Сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения, эритроцитарный диагностикум для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения и способ диагностики наличия злокачественных новообразований с использованием указанного эритроцитарного диагностикума

Сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения, эритроцитарный диагностикум для диагностики злокачественных новообразований и способ его получения и способ диагностики наличия злокачественных новообразований с использованием указанного эритроцитарного диагностикума

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область использования изобретения

Изобретение относится к медицине, а конкретно к онкологии, и касается диагностики онкологических заболеваний.

Предшествующий уровень

В настоящее время известно множество способов диагностики онкологических заболеваний, в которых для диагностики наличия злокачественных новообразований используются различные эритроцитарные диагностикумы, с помощью которых определяют как наличие злокачественного новообразования, так и его локализацию в организме человека. Как правило, для этих целей используются эритроцитарные диагностикумы, в которых эритроциты сенсибилизированы сенситинами на основе антигенов, антител, или специфических белков.

Например, в патенте РФ №2202801, G01N 33/556 от 20.04.2003 описан способ диагностики с использованием эритроцитарного диагностикума, содержащего формализированные эритроциты барана, сенсибилизированные соответствующими антителами, что дает возможность с высокой достоверностью выявить конкретное заболевание. Данные способы обладают высокой эффективностью при выявлении локализованных заболеваний, но если требуется диагностировать наличие нелокализованного заболевания, то для такой диагностики требуется проведение многократных диагностических процедур с использованием большого количества различных эритроцитарных диагностикумов. В этом же патенте описан способ получения эритроцитарного диагностикума путем сенсибилизации формализированных эритроцитов барана соответствующими антителами. Известен эритроцитарный диагностикум, содержащий формализированные сенсибилизированные эритроциты барана, при этом в качестве сенситина используются антиген или антиген-белок, сопряженный с переносчиком (см. патент США №3987159, А61K 35/12, G01N 33/16 от 19.10/1976). В патенте описан также способ получения диагностикума, включающий в себя обработку крови барана для выделения из нее эритроцитов, отмывку и формализирование эритроцитов, получение суспензии эритроцитов в буферном растворе и сенсибилизацию выбранным антигеном.

Известен также способ диагностики наличия в организме злокачественных новообразований независимо от их типа и локализации в организме (см. например, патент РФ №2277242, G01N 33/49 от 27.05.2006). В известном способе для получения активного агента используется сыворотка беременных (жеребых) кобыл, полученная на 45-100 день жеребости, беременности. В известном способе используют два тестовых образца. В первом тестовом образце к крови пациента добавляют сыворотку крови беременных кобыл. Во втором контрольном образце к крови пациента добавляют нормальную лошадиную сыворотку. Далее измеряют скорость осаждения эритроцитов (СОЭ) в обоих тестовых образцах и сравнивают СОЭ первого тестового образца с СОЭ второго контрольного образца и рассчитывают диагностический коэффициент. При наличии у пациента злокачественного образования диагностический коэффициент будет превышать пороговое значение диагностического коэффициента для здорового лица. Данный способ основан на наличии в сыворотке крови беременных теплокровных животных разнообразных белковых соединений, проявляющих активность относительно злокачественных клеток и антигенов, вырабатываемых организмом при наличии злокачественного новообразования. Предположительно, что данное свойство сыворотки крови беременных теплокровных животных связано с тем, что в ходе беременности происходит быстрая дифференцировка стволовых клеток для формирования отдельных органов эмбриона и быстрое увеличение количества клеток отдельных органов. Это приводит к ответной реакции организма и выработке беременным теплокровным животным разнообразных антигенов и белковых соединений, которые должны проявлять повышенную активность в отношении злокачественных клеток и их белков, что в данном случае, по мнению авторов этого изобретения, подтверждается увеличением СОЭ для крови пациента.

Однако в известном способе на кровь пациента воздействуют полным набором белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл, в состав которых входят белковые соединения, активно взаимодействующие со злокачественными клетками и их белками, а также белковые соединения, слабо взаимодействующие со злокачественными клетками и их белками, и белковые соединения, инертные относительно злокачественных клеток и их белков. Пассивные белковые соединения сыворотки крови беременных кобыл снижают концентрацию активных компонентов в сыворотке крови беременных кобыл, что уменьшает эффективность использования сыворотки крови беременных кобыл для диагностики наличия злокачественных новообразований.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является выделение из сыворотки крови беременных кобыл на ранней стадии беременности белковых соединений, проявляющих стимулирующую активность в отношении злокачественных клеток и их белков, разработка сенситина для эритроцитарного диагностикума, самого эритроцитарного диагностикума, сенсибилизированного этими белковыми соединениями, а также разработка способов получения сенситина и эритроцитарного диагностикума с этим сенситином, и способа диагностики наличия злокачественного новообразования, использующего этот диагностикум.

Для решения указанных задач и достижения иных преимуществ предлагается сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики наличия злокачественных новообразований, представляющий собой смесь фракций низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенную из сыворотки крови беременной кобылы на ранней стадии беременности, проявляющую стимулирующую активность в отношении пролиферации злокачественных клеток.

Для решения указанных задач и достижения иных преимуществ предлагается также способ получения сенситина для эритроцитарного диагностикума для диагностики наличия злокачественных новообразований, включающий в себя получение сыворотки из крови беременных кобыл на ранней стадии беременности, фракционирование указанной сыворотки с использованием жидкостной хроматографии для выделения из нее смеси фракций низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, проявляющей стимулирующую активность в отношении пролиферации злокачественных клеток.

Предпочтительно, для выделения указанной смеси фракций низкомолекулярных соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да используют жидкостную хроматографию при высоком давлении, или жидкостную хроматографию в режиме гель-фильтрации, или жидкостную хроматографию быстрого разрешения (FPLC).

Предпочтительно, используют сыворотку крови беременных кобыл, находящихся на 20-60 дне беременности.

Кроме того, полученную смесь фракций низкомолекулярных соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенную из сыворотки крови беременных кобыл, диализируют относительно дистиллированной воды и лиофилизируют.

Для решения указанных задач и достижения иных преимуществ предлагается также эритроцитарный диагностикум для диагностики наличия злокачественных новообразований, содержащий формализированные эритроциты барана, сенсибилизированные смесью фракций низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенной из сыворотки крови беременных кобыл, находящихся на ранних стадиях беременности, и взаимодействующей с белками, стимулирующими пролиферацию злокачественных клеток.

При этом в качестве указанной сенсибилизирующей смеси фракций используют смесь фракций низкомолекулярных белков с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенную из сыворотки крови беременных кобыл, находящихся на 20-60 дне беременности.

При этом взаимодействие указанной сенсибилизирующей смеси фракций с сывороткой крови приводит к гемагглютинации белков сыворотки крови пациента.

Для решения указанных задач и достижения иных преимуществ предлагается также способ получения эритроцитарного диагностикума для диагностики наличия злокачественных новообразований, включающий в себя сенсибилизацию суспензии формализированных эритроцитов млекопитающих в буферном растворе с рН 6,4-6,6 сенситином, отличающийся тем, что в качестве сенситина используют смесь фракций низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенную из сыворотки крови беременных кобыл, находящихся на ранних стадиях беременности, и взаимодействующую с белками, стимулирующими пролиферацию злокачественных клеток.

При этом используют суспензию отмытых формализированных эритроцитов барана в фосфатном буфере.

Кроме того, для приготовления указанной суспензии используют 0,15 мольный фосфатный буфер.

Предпочтительно, используют смесь фракций низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенную из сыворотки крови беременных кобыл, находящихся на 20-60 дне беременности.

Предпочтительно, ингредиенты берут из расчета 0,1 мг лиофилизированного указанного сенситина на 1 мл 4% суспензии отмытых формализированных эритроцитов барана в фосфатном буфере.

Кроме того, сенсибилизированные эритроциты барана сохраняют в холодильнике при температуре в виде 2% суспензии в фосфатном буфере.

Для решения указанных задач и достижения иных преимуществ предлагается также способ диагностики наличия злокачественных новообразований с использованием эритроцитарного диагностикума, включающий в себя получение из крови пациента сыворотки, приготовление из сыворотки крови пациента нескольких тестовых образцов равного объема, причем первый тестовый образец содержит цельную сыворотку крови пациента, а следующие тестовые образцы содержат разбавленную сыворотку крови пациента, причем каждый последующий тестовый образец имеет меньшую концентрацию сыворотки крови пациента, добавление к каждому тестовому образцу сыворотки крови пациента равного количества эритроцитарного диагностикума, содержащего эритроциты, сенсибилизированные сенситином, в качестве которого используется смесь фракций низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенную из сыворотки крови беременных кобыл, находящихся на ранних стадиях беременности, и взаимодействующую с белками, стимулирующими пролиферацию злокачественных клеток, с последующей выдержкой этих тестовых образцов при комнатной температуре до окончания реакции гемагглютинации, определение тестовых образцов сыворотки крови пациента, в которых имела место реакция гемагглютинации, и тестовых образцов сыворотки крови пациента, в которых реакция гемагглютинации отсутствовала, определение минимальной концентрации сыворотки крови пациента в тестовом образце, при которой имела место реакция гемагглютинации, и/или максимальной концентрации сыворотки крови пациента в тестовом образце, при которой реакция гемагглютинации отсутствовала, сравнение результатов определения указанной минимальной и/или максимальной концентрации сыворотки крови пациента в тестовом образце с их пороговыми значениями, полученными для сыворотки крови здоровых лиц, не имеющих злокачественных новообразований, и диагностику наличия у пациента злокачественных новообразований, если результаты определения указанной минимальной и/или максимальной концентрации сыворотки крови пациента хуже, чем указанные пороговые значения.

При этом для проведения реакции гемагглютинации используют микроплаты с лунками, в каждую из которых помещают по одному тестовому образцу сыворотки крови пациента.

Кроме того, для получения пороговых значений максимальной и/или минимальной концентрации сыворотки крови на этой же микроплате в свободные лунки помещают тестовые образцы сыворотки крови, по крайней мере, одного здорового лица, приготовленные аналогично тестовым образцам сыворотки крови пациента, и для этих тестовых образцов определяют минимальную концентрацию сыворотки крови здорового лица, при которой имела место реакция гемагглютинации, и/или максимальную концентрацию сыворотки крови здорового лица, при которой реакция гемагглютинации отсутствовала, и используют их в качестве указанных пороговых значений.

При этом запоминают полученные пороговые значения максимальной и/или минимальной концентрации сыворотки крови.

Как вариант для получения пороговых значений максимальной и/или минимальной концентрации сыворотки крови приготавливают тестовые образцы сыворотки крови, по крайней мере, одного здорового лица, проводят для них реакцию гемагглютинации, определяют минимальную концентрацию сыворотки крови здорового лица, при которой имела место реакция гемагглютинации, и/или максимальную концентрацию сыворотки крови здорового лица, при которой реакция гемагглютинации отсутствовала, и запоминают полученные пороговые значения.

Предпочтительно, эритроцитарный диагностикум добавляют к тестовым образцам в виде 0,16% суспензии сенсибилизированных эритроцитов баранов в фосфатном буфере с рН 6,4-6,6 из расчета 10 мкл указанной суспензии на 100 мкл тестового образца.

Заявленное изобретение дает возможность, используя эритроцитарный диагностикум, в котором эритроциты сенсибилизированы смесью фракций низкомолекулярных белков с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенной из сыворотки крови беременной кобылы на ранней стадии беременности, определить минимальную концентрацию сыворотки крови пациента, при которой имела место реакция гемагглютинации, и/или максимальную концентрацию сыворотки крови пациента, при которой реакция гемагглютинации отсутствовала, и с высокой степенью достоверности определить, имеются ли у пациента злокачественные новообразования. При этом заявленное изобретение дает возможность провести амбулаторное обследование пациента непосредственно по месту жительства, так как предлагаемый эритроцитарный диагностикум можно приготовить в специализированных клиниках и доставить его в любую местную клинику, а сыворотку крови пациента можно получить непосредственно на месте.

Заявленное изобретение позволяет количественно оценить (по коэффициенту разбавления тестового образца сыворотки крови пациента) возможную стадию онкологического заболевания, что даст возможность спланировать программу дальнейшего обследования пациента, у которого имеется подозрение на наличие злокачественного новообразования.

Заявленное изобретение позволяет достаточно быстро провести обследование больших групп населения для выявления лиц, у которых могут быть злокачественные новообразования, независимо от их локализации в организме.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фигуры в заявке представлены в виде, достаточном для понимания принципов изобретения специалистами в области онкологии, и ни в какой мере не ограничивают объема настоящего изобретения.

На фиг.1 представлена хроматограмма разделения на фракции сыворотки крови беременных кобыл с использованием жидкостной хроматографии при высоком давлении.

На фиг.2 представлена хроматограмма разделения на фракции сыворотки крови беременных кобыл с использованием жидкостной хроматографии в режиме гель-фильтрации.

На фиг.3 представлена хроматограмма разделения на фракции сыворотки крови беременных кобыл с использованием жидкостной хроматографии быстрого разрешения (FPLC).

На фиг.4 показана одна из микроплат с тестовыми образцами сыворотки крови здоровых лиц (верхние ряды) и сыворотки крови пациента (нижние ряды) после взаимодействия с предлагаемым эритроцитарным диагностикумом.

ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следует понимать, что данное описание служит только для иллюстрации осуществления изобретения и ни в какой мере не ограничивает объема настоящего изобретения.

Далее будет доказана возможность получения из сыворотки крови беременных кобыл на ранней стадии беременности активного агента, проявляющего активность в отношении стимулирования пролиферации злокачественных клеток, который можно использовать как сенситин для эритроцитарного диагностикума для диагностики наличия в организме злокачественных новообразований. В описании при указании процентного содержания ингредиентов подразумевается, что речь идет об объемных процентах, если это не оговорено специально.

Для получения сыворотки использовалась кровь беременных (жеребых) кобыл на 20-60 дне беременности. Сыворотка из крови беременных кобыл получалась любым из известных способов. Для хранения сыворотки в нее добавляли 1% мертиолата из расчета 5 мл на 100 мл сыворотки. Полученные сыворотки должны содержать не менее 10-15% белков и пептидов.

В соответствии с первым примером получения указанного активного агента, для определения белковой насыщенности полученной сыворотки крови беременных кобыл и разделения белков сыворотки беременных кобыл по молекулярной массе проводят жидкостную хроматографию под высоким давлением (HPLC). Использовалась колонка Ultrapac TSK G 3000 SW 0.75×60 см фирмы "LKB", дающая разделение белков в диапазоне 2-340 кДа. Разделение на отдельные фракции производилось с использованием 0,15-мольного фосфатного буфера с рН 6,4-6,6 (КН₂РO₄+Na₂HPO₄+NaCl). Доза сыворотки крови беременных кобыл уравновешивалась фосфатным буфером того же состава, что использовался в колонке. Уравновешенную дозу сыворотки крови беременных кобыл вводили в колонку и разделяли на фракции при скорости протекания 12 мл/час. Выделенные фракции сыворотки крови беременных кобыл собирались в коллекторные пробирки. В настоящем эксперименте использовались 30 пробирок. Разделение сыворотки крови беременных кобыл показало, что исследуемая сыворотка крови беременных кобыл содержит большое количество фракций белковых соединений в широком диапазоне изменения их молекулярной массы от 200 кДа до 3 кДа с явно выраженными четырьмя высокими пиками: первый пик в области 35-45 кДа, второй пик в области 25 кДа, третий пик в области 15 кДа и четвертый пик в области 5 кДа (см. хроматограмму на фиг.1). Для каждой коллекторной пробирки выделенные смеси фракций белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл диализировались относительно буфера и лиофилизировались. Было получено 30 образцов смеси фракций белковых соединений беременных кобыл (по числу коллекторных пробирок), которые были проверены на активность в отношении размножения злокачественных клеток.

Проверка активности фракций белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл выполнялась с использованием МТТ-теста (микротетразолиевый тест). МТТ-тест основан на ферментном восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид) в живых метаболически активных клетках с образованием голубых кристаллов формазана.

Предварительная проверка активности выделенных фракций белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл показала, что активность в отношении стимулирования пролиферации злокачественных клеток проявляют смеси фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл с молекулярной массой от 3000 Да до 15000 Да (соответствующие второму и третьему пикам на хроматограмме на фиг.1). При этом наибольшую активность показали фракции низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенные из крови беременных кобыл на 20-60 дне беременности. Указанные смеси фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл, имеющих молекулярную массу 3000-15000 Да, были проверены на стимулирующую активность в отношении злокачественных клеток для трех онкологических заболеваний. Результаты проверки стимулирующей активности будут приведены в последующих разделах описания.

Высокомолекулярные фракции белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл, соответствующие первому и второму пикам на хроматограмме на фиг.1, стимулирующей активности в отношении размножения злокачественных клеток не показали и в дальнейших исследованиях не использовались.

В соответствии с вторым примером получения указанного активного агента, сыворотка крови беременных кобыл на 20-60 дне беременности разделяется на фракции с использованием жидкостной хроматографии в режиме гель-фильтрации. В лабораторных условиях для выделения из сыворотки крови беременных кобыл интересующих нас фракций низкомолекулярных белковых соединений проводилась гель-фильтрация этой сыворотки на колонке 100×1 см, заполненной Сефадексом G-150 или Сефадексом G-50. Колонка уравновешена 0.01М Tris HCl буфером с рН 8.0. Доза сыворотки крови беременных кобыл уравновешивалась буфером того же состава, что использовался в колонке. Уравновешенную дозу сыворотки крови беременных кобыл вводили в колонку и разделяли на фракции при скорости протекания 12 мл/час или 30-40 мл/час. Выделенные фракции сыворотки крови беременных кобыл собирались в коллекторные пробирки. В настоящем эксперименте использовались 48 коллекторных пробирок. Хроматограмма сыворотки крови беременных кобыл, полученная при гель-фильтрации указанной сыворотки на хроматографической колонке, показана на фиг.2. Хроматограмма на фиг.2 совпадает с хроматограммой на фиг.1 и также показывает высокий пик для фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл с молекулярной массой 3000-1500 Да, которые собираются в 15, 16 и 17 коллекторных пробирках. Для получения достаточного количества исследуемой смеси фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл выполняют несколько гель-фильтраций и суммируют содержимое конкретной контрольной пробирки. Выделенные смеси фракций белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл диализируют против буферного раствора и лиофилизируют. Получено 48 лиофилизированных образцов, для которых была проведена оценка их стимулирующей активности с использованием МТТ-теста (микротетразолиевый тест). Результаты оценки стимулирующей активности фракций белковых соединений в данном эксперименте совпадают с результатами, полученными для образцов этих же фракций по методу описанной выше жидкостной хроматографии при высоком давлении. Для дальнейшего исследования стимулирующей активности использовались фракции низкомолекулярных белковых соединений сыворотки беременных кобыл из 13-17 коллекторных пробирок.

В соответствии с третьим примером получения указанного активного агента, сыворотка крови беременных кобыл на 20-60 дне беременности разделяется на фракции с использованием жидкостной хроматографии быстрого разрешения (FPLC) на колонке mono Q с применением двух буферов А и В. Хроматограмма сыворотки крови беременных кобыл, полученная с использованием жидкостной хроматографии быстрого разрешения (FPLC), показана на фиг.3. Хроматограмма на фиг.3 совпадает с хроматограммой на фиг.1 и также показывает высокий пик для фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл с молекулярной массой 3000-15000 Да, которые собираются в 15, 16 и 17 коллекторных пробирках. Используя данный способ, выделили смесь фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл с молекулярной массой 3000-15000 Да, из которых приготовили лиофилизированные образцы исследуемых фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл.

Проверка стимулирующего воздействия в отношении размножения злокачественных клеток фракций низкомолекулярных белков сыворотки крови беременных кобыл, находящихся на ранней стадии беременности.

Проверка активности фракций белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл выполнялась с использованием МТТ-теста (микротетразолиевый тест). МТТ-тест основан на ферментном восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид) в живых метаболически активных клетках с образованием голубых кристаллов формазана.

Для экспериментов использовали 96-луночные микроплаты. В каждую лунку помещали культуру раковых клеток - 17 тыс. клеток в 5% СO₂. Затем в лунки вносили исследуемые фракции белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл в заданной концентрации - 20 мкг исследуемой смеси фракций в 180 мкл дистиллированной воды (разбавление 1:10) и инкубировали 48 часов при тех же условиях. По окончании инкубации в лунки добавляли МТТ-реагент в конечной концентрации 25 мкг/мл и инкубировали далее в течение 4 часов в тех же условиях. Образовавшиеся голубые кристаллы формазана растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в течение 20 минут. Оптическое поглощение окрашенных растворов измеряли, используя спектрофотометр Titertek Multiskan MCC/341 при длине волны 570 нм. Результаты, полученные для исследуемых образцов фракций белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл, сравнивались с результатами контрольных образцов (без добавления к клеточной культуре исследуемых фракций белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл). Для оценки стимулирующего воздействия фракций белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл на клетки использовался коэффициент СК, определяемый по известной формуле:

СК% = (1-N опыт/N контроль)×100%,

используемой для количественной оценки стимулирующего воздействия активного агента.

Стимулирующее воздействие смеси фракций низкомолекулярных соединений сыворотки беременных кобыл на ранних стадиях беременности относительно злокачественных клеток проверялось для трех онкологических заболеваний: рак толстой кишки человека, рак легкого человека и рак яичников человека.

Эксперимент 1

В этой серии экспериментов проверялось воздействие фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл с молекулярной массой 3000-15000 Да на культуру злокачественных клеток рака яичника человека SKOV-3. Эксперименты проводились с использованием МТТ-теста (микротетразолиевый тест) в соответствии с описанной выше методикой. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. В качестве контрольного образца использовался буфер (трисбуфер).

Таблица 1
№ фракции (№ коллекторной пробирки)	Результат взаимодействия
Контрольный буфер (трисбуфер)	Ингибирование 2,0%
Фракция №13	Эффекта нет
Фракция №14	Эффекта нет
Фракция №15	Стимулирование 18%
Фракция №16	Стимулирование 32%
Фракция №17	Стимулирование 30%

Как видно из таблицы 1, фракции низкомолекулярных белков сыворотки крови, собранные в контрольных пробирках 15, 16 и 17 и имеющие молекулярную массу 3000-15000 Да, проявляют явный стимулирующий эффект в отношении размножения злокачественных клеток рака яичника человека SKOV-3.

Эксперимент 2

В этой серии экспериментов проверялось воздействие фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл с молекулярной массой 3000-15000 Да на культуру злокачественных клеток рака толстой кишки человека. Эксперименты проводились с использованием МТТ-теста (микротетразолиевый тест) в соответствии с описанной выше методикой. Результаты эксперимента представлены в таблице 2. В качестве контрольного образца использовался буфер (трисбуфер).

Таблица 2
№ фракции (№ коллекторной пробирки)	Результат взаимодействия
Контрольный буфер (трисбуфер)	Ингибирование 5,0%
Фракция №13	Эффекта нет
Фракция №14	Эффекта нет
Фракция №15	Стимулирование 22%
Фракция №16	Стимулирование 41%
Фракция №17	Стимулирование 28%

Как видно из таблицы 2, фракции низкомолекулярных белков сыворотки крови, собранные в контрольных пробирках 15, 16 и 17 и имеющие молекулярную массу 3000-15000 Да, проявляют явный стимулирующий эффект в отношении размножения злокачественных клеток рака толстой кишки человека.

Эксперимент 3

В этой серии экспериментов проверялось воздействие фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл с молекулярной массой 3000-15000 Да на культуру злокачественных клеток рака легкого человека. Эксперименты проводились с использованием МТТ-теста (микротетразолиевый тест) в соответствии с описанной выше методикой. Результаты эксперимента представлены в таблице 3. В качестве контрольного образца использовался буфер (трисбуфер).

Таблица 3
№ фракции (№ коллекторной пробирки)	Результат взаимодействия
Контрольный буфер (трисбуфер)	Ингибирование 7,0%
Фракция №13	Эффекта нет
Фракция №14	Эффекта нет
Фракция №15	Стимулирование 16%
Фракция №16	Стимулирование 26%
Фракция №17	Стимулирование 22%

Как видно из таблицы 3, фракции низкомолекулярных белков сыворотки крови, собранные в контрольных пробирках 15, 16 и 17 и имеющие молекулярную массу 3000-15000 Да, проявляют явный стимулирующий эффект в отношении размножения злокачественных клеток рака легкого человека.

Как видно из результатов экспериментов 1-3, фракции низкомолекулярных белков сыворотки крови беременных кобыл имеют явный стимулирующий эффект в отношении размножения злокачественных клеток для различных раковых заболеваний. Минимальный наблюдавшийся коэффициент СК равнялся 16%, что, как будет показано дальше, является достаточным для использования этих фракций в эритроцитарном диагностикуме для диагностики наличия в организме злокачественных новообразований.

Таким образом, предлагаемый способ получения из сыворотки крови беременных кобыл на ранней стадии беременности активного агента обеспечивает получение сенситина, проявляющего стимулирующую активность в отношении злокачественных клеток, для сенсибилизации эритроцитов диагностикума для диагностики наличия злокачественных новообразований.

Для использования выявленного активного агента, представляющего собой смесь фракций низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенную из сыворотки крови беременных кобыл на ранней стадии беременности, предложен эритроцитарный диагностикум, в котором данный активный агент используется в качестве сенситина.

Предлагаемый эритроцитарный диагностикум содержит формализированные эритроциты барана, нагруженные сенситином (активным агентом), проявляющим стимулирующую активность в отношении злокачественных клеток. В качестве сенситина используется смесь фракций низкомолекулярных соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенная из сыворотки крови беременных кобыл на ранней стадии беременности. В реакции с сывороткой крови больных людей предлагаемый эритроцитарный диагностикум может выявить наличие и активность связывающих белков, участвующих в процессе злокачественной трансформации.

Предлагаемый эритроцитарный диагностикум получают следующим образом.

Кровь барана, взятую в раствор Олсевера, подвергают формалинизации любым известным способом. В заявленном изобретении кровь барана выдерживали в холодильнике 3-4 дня для стабилизации эритроцитов, затем проводили отмывку и формалинизацию эритроцитов барана. Отмытые формализированные эритроциты барана можно использовать для получения эритроцитарного диагностикума непосредственно после их приготовления, или их можно сохранять для последующего использования в холодильнике в виде 2% суспензии эритроцитов в дистиллированной воде.

Для сенсибилизации (нагрузки) эритроцитов барана приготавливают 4% суспензию отмытых формализированных эритроцитов барана в 0,15-мольном фосфатном буфере с рН 6,4-6,6, аналогичном буферу, используемому в хроматографических колонках при выделении активного агента из сыворотки беременных кобыл. При сенсибилизации эритроцитов барана в 4% суспензию эритроцитов барана добавляют смесь фракций низкомолекулярных белковых соединений с молекулярной массой 3000-15000 Да, выделенную с помощью хроматографии из сыворотки крови беременных кобыл, находящихся на ранних стадиях беременности, предпочтительно на 20-60 дне беременности, из расчета 0,1 мг лиофилизированных фракций низкомолекулярных белковых соединений сыворотки крови беременных кобыл на 1 мл 4% суспензии отмытых формализированных эритроцитов барана в фосфатном буфере. Процесс сенсибилизации эритроцитов проводят в инкубаторе при температуре 45-56°С. Данные фракции проявляют стимулирующую активность в отношении злокачественных клеток и взаимодействуют с белками, стимулирующими пролиферацию злокачественных клеток, что дает возможность использовать этот эритроцитарный диагностикум для диагностики наличия у пациента злокачественных новообразований без локализации новообразования в организме практически на любых стадиях канцерогенеза.

Предложенный эритроцитарный диагностикум можно использовать непосредственно после изготовления. При необходимости хранения эритроцитарного диагностикума для последующего использования из полученной 4% суспензии отмытых формализированных эритроцитов барана в фосфатном буфере изготавливают 2% суспензию отмытых формализированных эритроцитов барана в фосфатном буфере, которую хранят в холодильнике.

Способ диагностики наличия у пациента злокачественных образований реализуется следующим образом.

Диагностика наличия у пациента злокачественных новообразований проводилась на микроплатах, имеющих в каждом горизонтальном ряде по 8 лунок емкостью 250 мкл, но могут использоваться и другие микроплаты.

При обследовании пациента на наличие (или отсутствие) у него злокачественных новообразований берут пробу крови пациента, например в объеме 3,5-6 мл, и отделяют от нее сыворотку. Полученную сыворотку разделяют на несколько доз и приготавливают тестовые образцы сыворотки, при этом первый тестовый образец содержит цельную сыворотку крови пациента, а следующие тестовые образцы содержат разбавленную фосфатным буфером, аналогичным буферу, применяемому при получении эритроцитарного диагностикума, сыворотку крови пациента, причем каждый последующий тестовый образец имеет меньшую концентрацию сыворотки. В данном эксперименте в каждом последующем тестовом образце концентрация сыворотки уменьшалась в два раза, т.е. в данном эксперименте использовался шаг коэффициента разбавления 2, но можно изготавливать тестовые образцы с любым приемлемым шагом коэффициента разбавления, например, 1,5 или 2,5. Каждый тестовый образец сыворотки крови пациента, например, в количестве 100 мкл, размещают в соответствующей лунке микроплаты, так что в последовательном ряде лунок с исследуемым образцом сыворотки концентрация сыворотки в лунках уменьшается пропорционально шагу коэффициента разбавления: в первой лунке 100% сыворотка крови пациента, во второй лунке 50% и в последней десятой лунке концентрация сыворотки в 512 раз меньше, чем в первой лунке. При большем количестве лунок или при другом шаге коэффициента разбавления можно получить тестовый образец, в котором концентрация сыворотки крови в тысячу или в несколько тысяч раз меньше, чем в первой лунке.

Для непосредственного проведения диагностики исследуемого образца сыворотки крови пациента на наличие злокачественных новообразований из ранее подготовленного эритроцитарного диагностикума приготавливают 0,16% суспензию эритроцитов барана, сенсибилизированных извлеченными из сыворотки беременных (жеребых) кобыл низкомолекулярными белками с молекулярной массой 3000-15000 Да, проявляющими стимулирующую активность в отношении злокачественных клеток, в фосфатном буферном растворе. В каждую лунку с образцом сыворотки крови пациента вносят по 10 мкл 0,16% суспензии эритроцитов барана. Таким образом обеспечивается одинаковое количество активного ингредиента (сенсибилизированных на эритроцитах низкомолекулярных белков, извлеченных из сыворотки крови беременных кобыл) в каждой лунке.

В качестве контрольного образца используют тестовые образцы из сыворотки крови здоровых людей, приготовленные в соответствии с описанной выше технологией и помещенные в лунки в одном из горизонтальных рядов микроплаты.

Микроплату с загруженными лунками осторожно встряхивают и выдерживают при комнатной температуре или инкубируют при комнатной температуре в теч