Способ прогнозирования развития острого эндометрита после медицинского аборта

Способ прогнозирования развития острого эндометрита после медицинского аборта

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования развития острого эндометрита после медицинского аборта.

Проблема гнойно-септических осложнений после абортов продолжает оставаться одной из ведущих в акушерской и гинекологической практике Российской Федерации (РФ).

Медицинский аборт является самой распространенной гинекологической операцией, на долю которой приходится до 30% от всех проведенных оперативных вмешательств в гинекологических стационарах РФ [4]. При этом частота острого эндометрита после медицинского аборта колеблется от 1,7 до 19,1% случаев. Воспалительные заболевания после аборта, перешедшие в хроническую форму, составляют от 14,6 до 19,2% и часто являются причиной нарушения репродуктивной функции у молодых женщин [2, 6].

Из литературных источников известно, что для диагностики и оценки степени тяжести патологических состояний, а также для контроля эффективности лечения и прогноза тяжести заболеваний могут быть использованы показатели активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов крови [3].

Известен способ диагностики послеродового эндометрита по повышению уровня в крови родильницы щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, α-гидроксибутиратдегидрогеназы, α-антитропсина, серомукоида [10]. Известный способ достаточно информативен, но разработан только для диагностики послеродового эндометрита и не предназначен для прогноза развития острого послеабортного эндометрита.

Известно, что изменение уровней активности некоторых внутриклеточных ферментов лимфоцитов крови может свидетельствовать о риске развития острого эндометрита [7]. В статье анализируются уровни ферментативной активности в крови беременных, делаются заключения о связи их с риском развития острого эндометрита, но не предложен алгоритм прогнозирования развития острого послеабортного эндометрита.

Задачей изобретения является создание информативного способа прогнозирования развития острого эндометрита после медицинского аборта.

Задача достигается тем, что в лимфоцитах крови беременных женщин до проведения медицинского аборта определяют активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимых реакций глутаматдегидрогеназы (соответственно, НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ) и глутатионредуктазы (ГР). Затем рассчитывают коэффициент восстановления никотинамиддинуклеотидфосфата (КВ_НАДФ), представляющий собой отношение произведения активностей Г6ФДГ, НАДФМДГ и НАДФГДГ к произведению активностей ГР и НАДФН-ГДГ, то есть

КВ_НАДФ=(Г6ФДГ·НАДФМДГ·НАДФГДГ)/(ГР·НАДФН-ГДГ).

При значении КВ_НАДФ, равном или более 0,09, прогнозируют развитие острого эндометрита после медицинского аборта. При значении КВ_НАДФ менее 0,09 прогнозируют отсутствие развития острого эндометрита после медицинского аборта.

Значение 0,09 получено опытным путем на основании сопоставления значений рассчитываемого КВ_НАДФ и данных последующего наблюдения за клиническим состоянием женщин после медицинского аборта. Значение КВ_НАДФ выше 0,09 свидетельствует о повышении степени восстановленности данного кофермента и, соответственно, о снижении интенсивности метаболических процессов в клетках с участием восстановленного никотинамиддинуклеотидфосфата (НАДФН).

Известно, что лимфоциты, реализующие основные функции клеточного звена иммунной системы, являются главными клетками в системе иммунологического надзора и принимают активное участие как в системе противоинфекционной защиты, так и в инициации и поддержке регенеративных процессов за счет синтеза широкого спектра цитокинов [11, 13]. В то же время установлено, что функциональная активность лимфоцитов в значительной степени определяется уровнем их метаболических процессов [5]. При этом широкий спектр синтетических реакций в клетке протекает с участием НАДФН. К числу показателей, наиболее объективно отражающих основные параметры внутриклеточного метаболизма, можно отнести дегидрогеназы.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата и кофермента НАДФ. Образовавшийся в ходе данной реакции 6-фосфоглюконо-5-лактон является нестабильным и гидролизуется либо спонтанно, либо с помощью фермента 6-фосфоглюконолактоназы с образованием 6-фосфоглюконата [1]. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла, который является конкурентом гликолиза за субстрат (глюкоза-6-фосфат). В норме доля пентозофосфатного цикла в количественном превращении глюкозы обычно невелика и варьирует в зависимости от функционального состояния клеток.

Малик-фермент (НАДФ-зависимая декарбоксилирующая малатдегидрогеназа: НАДФМДГ, КФ 1.1.1.40) осуществляет шунтирование медленных реакций цикла трикарбоновых кислот [1]. При этом фермент является ключевым в системе липидного анаболизма, так как синтезированный НАДФН используется для обеспечения широкого спектра реакций в синтезе внутриклеточных липидов.

Глутатионредуктаза (ГР, КФ 1.6.4.2) катализирует восстановление окисленного глутатиона (дисульфидной формы) за счет НАДФН. Фермент локализуется в цитоплазматическом компартменте. Считается, что одной из главных функций глутатиона является сохранение ферментов, в активном центре которых имеются SH-группы, в активной восстановленной форме. Обсуждается коферментная функция глутатиона и его роль в транспорте аминокислот через мембрану [1].

НАДФ-зависимая глутаматдегидрогеназа (НАДФГДГ, КФ 1.4.1.4) осуществляет окислительное дезаминирование L-глутаминовой кислоты, используя в качестве кофактора НАДФ⁺. Ферментативная реакция глутаматдегидрогеназы является обратимой, соответственно аммиак в присутствии НАДФН и α-кетоглутаровой кислоты может участвовать в синтезе глутамата. Глутаматдегидрогеназа является олигомерным ферментом с молекулярной массой 312000, который состоит из 6 субъединиц. Фермент проявляет свою активность только в мультимерной форме. При диссоциации глутаматдегидрогеназы на субъединицы, которая происходит в присутствии НАДФН, гуанозинтрифосфата и ряда стероидных гормонов, фермент теряет способность осуществлять окислительное дезаминирование глутаминовой кислоты, но приобретает способность осуществлять дезаминирование ряда других аминокислот. Подобная особенность характеризует аллостерический механизм регуляции глутаматдегидрогеназы и определяет данный фермент как регуляторный в системе аминокислотного обмена.

Способ выполняется следующим образом.

У беременных женщин перед проведением медицинского аборта забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты. Центрифугируют на градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике A. Boyum (1968) [12]. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода лимфоцитов, которая составляет не менее 97%. 1 млн выделенных клеток используют для определения активностей Г6ФДГ, НАДФМДГ, НАДФГДГ, ГР и НАДФН-ГДГ в лимфоцитах одним из известных способов, например биолюминесцентным [8, 9]. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также pH среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Фермент	Субстрат, мМ	Кофактор, мМ	РН буфера
Г6ФДГ	Глюкоза-6-фосфат - 1,5	НАДФ - 0,025	9,8
НАДФМДГ	Малат - 7,5	НАДФ - 0,375	9,8
НАДФГДГ	Глутамат - 0,5	НАДФ - 1,65	9,8
ГР	GSH - 0,5	НАДФН - 0,0025	7,4
НАДФН-ГДГ	Оксоглутарат - 100	НАДФН - 0,0025	7,4
Примечание: среду с pH 9,8 готовят на Трис-HCl буфере (ICN Biomedicals Inc., США); с pH 7,4 - на K+-, Na+-фосфатном буфере (буфер готовят из K2HPO4 и NaH2PO4 (Реахим, Россия)).

После инкубации исследуемых проб при 37°C в течение 30 минут для Г6ФДГ, НАДФМДГ и НАДФГДГ или 5 минут для ГР и НАДФН-ГДГ к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10^-5М, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН:ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 М K⁺-, Na⁺-фосфатном буфере с pH 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например, марки "БЛМ-8806М-01" измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производят в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности ферментов строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН или НАДН в диапазоне 10^-9-10^-4 М вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН:ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном pH буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также pH зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят на основе соответствующего буфера. Активность ферментов рассчитывают по формуле: A=Δ[C]×V/T,

где A - активность дегидрогеназы, E на 1×10⁴ лимфоцитов (1E=1 мкмоль/мин [1]);

Δ[C] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;

V - объем пробы, мл;

T - время инкубации, мин.

Затем рассчитывают КВ_НАДФ по формуле:

КВ_НАДФ=(Г6ФДГ·НАДФМДГ·НАДФГДГ)/(ГР·НАДФН-ГДГ).

При значении КВ_НАДФ, равном или выше 0,09, прогнозируют развитие острого эндометрита после медицинского аборта. При значении КВ_НАДФ ниже 0,09 прогнозируют отсутствие развития острого эндометрита после медицинского аборта.

Данный способ апробирован на 148 беременных женщинах, обследованных на базе женской консультации №4 МУЗ «Родильный дом №5» г. Красноярска, из них 63 находились на лечении с острым послеабортным эндометритом в гинекологическом отделении ГБ №4 (г. Красноярск). Результаты обследования представлены в табл.2.

Таблица 2
Особенности распределения КВНАДФ у беременных женщин до медицинского аборта
КВНАДФ	Женщины, у которых после медицинского аборта не развился острый эндометрит, n=85	Женщины, у которых после медицинского аборта развился острый эндометрит, n=63
Медиана	0,03	0,95
Минимальное значение	0,01	0,09
Максимальное значение	0,08	1,30

Активность Г6ФДГ, НАДФМДГ, НАДФГДГ, ГР и НАДФН-ГДГ в лимфоцитах определяли с помощью биолюминесцентного метода. По результатам обследования установлено, что после медицинского аборта у 85 женщин острый эндометрит не развился. У этих женщин величина КВ_НАДФ составила 0,01-0,08. У 63 женщин после медицинского аборта развился острый эндометрит. У этих женщин величина КВ_НАДФ составила 0,09-1,30. У трех женщин прогноз не совпал. КВ_НАДФ у них был выше 0,09, но острый эндометрит после медицинского аборта у них не развился. Таким образом, отмечено совпадение прогноза в 98,0%.

Пример 1. Беременная Г., 19 лет. Обратилась в женскую консультацию при сроке беременности 8-9 недель с желанием прервать данную беременность. Проведено исследование заявляемым способом. Величина КВ_НАДФ, определенная до аборта, составила 1,02. Согласно изобретению, прогноз - развитие острого эндометрита после аборта. После обследования и санации пациентка направлена на медицинский аборт в гинекологическое отделение ГБ №4. На 3-и сутки после произведенного медицинского аборта поднялась температура до 38°C, отмечались боли внизу живота, сукровично-гноевидные выделения из влагалища, болезненность матки при вагинальном осмотре. В анализе крови - лейкоцитоз 10×10⁹/л, сдвиг формулы влево, СОЭ 17 мм/ч. По данным УЗИ - увеличение размеров матки, расширение ее полости до 8 мм с гипоэхогенным содержимым. Находилась на стационарном лечении с 17.03.08 по 26.03.08 (история болезни №1024/118) с диагнозом «Острый послеабортный эндометрит».

Заключение: прогнозирование по заявляемому способу развития острого эндометрита после медицинского аборта подтвердилось.

Пример 2. Беременная К., 24 г. Обратилась в женскую консультацию при сроке беременности 7-8 недель с желанием прервать данную беременность. Проведено исследование заявляемым способом. Величина КВ_НАДФ определенная до аборта, составила 0,03. Согласно изобретению, прогноз - отсутствие развития острого эндометрита после аборта. После обследования и санации пациентка направлена на медицинский аборт в гинекологическое отделение ГБ №4. Послеоперационный период протекал без осложнений.

Заключение: прогнозирование по заявляемому способу отсутствия развития острого эндометрита после медицинского аборта подтвердилось.

Технический результат от реализации предлагаемого способа:

- возможность прогнозирования развития острого эндометрита у беременных женщин до проведения медицинского аборта;

- инвазивное вмешательство ограничено однократным забором из вены малого объема крови (2 мл);

- возможность своевременной профилактики послеабортных эндометритов.

Таким образом, способ информативен, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики, позволяет своевременно определить риск развития острого эндометрита до проведения медицинского аборта.

Источники информации

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.

2. Егорова А.Т., Базина М.И., Бойчук Н.В. и др. Хронический эндометрит как причина невынашивания беременности // Материалы 7 Российского форума «Мать и дитя». - М., 2005. - С.69-70.

3. Козлов В.А., Борисов А.Г., Смирнова СВ., Савченко А.А. Практические аспекты диагностики и лечения иммунных нарушений: руководство для врачей.- Новосибирск: Наука, 2009. - 274 с.

4. Кулаков В.И. Некоторые показатели деятельности акушерско-гинекологической службы Российской Федерации в разрезе федеральных округов (статистические материалы). - М.: Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, МЗ РФ, 2004. - 34 с.

5. Куртасова Л.М., Хват Н.С., Савченко А.А. Особенности энзиматического статуса и функциональной активности иммунокомпетентных клеток периферической крови у больных раком почки // Вестник РАМН. - 2010. - №5. - С.29-33.

6. Никифировский Н.Н., Покусаева В.Н., Петрова В.Н. Перинатальные аспекты искусственного аборта // Вестник Российской ассоциации акушеров-гинекологов. - 2000. - №1. - С.25-28.

7. Россиева Т.Л., Цхай В.Б., Савченко А.А. Клинико-метаболические факторы риска развития острого послеабортного эндометрита // Сибирское медицинское обозрение. - 2008. - №2. - С.48-50.

8. Савченко А.А. Биолюминесцентное определение активности НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ лимфоцитов // Лабораторное дело. - 1991. - №11. - С.22-25.

9. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом // Лабораторное дело. - 1989. - №11. - С.23-25.

10. Способ диагностики послеродового эндометрита. SU 1805397 А1, опубл. 30.03.1993.

11. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. - М.: Медицина, 2000. - 432 с.

12. Boyum A. Isolation of lymphocytes from blood and bone marrow // Scand.J.Clin.Lab. Invest. - 1968. - Vol.21 (Suppl.97). - P.77-80.

13. Christophi C., Harun N., Fifis T. Liver regeneration and tumor stimulation - a review of cytokine and angiogenic factors // J. Gastrointest. Surg. - 2008. - Vol.12, №5. - P.966-980.

Способ прогнозирования развития острого эндометрита после медицинского аборта путем исследования до проведения аборта ферментов лимфоцитов периферической крови беременных - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), НАДФ-зависимой реакции глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ) и малик-фермента (НАДФМДГ), отличающийся тем, что дополнительно определяют активности ферментов: НАДФН-зависимой реакции глутаматдегидрогеназы (НАДФНГДГ) и глутатионредуктазы (ГР), после чего рассчитывают коэффициент восстановления НАДФ⁺ (КВ_НАДФ), представляющий собой отношение произведения активностей Г6ФДГ, НАДФМДГ и НАДФГДГ к произведению активностей ГР и НАДФН-ГДГ, то есть: КВ_НАДФ=(Г6ФДГ·НАДФМДГ·НАДФГДГ)/(ГР·НАДФН-ГДГ), и при значении КВ_НАДФ, равном или более 0,09, прогнозируют развитие острого эндометрита, а при значении КВ_НАДФ ниже 0,09 прогнозируют отсутствие развития острого эндометрита после медицинского аборта.