Способ модифицирования углеродного гемосорбента и углеродный гемосорбент с иммобилизованным белком

Способ модифицирования углеродного гемосорбента и углеродный гемосорбент с иммобилизованным белком

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к технологии получения сорбентов с иммобилизованным белком, позволяющих селективно сорбировать вещества пептидной природы, в том числе белки, которые появляются и накапливаются в организме при определенных заболеваниях. Предназначено для применения в сорбционной терапии, протеомике, медицинской диагностике, биотехнологии.

В настоящее время уделяется большое внимание созданию гемосорбентов, избирательно поглощающих из крови токсические вещества белкового происхождения, накапливающиеся в организме при развитии патологических процессов (онкологических, аутоиммунных и т.д.). Создание сорбентов с повышенной адсорбционной активностью по отношению к веществам белковой природы путем регулирования химической природы их поверхности (химическое модифицирование) позволяет создать широкий спектр эффективных сорбентов, специфически связывающих пептиды и белки. В качестве матрицы для производства специфических сорбентов все большее применение находят углеродные сорбенты. Данный выбор обусловлен рядом их уникальных свойств, прежде всего хорошей совместимостью с биологическими жидкостями и инертностью к тканям внутренних органов, а также высокой прочностью их гранул.

Известны способы получения биосовместимых и селективных гемосорбентов введением разнополярных групп, капсулированием и нанесением полимерного слоя на поверхность сорбента (В.В.Стрелко, С.В.Михайловский, Н.В.Сухаренко, Н.Т.Картель и др. О возможности создания биоспецифических материалов на основе биосовместимых углеродных матриц. // Доклады АН СССР. Т.274. №5. С.1236-1239; Горчаков В.Д., Сергиенко В.И. Селективные гемосорбенты. - М.: Медицина, 1989. С.139-147; Бакалинская О.Н., Сухаренко Н.В., Стрелко В.В Сорбционные свойства углеродных гемосорбентов с иммобилизованными белками. // Украинский химический журнал, 1989, №12. С.1273-1276; Лисичкин Г.В. Химия привитых поверхностных соединений. - М.: Физматлит, 2003, 592 с; патент РФ №2064429).

Известен способ модифицирования углеродных сорбентов за счет покрытия его поверхности пленкой альбумина (Albumin Coated Activated Charcoal, АСАС-угли) (Terman D.S. Extracorporeal immunoadsorbens for extraction of circulating immune reactants // Sorbents and their clinical applications / Ed. C.Giordano. - N.-Y. - London Academic Press. 1980. - P.469-491).

Данные способы модифицирования направлены на улучшение качества углеродных адсорбентов: повышение прочности гранул и снижение «пылевыделения» в раствор адсорбата, выравнивание рельефа поверхности модифицирующей пленкой, повышение совместимости с биологической жидкостью. Однако основным недостатком данных способов модифицирования является практически полное закрытие пор в сорбентах пленкой полимерного модификатора, приводящее к ухудшению динамики процесса сорбции биологических жидкостей.

Известен способ получения гемосорбента, включающий модифицирование активированного угля путем его обработки метилтолуолсульфонат-N-циклогексил-N-1-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимидом в присутствии меланина при их массовом соотношении (2,3-2,6):1 соответственно и инкубацию модифицированного угля в присутствии глутатиона (патент РФ №2316392). Недостатком получаемого гемосорбента является его низкая прочность и поверхностная неоднородность.

Все вышеописанные сорбенты обладают неспецифичностью и низкой адсорбционной способностью к веществам белковой природы. Для того чтобы обеспечить биоспецифическое взаимодействие биологических молекул и увеличить емкость аффинного сорбента, необходимо перевести имеющиеся на полимерной пленке функциональные группы в реакционноспособные и иммобилизовать на активированной поверхности биолиганд, способный к эффективному связыванию определенных токсичных веществ белковой природы. Необходимым условием является ковалентное его присоединение к модифицированной поверхности сорбента.

Известен способ получения биоспецифического углеродного сорбента, в котором в качестве исходного углеродного сорбента используется гемосорбент марки «СУМС-1». Иммобилизацию биолигандов (противоэнцефалитного гамма-глобулина, белка А, нейтральной протеазы Протосубтилина П10Х) осуществляли простой циркуляцией изотоничсекого раствора белка через слой гемосорбента в динамических условиях (Коваленко Г.А. Методы получения биоспецифических гемосорбентов. // Химико-фармацевтический журнал, 1998, №3. С.36-40). Недостатками полученных при таком способе иммобилизации сорбентов является низкая концентрация биолиганда на поверхности сорбента; уменьшение ферментативной активности используемых белков после иммобилизации; использование полученных сорбентов при заболеваниях, сопровождающихся накоплением только определенных соединений белковой природы с известным строением и высокой молекулярной массой.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ обработки углеродного мезопористого гемосорбента, включающий обработку пористого углеродного материала воздухом при контактировании с воздушно-водяной смесью в кипящем слое и обработку гемосорбента в стационарном слое 4-6% раствором азотной кислоты, подаваемым в зону реакции порциями через определеннее интервалы времени, с последующей подачей воздуха с объемной скоростью 8 м³/ч для перемешивания сорбента. Обработку кислотой проводят в течение 7 часов, соотношение кислоты и сорбента составляет 1:(29-32). Полученный сорбент сушат при температуре 200°С до остаточной влажности 0,2% (патент РФ №2362733, прототип).

Наиболее близким к предлагаемому гемосорбенту является углеродный мезопористый гемосорбент ВНИИТУ-1, который состоит из гранул размером 0,5-1,0 мм, характеризуется высокой химической чистотой (содержание углерода не менее 99,5%), удельной адсорбционной поверхностью 300-400 м³/г, присутствием на поверхности кислородсодержащих функциональных групп в количестве 0,060-0,070 мэкв/г, из них содержание карбоксильных групп 0,051-0,058 мэкв/г, фенольных 0,009-0,022 мэкв/г (Суровикин В.Ф., Пьянова Л.Г., Лузянина Л.С. Новые гемо- и энтеросорбенты на основе нанодисперсных углерод-углеродных материалов // Российский химический журнал. 2007 - Т.LI. - №5. С.159-165).

К недостатку углеродного гемосорбента можно отнести невысокую адсорбционную емкость по отношению к токсичным соединениям белковой природы, накапливающимся в организме при определенных заболеваниях.

Целью изобретения является получение углеродного гемосорбента с высокой адсорбционной активностью, настроенного на извлечение патологических веществ белковой природы.

Предлагаемый способ модифицирования углеродного гемосорбента включает обработку водным раствором оксикислоты с концентрацией 5-20% при соотношении гемосорбент : раствор оксикислоты 1:10-1:20 при температуре 25°С в течение 2-4 ч с последующим декантированием и выдержкой пропитанного гемосорбента в инертной среде в течение 0,25-6 ч при температуре 120-350°С, кипячением в дистиллированной воде в течение 1-2 ч, сушкой и последующей пропиткой 1М растворами N,N'-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в органическом растворителе (диметиламид) при перемешивании реакционной смеси в течение 0,5-3 ч с последующем добавлением приготовленного в буферном растворе с рН 7,3-7,5 сывороточного альбумина с концентрацией 0,5-2,0 мг/мл при перемешивании в течение 16-24 ч, отмывку 0,9% раствором хлорида натрия.

Предлагаемый углеродный гемосорбент с иммобилизованным белком в виде гранул округлой формы размером 0,5-1,0 мм, с гладким рельефом поверхности, характеризуется содержанием на поверхности белка, удельной адсорбционной поверхностью 250-280 м²/г, общим объемом пор 0,40-0,50 см³/г, преимущественно мезопор 0,35-0,48 см³/г, концентрацией кислородсодержащих групп на поверхности гранул 0,20-0,40 мэкв/г и содержанием общего азота 3-5%.

Отличительными признаками данного изобретения являются:

- модифицирование поверхности углеродного гемосорбента нетоксичной оксикислотой, содержащей в своем составе не менее двух функциональных групп: карбоксильную -СООН и гидроксильную -ОН;

- активация модифицированного гемосорбента путем обработки растворами N,N'-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в органическом растворителе (диметиламид кислот);

- иммобилизация сывороточного альбумина на поверхности гемосорбента.

Повышение адсорбционной емкости достигается за счет нанесения на гидрофобную пористую поверхность углеродного сорбента нетоксичной органической оксикислоты, содержащей в своем составе не менее двух функциональных групп (карбоксильная -СООН и гидроксильная -ОН). Бифункциональность модифицирующего соединения создает условия для протекания реакции гомополиконденсации с образованием олигомерных или полимерных молекул, обладающих низкой растворимостью в воде. Протекающие межмакромолекулярные реакции на твердой поверхности сорбента при полимеризации позволяют изменять состояние модифицирующего соединения при полимеризации (олиго- и полимеров), переводя их из состояния изолированных макромолекул в состояние единой пространственной сетчатой структуры с принципиально новыми свойствами: происходит резкое снижение необратимых деформаций, потери текучести, растворимости, улучшение прочностных свойств. Данное обстоятельство обеспечивает постоянство химического состава образованного полимера на поверхности модифицированного сорбента в процессе работы при контактах с биологическими жидкостями. Наличие карбоксильной группы в данном случае выступает как собственный кислотный катализатор, обеспечивая процесс самокатализируемой поликонденсации.

Присутствие закрепленных на углеродной поверхности концевых функциональных групп молекулы оксикислот -СООН повышает гидрофильность поверхности гемосорбента и соответственно увеличивает сорбционную активность к белковым соединениям.

Активация карбоксильных групп (придание повышенной реакционоспособности) на концах образованных полимерных цепей на поверхности углеродного сорбента позволяет увеличить количество активных центров, ковалентно связанных с иммобилизованным белком - биолигандом. Используемый в качестве биолиганда белок сывороточный альбумин обеспечивает селективные (аффинные) свойства получаемого сорбента по отношению к соединениям белковой природы. Уникальность выбранного биолиганда обусловлена его физико-химическими и физиологическими свойствами, наличием в его структуре большого количества реакционоспособных центров, способных связываться с токсинами белковой природы и инактивировать их (детоксикационные свойства).

Модифицирование углеродной поверхности приводит к изменениям параметров пористой текстуры углеродного гемосорбента: полностью закрываются микропоры, снижается объем макропор. В целом пористая структура модифицированных образцов гемосорбента характеризуется меньшими значениями величины удельной адсорбционной поверхности S_БЭТ и более высокими значениями среднего диаметра пор.

Проведение модифицирования полимерами оксикислот и последующая активация поверхностных карбоксильных групп углеродного гемосорбента приводит к значительному увеличению кислородсодержащих групп, образующих активные адсорбционные центры, способные адсорбировать белковые соединения за счет их специфического взаимодействия с функциональными поверхностными группами модифицированного сорбента. Количество кислородсодержащих групп на поверхности модифицированных углеродных сорбентов после их активации возрастает в 4 раза: содержание общих кислых групп для модифицированных сорбентов после активации на поверхности увеличивается от 0,060-0,070 до 0,20-0,40 мэкв/г.

Увеличение концентрации кислородсодержащих групп, в том числе карбоксильных групп, на поверхности гемосорбента вносит определенный вклад в адсорбцию белковых веществ. После проведения активации карбоксильных групп на поверхности углеродного сорбента с прочно закрепленной полимерной пленкой ковалентно присоединяется белок-лиганд.

Определение физико-химических характеристик образцов исходного и модифицированного углеродного гемосорбента проводилось стандартными методами, применяемыми при исследовании пористых материалов: количественное содержание кислородсодержащих групп - химическим методом (метод Boehm Н.Р.) по взаимодействию с химическими реагентами различной природы и потенциометрическим титрованием. Основные текстурные характеристики - удельную адсорбционную поверхность, суммарный объем пор и распределение пор по размерам - определяли по изотермам адсорбции-десорбции азота, полученным на приборе «Sorptomatic-1900» фирмы «Carlo Erba». Расчет величины адсорбционной удельной поверхности проводили по уравнению БЭТ. Рельеф и морфологию поверхности исследуемых образцов углеродного сорбента изучали методом растровой электронной микроскопии с использованием электронного микроскопа «JSM-6460 LV» («JEOL», Япония). Снимки просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (ПЭМВР) получали на электронном микроскопе «JEM-2010» («JEOL», Япония) с разрешением по решетке 0.14 нм при ускоряющем напряжении 200 кВ. Рентгеновский микроанализ поверхности исследуемых образцов проводили на энергодисперсионном спектрометре EDAX («EDAX», Япония), оснащенном Si (Li) детектором с энергетическим разрешением 130 эВ. Исследование поверхности образцов углерод-углеродного сорбента проводили методом атомно-силовой микроскопии на микроскопе «Solver Р47» («NT-MDT», Россия) в полуконтактном режиме.

Влияние модифицирования поверхности углеродного гемосорбента на адсорбционные свойства по отношению к малым М-белкам (белковая фракция «Глобулин γ-1») исследовано в Центральной научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии на плазме крови больных микс-гепатитами (стендовые испытания). Определение сорбции малых М-белков проводили методом капиллярного белкового электрофореза.

На фиг.1 приведены электронно-микроскопические (ПЭМВР) снимки образца, модифицированного полимером молочной кислоты, с активированными карбоксильными группами и иммобилизованным сывороточным альбумином (частицы с размерами ~10 нм), закрепленные на поверхности глобул сорбента.

На фиг.2 приведен спектр рентгеновского энергодисперсионного микроанализа поверхности образца модифицированного гемосорбента с иммобилизированным на его поверхности сывороточным альбумином. Анализ полученных спектров показал наличие спектральной линии азота, входящего в структуру молекулы белка сывороточного альбумина (модификатор - молочная кислота не имеет элемента азота в своей структуре).

Для исследования структуры поверхности и определения сил межмолекулярного взаимодействия был использован метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). На фиг.3 - трехмерное представление образцов углеродного гемосорбента. Методом АСМ было показано, что поверхность гранул исходного сорбента имеет сложную организацию (фиг.3а). Установлено, что модифицирование сорбента молочной кислотой и его активация не оказывают влияния на топографические характеристики поверхности гранул в пределах разрешения использованного метода (≈20 нм) (фиг.3б). Изучение поверхности образца, модифицированного молочной кислотой после активации, через который пропущена плазма крови здорового человека, выявило сглаживание рельефа - заполнение каньонов и ямок, и уменьшение высоты шиловидных образований (фиг.3в). Наиболее ярко сглаживание рельефа наблюдается на образце углеродного гемосорбента, модифицированного молочной кислотой, активированного, с иммобилизованным альбумином, через который пропущена плазма крови здорового человека (фиг.3г).

На фиг.4 приведены ИК-спектры углеродных гемосорбентов: по прототипу (1), модифицированного молочной кислотой (2) и модифицированного молочной кислотой, активированного с иммобилизованным альбумином (3). Иммобилизацию альбумина на поверхности модифицированного гемосорбента подтверждает наличие связи -NH(CO)-, характерное для белков, которое проявляется в области 1500-1700 см^-1 в виде двух полос поглощения 1500-1600 см^-1 и 1600-1700 см^-1 с максимумом при 1659 см^-1 (Шиманучи Т. Новые аспекты колебательной спектроскопии полимеров. В кн.: Структурные исследования макромолекул спектроскопическими методами. М: Химия, 1980. С.60-72).

Эффективность способа модифицирования поверхности углеродного гемосорбента полимерами оксикислот с последующей иммобилизацией сывороточного альбумина для избирательной сорбции патологических веществ белковой природы доказывают примеры сорбции малых М-белков (мембранные белки, молекулярная масса 30000-70000 г/моль) из плазмы крови больных гепатитами полученными сорбентами (см. таблицу). Сорбционные свойства повышаются по сравнению с прототипом в отношении к извлекаемым токсичным белкам: снижение концентрации токсичных белков для прототипа до 13,6%, для модифицированных образцов - до 8,7%.

Для иллюстрации изобретения приведены следующие примеры.

Пример 1 (по прототипу).

Навеску гемосорбента 0,05 г заливают плазмой крови больного микс-гепатитом с содержанием малых М-белков в белковой фракции «Глобулин γ-1» 19,3% и перемешивают на шейкере в течение часа при комнатной температуре. Концентрацию белков во фракции до и после контакта с гемосорбентом определяют методом капиллярного белкового электрофореза и далее расчетным путем. Количество белков в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 18,2%.

Пример 2.

Навеску гемосорбента 0,05 г пропитывают 18% раствором молочной кислоты при соотношении гемосорбент : раствор кислоты=1:10 при температуре 25°С в течение 3 ч, затем гемосорбент отделяют фильтрованием, высушивают при температуре 105°С до постоянного веса, выдерживают в инертной среде при температуре 200°С в течение 2 ч, кипятят в дистиллированной воде в течение 1 ч, после чего гемосорбент высушивают при комнатной температуре в течение 10 ч.

Затем проводят активацию обработкой 1М растворами N,N'-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в диметилформамиде при соотношении объем раствора : сорбент=5:1 при перемешивании реакционной смеси в течение 2 ч с последующей отмывкой диметилформамидом, затем водой и проводят адсорбцию белков плазмы крови больного микс-гепатитом по примеру 1.

Количество белков в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 13,6%.

Пример 3.

Модифицирование гемосорбента проводят по примеру 2, затем добавляют 1 мл приготовленного в буферном растворе с рН 7,4 сывороточного альбумина с концентрацией 1,0 мг/мл при перемешивании в течение 24 ч с последующей отмывкой 0,9% раствором хлорида натрия и проводят адсорбцию белков плазмы крови больного микс-гепатитом по примеру 1. Количество белков в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 12,5%.

Пример 4.

Модифицирование и активацию гемосорбента проводят по примеру 2, но сразу после отмывки диметилформамидом добавляют сывороточный альбумин по примеру 3 и проводят адсорбцию белков плазмы крови больного микс-гепатитом по примеру 1.

Количество белков в исследуемой фракции после контакта с гемосорбентом составило 8,7%.

Как следует из приведенных примеров, модифицирование поверхности углеродного гемосорбента растворами оксикислот на примере молочной кислоты с последующей активацией и иммобилизацией белка приводит к снижению его удельной адсорбционной поверхности S_БЭТ от 400 м²/г до 274 м²/г и сохранению мезопористой структуры. Важную роль в процессе модифицирования для образования ковалентной связи с иммобилизованным белком играет увеличение количества карбоксильных групп на поверхности гемосорбента при активации. Заявленный способ модифицирования позволяет избирательно сорбировать токсичные белки при микс-гепатитах.

Как следует из таблицы, модифицирование поверхности углеродного гемосорбента полимером оксикислоты с последующей активацией карбоксильных групп и иммобилизацией сывороточного альбумина позволяет повысить его адсорбционную активность по отношению к токсичным белковым молекулам определенной природы и молекулярной массы. Повышенная активность модифицированного образца по отношению к малым М-белкам подтверждена стендовыми медицинскими испытаниями на плазме крови больных микс-гепатитами.

Таким образом, сорбционная способность образцов углеродного гемосорбента, модифицированного молочной кислотой, активированного с иммобилизованным альбумином, через который пропущена плазма крови больного человека микс-гепатитом, значительно превосходит адсорбционную способность исходного углеродного гемосорбента.

	Текстурные характеристики	Концентрация кислородсодержащих групп, мэкв/г		Содержание малых М-белков в плазме крови больных гепатитом, %
Образец	Объем пор, см3/г		Суммарное количество групп	карбоксильных	фенольных	Содержание азота, %	До контакта геммосорбентом	После контакта с гемосорбентом
	суммарный	микропор	мезопор	Макропор	SБЭТ, м2/г
Пример 1. По прототипу	0,959	0,022	0,858	0,079	400	0,065	0,054	0,011	-	19,3	18,2
Пример 2. Углеродный гемосорбент, модифицированный молочной кислотой с последующей активацией	0,483	-	0,467	0,016	261	0,257	0,184	0,073	-	19,3	13,6
Пример 3.Углеродный гемосорбент, модифицированный молочной кислотой, с иммобилизованным белком	0,465	-	0,447	0,018	177	0,220	0,220	-	3,8	19,3	12,5
Пример 4. Углеродный гемосорбент, модифицированный молочной кислотой, с последующей активацией, с иммобилизованным белком	0,479	-	0,466	0,013	274	0,200	0,137	0,063	4,0	19,3	8,7

1. Способ модифицирования углеродного гемосорбента, включающий обработку водным раствором кислоты и высушивание продукта, отличающийся тем, что обработку проводят оксикислотой с концентрацией 5-20% при соотношении гемосорбент : раствор оксикислоты 1:10-1:20 в течение 2-4 ч, с выдержкой в инертной среде в течение 0,25-6 ч при температуре 120-350°С, кипячением в дистиллированной воде в течение 1-2 ч и сушкой, а затем 1М растворами N,N'-дициклогексилкарбодиимида и пентафторфенола в диметиламиде при перемешивании реакционной смеси в течение 0,5-3 ч, с последующим добавлением приготовленного в буферном растворе с рН 7,3-7,5 сывороточного альбумина с концентрацией 0,5-2,0 мг/мл при перемешивании в течение 16-24 ч с отмывкой 0,9%-ным раствором хлорида натрия.

2. Углеродный гемосорбент с иммобилизованным белком в виде гранул округлой формы размером 0,5-1,0 мм, с гладким рельефом поверхности, отличающийся тем, что получен способом по п.1, содержит на поверхности белок и характеризуется удельной адсорбционной поверхностью 250-280 м²/г, общим объемом пор 0,40-0,50 см³/г, преимущественно мезопор 0,35-0,48 см³/г, концентрацией кислородсодержащих групп на поверхности гранул 0,20-0,40 мэкв/г и содержанием общего азота 3-5%.