотную последовательность в дополнение к последовательности укороченной уриказы, за исключением белка, включающего последовательность уриказы, содержащей любую непрерывную аминокислотную последовательность дикого типа. Другими словами, белок, содержащий укороченную уриказу, где данное укорочение начинается в положении 6 (то есть укороченная уриказа начинается с положения 7), не имеет, сразу же в 3'-5' направлении от укороченной уриказы, какую либо аминокислоту, которая в уриказе дикого типа находится в положении 6.

Если не обозначено иначе посредством специфической ссылки на другую последовательность или конкретную последовательность SEQ ID №, ссылка на пронумерованные положения аминокислот уриказы, описанной в настоящем описании, сделана относительно нумерации аминокислот в последовательности уриказы свиньи. Аминокислотная последовательность уриказы свиньи и пронумерованные положения аминокислот, имеющие эту последовательность, представлены на фиг.3. Используемая в настоящем описании ссылка на аминокислоты или нуклеиновые кислоты «от положения Х до положения Y» означает непрерывную последовательность, начинающуюся в положении Х и заканчивающуюся в положении Y, включая аминокислоты или нуклеиновые кислоты в обоих положениях Х и Y.

Гены уриказы и белки были определены для нескольких видов млекопитающих, например, свиньи, бабуина, крысы, кролика, мыши и макак-резус. Последовательности различных белков уриказы описаны в настоящем описании посредством ссылки на их инвентарные номера в доступных для общего пользования базах данных, как указано далее: gi|50403728|sp|P25689; gi|20513634|dbj|BAB91555.1; gi|176610|gb|AAA35395.1; gi|20513654|dbj|BAB91557.1; gi|47523606|ref|NP_999435.1; gi|6678509|ref|NP_033500.1; gi|57463|emb|CAA31490.1; gi|20127395|ref|NP_446220.1; gi|137107|sp|P11645; gi|51458661|ref|XP_497688.1; gi|207619|gb|AAA42318.1; gi|26340770|dbj|BAC34047.1 и gi|57459|emb|CAA30378.1. Каждая из этих последовательностей и примечаний к ним в доступных для общего пользования базах данных, открытых для доступа через National Center for Biotechnology Information (NCBI), включена посредством ссылки в полном объеме.

В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа укорочена на 4-13 аминокислот на ее аминоконце. В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа укорочена на 4-13 аминокислот на ее карбоксиконце. В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа укорочена на 4-13 аминокислот и на карбокси-, и на аминоконце.

В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа укорочена на 6 аминокислот на ее аминоконце. В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа укорочена на 6 аминокислот на ее карбоксиконце. В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа укорочена на 6 аминокислот и на карбокси-, и на аминоконце.

В определенном варианте осуществления белок уриказы содержит аминокислотную последовательность от положения 13 до положения 292 аминокислотной последовательности уриказы свиньи (SEQ ID № 11). В определенном варианте осуществления белок уриказы содержит аминокислотную последовательность от положения 8 до положения 287 аминокислотной последовательности PBC-ΔNC (SEQ ID № 12). В определенном варианте осуществления белок уриказы содержит аминокислотную последовательность от положения 8 до положения 287 аминокислотной последовательности Pig-KS-ΔN (SEQ ID № 7).

В другом варианте осуществления белок уриказы содержит аминокислотную последовательность от положения 44 до положения 56 аминокислотной последовательности Pig-KS-ΔN (SEQ ID № 14). Эта область уриказы обладает гомологией с последовательностями в пределах домена тоннельной укладки («T-fold») уриказы и имеет в его пределах мутацию в положении 46 по отношению к последовательности природной уриказы свиньи. Удивительно, что данная мутация существенно не изменяет уриказную активность данного белка.

В одном варианте данного изобретения аминокислоты в положении или вблизи положения любой из аминокислот 7, 46 и 291, и 301 являются мутантными. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения мутированы непосредственно аминокислоты 7, 46 и 291, и 301.

В определенных вариантах осуществления белок кодируется нуклеиновой кислотой, которая кодирует N-концевой метионин. Предпочтительно, за N-концевым метионином следует кодон, который делает возможным удаление этого N-концевого метионина посредством бактериальной метионин-аминопептидазы (MAP). (Ben-Bassat and Bauer (1987) Nature 326:315 включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме). Аминокислотами, которые делают возможным наиболее полное удаление N-концевого метионина, являются аланин, глицин, пролин, серин и треонин.

В одном варианте осуществления данного изобретения аминокислоты в положении или вблизи положения 7 и/или 46 замещены треонином. Удивительно, что ферментативная активность укороченных уриказ, имеющих эти мутации, аналогична ферментативной активности неукороченного фермента. В еще одном варианте осуществления данного изобретения мутации аминокислот включают треонин, треонин, лизин и серин в положениях 7, 46, 291 и 301, соответственно.

Укороченные уриказы млекопитающих, раскрытые в настоящем описании, могут дополнительно содержать метионин на аминоконце. Предпоследняя аминокислота может быть одной из тех, которые делают возможным удаление N-концевого метионина посредством бактериальной метионин-аминопептидазы (MAP). Аминокислотами, которые делают возможным наиболее полное удаление N-концевого метионина, являются аланин, глицин, пролин, серин и треонин. В определенном варианте осуществления уриказа содержит две аминоконцевых аминокислоты, где эти две аминокислоты являются метионином, за которым следует аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аланина, глицина, пролина, серина и треонина.

В другом варианте осуществления данного изобретения замещенные аминокислоты заменены на треонин.

В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа является уриказой млекопитающего.

В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа млекопитающего содержит последовательность уриказы печени свиньи, быка, овцы и бабуина.

В одном варианте осуществления данного изобретения уриказа является химерной уриказой двух или нескольких млекопитающих.

В одном варианте осуществления данного изобретения д