Вакцина ассоциированная против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа i инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная

Вакцина ассоциированная против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа i инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к технологии изготовления вакцины против вирусных респираторно-кишечных инфекций телят и обусловливаемых ими нарушений репродуктивной функции взрослого поголовья крупного рогатого скота.

Известно, что в структуре заболеваемости с-х животных в РФ наибольшее экономическое значение имеют респираторные и желудочно-кишечные инфекции телят и патология органов воспроизводства маточного поголовья крупного рогатого скота, связанные с ранней эмбриональной смертностью, абортами, доминирующими возбудителями которых являются вирусы, относящиеся к различным таксономическим группам. Среди них по тяжести проявления клинической картины на первый план выходят герпесвирусная инфекция типа I (ИРТ), вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек (ВД-БС), респираторно-синцитиальная (PC), парвовирусная, аденовирусная, реовирусная, рота-коронавирусная инфекции крупного рогатого скота, различные сочетания которых вызывают не только поражения органов дыхания и пищеварения у телят, но и нарушения функций репродуктивных органов взрослого поголовья. Также доказано, что сперма быков, инфицированных этими вирусами, служит источником заражения коров и телок. При этом заболеваемость телят достигает 80-100%, сопровождается частыми рецидивами и гибелью от 20-30 до 56% больных животных, нанося ощутимый экономический ущерб скотоводству.

Имеющаяся в литературе информация последних лет и накопленные нами знания свидетельствуют о том, что наблюдается нарастание уровня инфицированности коров и телок возбудителями, способными поражать эмбрион и плод. Таковыми являются, наряду с герпесвирусом и вирусом ВД-БС, и малоизученные в РФ парвовирус и реовирус крупного рогатого скота, которые могут проникать через плаценту в плод стельной коровы, обуславливая аборт и мертворождение. При этом возникновение и распространение не лимитируется внешними факторами, а занос этих вирусов в хозяйство закономерно приводит к вспышкам указанных выше форм патологий.

Заслуживает внимания тот факт, что зарубежные авторы придают большое значение в этиопатогенезе этих форм патологий парвовирусу типа I крупного рогатого скота, антигенно отличающемуся от парвовирусов других видов животных и человека, вызывающему не только поражения органов пищеварения и дыхания у телят, но и нарушения воспроизводительной функции у коров и телок, проявляясь клинически эмбриональной смертностью, абортами, мертворожденностью, эндометритами и гипофункцией яичников (Elschner, M. Untersuchungen zur Diagnostik von bovinen Parvoviren in Kotproben von Kalbern / Berl. u. munch, tierarztl. Wschr. - 1994. - Jg. 108. - H.7. - S.256-260; David Sandals W.C., Charles Povey R. and Alan H. Meek. Prevalence of Bovine Parvovirus Infection in Ontario Dairy Cattle / Can J. Vet. Res. - 1995. - 59:81-86).

Известно также, что парвовирусная инфекция крупного рогатого скота характеризуется широким распространением среди естественно восприимчивых животных в США, Европе, Японии, Канаде и Алжире. При этом уровень антител в сыворотке крови коров в США составил 65-85% обследованного скота, в Алжире - 70%, в Великобритании - 46% (Storz, J., Bates R.C. Parvovirus infection in calves / J. Am. Vet. Med. Assoc. - 1973. - V.163. - P.884-886).

Клинически парвовирусная инфекция у телят проявляется, в основном, в виде поражения органов пищеварения: диарея развивается через 24-48 часов после инфицирования (Spahn, G.J., et al., Characteristics of hemadsorbing enteric (HADEN) virus / Canad. J. Microbiol. - 1966. - V.12. - P.653-660.; Durham Р.J.K. et al., Epidemiological studies of parvovirus infection in calves on endemically infected properties / J. Res. Vet. Sci. - 1985. - V.38. - №2. - P.234-240; Sandals, W.C.D. Prevalence and seroepidemiology of bovine parvovirus / MSc Thesis, University of Guelph, 1989. - P.432-437).

Кроме того, выяснилось, что у экспериментально зараженных телят вирус регулярно обнаруживается в лимфоузлах, селезенке, тимусе; он накапливается в высоких титрах в клетках надпочечников. Причем наиболее часто специфический вирусный антиген обнаруживают в эпителиальных клетках тощей, подвздошной и слепой кишок, а также в лейкоцитах крови (Storz J. et al., Parvovirus infection in calves / J. Am. Vet. Med. Assoc. - 1973. - V.163. - P.884-886).

При экспериментальном заражении коров на 3-4-м месяце стельности внутривенно или на 5-6-м месяце в амнион они абортировали соответственно спустя 3-5 недель. Вирус обнаружили в тимусе, легких и селезенке мумифицированных плодов. При этом парвовирус длительно персистировал в организме коровы (Bachman, P.A. Properties of a bovine parvovirus // Zbl. Vet., Med., 1871. - P.80-85; Bodine, A.B., et al., Possible «immuno-protection» of the bovine parvovirus in the uterus: Preliminary communication / J. Possible Theriogenology. - 1981. - V.16. - P.201-206).

В нашей стране первые сообщения о выделении штамма «В-2» парвовируса крупного рогатого скота, отнесенного к третьему серотипу парвовирусов и антигенно отличающегося от референтного штамма «Haden», были опубликованы в 1976 году (Зудилина З.Ф. с соавт. Выделение парвовируса крупного рогатого скота / Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. - Владимир. - 1976; Крюков, Н.Н. с соавт. Парвовирусная инфекция крупного рогатого скота / Ветеринария. - 1988. - №7. - С.27-29; Юров К.П. с соавт. Парвовирусная Инфекция крупного рогатого скота / Ветеринария. - 1994. - №5. - С.26-27; Мищенко В.А. с соавт. Особенности парвовирусной инфекции крупного рогатого скота / Ветеринария. - 2000. - №5. - С.19-21).

При этом авторы подчеркивали широкое распространение парвовирусной инфекции, патогенность этого вируса для крупного рогатого скота, его способность проникать в ткани различных отделов кишечника и прилегающих к ним лимфатических узлов, а также преодолевать плацентарный барьер, вызывая эмбриональную смертность.

С 1959 года известно, что у телят реовирусная инфекция проявляется пневмоэнтеритами в первые 3 месяца жизни. У взрослых животных болезнь протекает латентно. Впервые ее зарегистрировали в США, Бельгии, ФРГ и других странах. В Германии доказано участие реовирусов в поражении респираторного тракта телят, в патологии плода и новорожденного. При исследовании 283 животных 2-6-летнего возраста на 47 фермах Швеции с клиническими признаками острого респираторного и (или) кишечных заболеваний было установлено, что с реовирусом типа I реагировало 71-81% исследованных сывороток (Moreno-Lopez I. A Serosurvey of viruses during outbreaks of acute respiratory and/or enteric disease in Swedish cattle. / Zbl. Veter. - Med. Reihe В., 1979, 26, 8:634-640).

Привлекают внимание также сообщения о том, что штаммы реовирусов человека и животных вызывают одинаковые изменения: размножаются в одних и тех же культурах ткани и вызывают аналогичные реакции у естественных хозяев. Возможны заболевания людей при заражении бычьим реовирусом I-типа и телят при заражении любым из серотипов вируса человека. Следовательно, реовирусную инфекцию можно отнести к зоонозам, одновременно поражающим крупный рогатый скот, лошадей и человека, подобно гриппу. Реовирусы в связи с их высокой контагиозностью и устойчивостью во внешней среде часто являются причиной эпидемических вспышек. В циркуляции вируса важную роль играет бессимптомное вирусоносительство. Вирус патогенен для мышей-сосунов при заражении в мозг, подкожно, внутрибрюшинно или интраназально, гибель их наступает через 5-12 дней с поражением печени, миокарда, нервных клеток (Ритова В.В. с соавт. Реовирусы и их роль в инфекционной патологии человека и животных/Вопросы вирусологии. - 1977. - №2. - С.134-141).

Известно, что эффективность молочного скотоводства обуславливается высокой продуктивностью коров и их сохранностью. Ускоренное развитие животноводства, предусмотренное приоритетным национальным проектом «Развитие АПК», осуществляется увеличением поголовья высокопродуктивных коров не только за счет разведения местного поголовья, но и за счет ввоза скота из-за рубежа. Так, к примеру, в Республику Татарстан (РТ) начиная с 2004 года завезено около 30 тыс. голов крупного рогатого скота из Германии, Голландии, Венгрии, Дании, Канады, Австрии, Эстонии, Австралии.

Широкое распространение парво- и реовирусных инфекций в странах Западной Европы, учитывая вероятность заноса этих вирусов с импортным поголовьем, определили необходимость исследования 838 проб сывороток крови крупного рогатого скота, полученных из 21 хозяйства 6 районов Республики Татарстан. Результаты исследований, проведенные нами, показали, что серопозитивность в ИФА к парвовирусному антигену составляет 72,2% (605 проб) и реовирусному антигену - 33,7% (194 пробы). Более высокий процент положительно реагирующих животных наблюдали в хозяйствах, где размещался импортированный скот.

Полученные результаты указывают на факт циркуляции этих возбудителей среди различных возрастных групп крупного рогатого скота.

Распространению их способствуют: большая концентрация животных, поступающих из различных в эпизоотическом отношении хозяйств, все более усиливающаяся индустриализация содержания и эксплуатации, широкий обмен животными внутри страны и завоз из-за рубежа ценных высокопродуктивных животных, трудности организации непрерывного производства полноценного кормления и создания оптимального микроклимата. Поэтому создаются благоприятные условия для циркуляции и усиления вирулентности перечисленных выше возбудителей, которые чаще всего в ассоциации, на фоне факторов стресса способны вызывать эпизоотический процесс.

В РФ многие годы недооценивалась роль парвовирусной и реовирусной инфекций в патологии крупного рогатого скота, что сдерживало разработку средств лабораторной диагностики и специфической профилактики.

Обращают на себя внимание высказывания ряда исследователей о том, что до сих пор созданные вакцины не решили проблему, хотя при их использовании заболеваемость уменьшается, но все же решительного перелома не достигается. Так, например, в рекомендациях РАСХН (Сибирское отделение), ГНУ ИЭВС и ДВ «Планирование программ вакцинации при вирусных респираторных заболеваниях крупного рогатого скота», подготовленной группой ученых с участием руководителей управления ветеринарии Тюменской и Новосибирской областей (А.Г.Глотов, Т.И.Глотова, А.В.Нефедченко, В.А.Качанов, Ю.Н.Зайцев/ РАСХН, Сиб. отд-е, ГНУ ИЭВС и ДВ. - Новосибирск, 2006. - 36 с.), также подчеркивается, что защита плода, индуцированная вакцинами, выпускаемыми в РФ, к сожалению, не всегда полная и пока нет таких вакцин, показавших полную защиту. Это говорит о том, что в стране недостаточно полно раскрыта этиологическая структура респираторно-кишечных инфекций молодняка и патологий репродуктивных органов взрослого поголовья крупного рогатого скота.

Для специфической профилактики вирусных респираторно-кишечных инфекций молодняка и маточного поголовья крупного рогатого скота в РФ применяют живые и инактивированные вакцины.

Известна вирусвакцина «ТКА-ВИЭВ» против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, которая используется в РФ в случаях возникновения этой инфекции, и иммунизируют всех животных, находящихся в эпизоотическом очаге, а также в хозяйствах мясного направления при стационарном неблагополучии прививают всех животных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении.

Известна вакцина против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота сухая, культуральная, ассоциированная, содержащая лиофилизированный вакцинный вирус парагриппа-3 из штамма ПТК-45/86 и вакцинный вирус инфекционного ринотрахеита из штамма ТКА (ВИЭВ), выращенные в культуре клеток почки теленка, и защитную среду высушивания. Вакцину вводят подкожно телятам в возрасте 1-6 месяцев двукратно, 7 месяцев и старше - однократно (О.И.Сухарев, Н.Г.Осидзе, Н.Р.Гладченко и др. Ассоциированная вакцина «Бивак» против инфекционного ринотрахеита и парагриппа-3 крупного рогатого скота, способ ее изготовления и способ профилактики инфекционного ринотрахеита парагиппа-3 / А.с. №1092778. - Заявл. 17.12.1982 г., №3523289).

Известна вакцина ассоциированная против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная, эмульсионная. В состав вакцины входят инактивированные концентрированные антигены вирусов парагриппа-3 штамм ПТК-45/86, инфекционного ринотрахеита штамм ТКА (ВИЭВ) и возбудителя хламидийного аборта коров штамм «250», эмульгированные в масляном адъюванте (Свидетельство о гос. регистрации № ПВР-1-4.8/02246 от 27 августа 2008 г., срок действия 27 августа 2013 года).

Известна вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (Комбовак К), представляющая собой комплексный препарат для профилактики четырех вирусных и бактериальных болезней крупного рогатого скота, характеризующихся желудочно-кишечным синдромом. Вакцина изготовлена из инактивированных штаммов трех вирусов: рота-, корона- и вирусной диареи, протективных антигенов эшерихий: соматических 09, 078, 0115; капсульных полисахаридных К80, К30, адгезивных антигенов К99, F41; термостабильных и термолабильных инактивированных энтеротоксинов.

Известна вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (Комбовак Р). Вакцина изготовлена из инактивированных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и двух видов пастерелл: Pasteurella multocida (серовары А, В и D) и Pasteurella haemolitica.

Известна вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезней телят (Комбовак), представляющая собой композицию из шести штаммов вирусов, инактивированных формалином, содержащим не мене 37% формальдегида, и сорбированных на 6%-ном геле гидроокиси алюминия (ГОА) и сапонина, предназначенная для иммунизации телят, нетелей и коров в хозяйствах, неблагополучных по желудочно-кишечным респираторным болезням. Общим недостатком вышеперечисленных известных вакцин является отсутствие в их составе иммуногенов таких возбудителей, как парвовирус и реовирус, что значительно снижает ее эффективность. Аналогичная картина наблюдается при анализе состава компонентов вакцины «Бови-шилд Голд FP5 L5» (Pfhizer Animal Health Products. - 1992. - P.37, 41, 117.USA), которая содержит живые аттенуированные возбудители ИРТ, ВД, ПГ-3, РСВ, а также инактивированные лептоспиры 5 серотипов. Эта импортируемая в РФ вакцина также не содержит в своем составе антигенов парво- и реовирусов, столь широко распространенных по результатам серомониторинга в отношении парво-, реовирусной инфекций среди поголовья скота, особенно у животных, завезенных из стран Западной Европы.

Из приведенной информации следует, что в настоящее время отечественных аналогов вакцин, предназначенных для специфической профилактики вирусных респираторно-кишечных инфекций телят и вызываемых ими патологий репродуктивных органов маточного поголовья, изготовленных на основе антигенов парвовируса и реовируса крупного рогатого скота, не существует.

Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является «Вакцина комбинированная против инфекционного ринотрахеита, прагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезни телят» (Комбовак) производства НПО «Нарвак», представляющая собой композицию из шести штаммов вирусов, инактивированных формалином и сорбированных на 6%-ном геле гидроокиси алюминия (ГОА) и сапонина (Сергеев В.А., Непоклонов А.Е., Алипер Т.И., патент РФ на изобретение №2261111 от 08.04.2004). Общим недостатком этих известных вакцин против вирусных респираторно-кишечных инфекций телят и патологий репродуктивных органов взрослого поголовья скота является их низкая противоэпизоотическая эффективность, обусловленная тем, что штаммы респираторно-кишечных вирусов крупного рогатого скота, используемые для их изготовления, обладают узким антигенным спектром в отношении возбудителей, вызывающих патологии репродуктивных органов маточного поголовья. В составе «Вакцины инактивированной комбинированной против инфекционного ринотрахеита, прагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота-, коронавирусной болезни телят» («Комбовак») отсутствуют антигены парво- и реовирусов крупного рогатого скота. Зарубежные фирмы-производители биопрепаратов придают этим вирусам большое значение в этиологии респираторно-кишечных инфекций телят и в патологии репродуктивных органов маточного поголовья скота. Ими экспериментально подтверждена целесообразность использования их для изготовления вакцинных препаратов. В этой связи обратили внимание на недостаточно изученные вирусы - потенциальные возбудители болезней крупного рогатого скота, пригодные для включения в состав заявленного объекта.

Литературные данные свидетельствуют о том, что во многих странах мира производятся моно-, би- и поливалентные вакцины против ИРТ, ПГ-3, ВД-БС и РС-инфекции, парвовирусной и реовирусной инфекций и осуществляют активную иммунизацию телят по различным программам в зависимости от эпизоотической ситуации. Причем вакцинируют как маточное стадо, так и молодняк различного возраста.

1. Вакцины ассоциированные под названиями «Lactovac», содержащие инактивированный антиген штамма «Haden» парвовируса крупного рогатого скота типа I, «Bovigrip» и «Bovigrip plus», в состав которых включены инактивированные антигены реовирусов (штаммы «Lang» и «Dearing»), производит крупнейшая в мире немецкая компания «Hoecht Veterinär GmbH», успешно используются во многих странах Западной Европы: Франции, Германии, Англии, Югославии, Швеции, Бельгии, Дании и др. (Morzaria S.P., Richards M.S., Harkness J.W., Maund B.A. A field trial with a multicomponent inactivated respiratory viral vaccine / Veterinary Record. - 1979. - 105. - P.410-414; Soulebot J.P. Prophylaxie medicate des affections respiratoires des bovines d'origine virale (IBR, PL₃, reovirus, maladie des muqueuses)/ Rec. Med. veter. 1985. - 161, 12:1271-1275; Thomson J.R., Nettleton, P.P., Greig, A., Barr, J. A bovine respiratory virus vaccination trial / Veter. Rec. - 1986. - 119. - 18:450-453; Animal Health Products. - 1992. - P.37, 41, 117).

Прототипом - исходным образцом при создании новой вакцины, предлагаемого изобретения являлась «Вакцина против энзоотической бронхопневмонии и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, инактивированная для крупного рогатого скота», содержащая инактивированные антигены парагриппа-3 (штамм «SF-4»), аденовируса крупного рогатого скота 1-го (штамм «№10») и 3-го (штамм WBR-1) серотипов, вируса инфекционного ринотрахеита (штамм «Calw»), реовируса 1-го (штамм «Lang») и 3-го (штамм «Dearing») серотипов, репродуцированные в чувствительных биологических системах и подвергнутые инактивации формалином и ГОА-адъювантом в эффективном соотношении.

Вакцина-прототип имеет существенные недостатки:

- она не обеспечивает защиты животных против парвовирусной инфекции, вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота;

- в качестве инактиванта она содержит формалин, вызывающий деструктивные изменения вирусных белков и снижающий иммуногенную активность вакцины;

- она обладает недостаточной антигенной и иммуногенной активностью из-за использования при ее изготовлении неконцентрированных культуральных вирусных суспензий. В связи с этим проблема создания вакцины ассоциированной эмульсионной инактивированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, обладающей высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований по ее совершенствованию.

Необходимость разработки и производства этой вакцины обусловлена полиэтиологичностью структуры наблюдаемых форм патологий у телят различных возрастных групп и нарушений органов воспроизводства у коров и широкораспространенностью их в различных регионах РФ. Это подтверждено результатами исследований как зарубежных, так и отечественных ученых (табл.1).

Задачей настоящего изобретения является получение высокоиммуногенной вакцины ассоциированной инактивированной эмульсионной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек на основе производственных штаммов, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодных для изготовления ассоциированного эмульсионного инактивированного препарата, создающего эффективную защиту плода, новорожденных телят, молодняка периода доращивания и откорма, а также стельных коров и телок от указанных выше респираторно-кишечных вирусных инфекций и вызываемых ими патологий репродуктивных органов маточного поголовья, широко распространенных и постоянно циркулирующих в скотоводческих предприятиях Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала эффективных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин против вирусных инфекций крупного рогатого скота.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью, существенно отличающейся по комплексу вирусных антигенных компонентов от имеющихся средств профилактики, производимых в настоящее время в РФ, и широким спектром специфической защиты плода, новорожденных телят, молодняка периода доращивания и откорма, стельных коров и телок от инфицирования эпизоотическими (полевыми) штаммами парвовируса типа I, реовируса типа I, герпесвируса типа I и вируса ВД-БС, циркулирующих на территории Российской Федерации.

Предлагаемая вакцина содержит активное биологическое вещество в виде авирулентных очищенных и концентрированных антигенов штаммов «Parvo 32459» парвовируса типа I крупного рогатого скота, идентичного штамму «Haden» в РВН и РТГА, штамма «Reo I - Lang» реовируса типа I, штамма «Nadl» вируса ВД-БС и штамма «ТК-А-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа I, полученных в культурах клеток млекопитающих и целевых добавок в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении. Первые три штамма вирусов получены из Центральной ветеринарной лаборатории МСХ Великобритании. Изучены их иммунобиологические свойства, и штаммы депонированы в лаборатории по хранению и изучению штаммов особо опасных болезней животных (музей штаммов), используемых в ветеринарии и животноводстве Федерального государственного учреждения «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» МСХ РФ (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»). Штамм «ТК-А-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа I депонирован в коллекции ФГУ «ВГНКИ».

Сущность изобретения заключается в следующем: «Ассоциированная вакцина против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» содержит концентрированные антигены парво-, рео-, герпесвирусов и вируса ВД-БС крупного рогатого скота, эмульгированные в масляном адъюванте, при следующем соотношении компонентов, мас.%: 1:1:1:1 (инактивированная 1.2-аминоэтилазиридином).

Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия парвовируса типа I крупного рогатого скота шт. «Parvo 32459-ДЕП», полученная в первичной культуре клеток почек эмбриона коровы «ПЭК» с инфекционным титром не менее 6,0-6,5 log₂ ТЦД₅₀/см³ и активностью в РГА не менее 11 log₂ (1:2048) 12,5-14,5 мас.%.

Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия реовируса типа I штамм «Reo I - Lang-ДЕП», полученная в перевиваемых культурах клеток «Vero» и (или) ПТ-80, МДВК с инфекционным титром не менее 6,0-6,5 log₂ ТЦД₅₀/см³ и активностью в РГА не менее 10 log₂ (1:1024) 12,5-14,5 мас.%.

Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия герпесвируса типа I (ИРТ) крупного рогатого скота штамм «ТК-А-ВИЭВ-В2-ДЕП», полученная в перевиваемой культуре клеток «MDBK» с инфекционным титром не менее 6,5-7,1 log₂ ТЦД₅₀/см³ 12,5-14,5 мас.%.

Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия вируса ВД-БС крупного рогатого скота штамм «Nadl-ДЕП», полученная в перевиваемой культуре клеток «MDBK» с инфекционным титром не менее 6,0-6,5 log₂ ТЦД₅₀/см³ 12,5-14,5.

Целевая добавка - адъювант - до 100,0.

Штаммы вирусов, используемых в качестве производственных, характеризуются следующими признаками и свойствами:

- штамм «Parvo 32459-ДЕП» парвовируса типа I крупного рогатого скота выделен из фекалий павшего 3-месячного теленка с признаками энтерита, идентичен референтному штамму «Haden»-вируса в реакции нейтрализации и в РТГА. Наиболее характерным свойством этого штамма парвовируса крупного рогатого скота является способность стабильно агглютинировать эритроциты морской свинки, человека 0-группы. Патогенен для телят, способен проникать в ткани различных отделов кишечника и прилегающих лимфатических узлов, а также преодолевать плацентарный барьер, вызывая гибель эмбриона, обусловливая аборты у коров, и длительно персистировать в организме коровы. Штамм «Parvo 32459-ДЕП» парвовируса типа I крупного рогатого скота устойчив во внешней среде. Репродукция вируса происходит наиболее активно в делящихся клетках.

Штамм «Parvo 32459-ДЕП» принадлежит парвовирусу крупного рогатого скота типа I, относится к семейству Parvoviridae, роду Parvovirus, ДНК-содержащий, был выделен в Великобритании (1975) из фекалий павшего 3-месячного теленка с признаками энтерита, идентичен референтному штамму «Haden»-вируса в реакции нейтрализации и в РТГА (цит. по Крюкову Н.Н. с соавт., 1988). Наиболее характерным свойством этого штамма парвовируса крупного рогатого скота является способность стабильно агглютинировать эритроциты морской свинки и человека 0-группы. Патогенен для телят, способен проникать в ткани различных отделов кишечника и прилегающих лимфатических узлов, а также преодолевать плацентарный барьер, вызывая гибель эмбриона, обусловливая аборты у коров, и длительно персистировать в организме коровы. Репродукция вируса происходит наиболее активно в делящихся клетках. Штамм «Parvo 32459-ДЕП» парвовируса типа I крупного рогатого скота устойчив к изменению рН от 3 до 8, эфиру, хлороформу и 1%-ному трипсину, а прогревание при 70°С в течение 2-х часов снижает инфекционную активность в 100 раз, термостабилен при 37 и 56°С.

- Штамм «Reo I - Lang-ДЕП» первого типа относится к роду Reovirus, семейству Reoviridae, геном которых состоит из нескольких фрагментов двухцепочечной РНК. В названии «реовирусы» (reo-respipatory enteric orphan viruses) отражена связь между дыхательными путями и кишечным трактом. Реовирусы млекопитающих классифицированы в три серологических типа на основании РВН и РТГА. Все три серотипа реовирусов имеют общегрупповой комплементсвязывающий антиген. Реовирусы, выделенные от человека и животных, не отличаются друг от друга и способны поражать клетки эпителия слизистой оболочки дыхательных путей и пищеварительного аппарата.

Вирионы Reovirus - сферические частицы диаметром 75-80 нм, имеют четкую двухкапсидную структуру. В препаратах реовирусов, наряду с полными частицами, обнаруживаются пустые чехлы, что является результатом отсутствия вирусной нуклеиновой кислоты.

Реовирусы обладают выраженной устойчивостью к воздействию температурного фактора. Например, реовирус типа I при 36,7°С снижал инфекционный титр на 2 lg в течение 3-х недель и при 56°С - в течение 30 минут. На холоде пробы могут сохраняться при -20°С от 8-10 мес до 2-х лет. При 4°С вирус сохранят свои инфекционные свойства в течение 2 месяцев. Они переносят широкий спектр рН (от 2,2 до 8), но полностью инактивируются 70% этиловым спиртом или 3% формалином при 56°С в течение 30 минут.

У крупного рогатого скота можно вызвать заболевание при интраназальном заражении каждым из трех серотипов реовируса человека. Экспериментально зараженные телята передают инфекцию здоровым животным при контакте.

- Штамм «ТK-А-(ВИЭВ)-В2-ДЕП» герпесвируса типа I семейства Herpesviridae представляет собой однородную популяцию ДНК-содержащего вируса, получен путем воздействия ультрафиолетовыми лучами на исходный вирулентный вирус ИРТ в дозе, близкой к пороговой. Вакцинный штамм «ТK-А-(ВИЭВ)-В2-ДЕП» обладает высокими иммуногенными свойствами и определен нами в качестве производственного для изготовления ассоциированной вакцины.

Герпесвирус типа I (ИРТ) репродуцируется в монослое клеток почки эмбриона коровы, и его цитопатогенное действие наступает через 48-96 часов. Вирус, выращенный в монослое перевиваемых линий клеток почек эмбриона коровы (МДВК), обладает стабильной активностью и достигает 6,75-7,25 log₂ ТЦД₅₀/см³. Репродукция вируса сопровождается подавлением митотической активности клеток и образованием внутриядерных включений.

- Штамм «Nadl-ДЕП» вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек является представителем рода Pestivirus семейства Flaviviridae, выделен при вспышках респираторных поражений крупного рогатого скота наряду с другими референтными штаммами «Oregon», «Singer», «Osloss», относится к 1-й подгруппе цитопатогенных штаммов. Адаптирован перевиваемыми линиями культуры клеток почки теленка (МДВК), и при этом инфекционный титр составлял 6,5 lg ТЦД₅₀/см³. Наиболее технологичными и высокопродуктивными считают перевиваемые культуры клеток почки сайгака и Таурус-2. В этих клетках за 96-120 часов вирус накапливается на уровне 6,5-6,7 lg ТЦД₅₀/см³ и 6,8-7,0 lg ТЦД₅₀/см³, соответственно (Левченко С.В. Изучение иммунобиологических свойств возбудителя вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, используемого для изготовления инактивированных вакцин: Автореф. дис. канд. биол. наук. - Владимир, 2008. - 25 с.).

При заражении коров штаммом «Nadl-ДЕП» вируса ВД-БС наблюдают раннюю смертность эмбрионов, аборты, мертворождения, недоразвитость плодов, малую массу родившихся телят, наличие у них вирусной персистенции и иммунологической толерантности.

Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину; при изменении рН среды от 5,7 и 9,3 инфекционность его снижается, наиболее устойчив при рН 7,4. Хорошо сохраняется в нативном виде без добавления стабилизирующих растворов при 4, -20, -40°С и в лиофилизированном состоянии, восстанавливая заданные характеристики.

Штаммы вирусов, принятые заявителем в качестве производственных, обладают высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, отличаются высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах культивирования. Они свободны от контаминации бактериями, грибковой микрофлорой, микоплазмами и вирусами. Экспериментально в лабораторных условиях и производственных опытах подтверждена возможность их использования для изготовления вакцины ассоциированной, создающей напряженный и продолжительный иммунитет у вакцинированных животных.

2. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа (ассоциированные вакцины «Lactovac», содержащие инактивированный антиген штамма «Haden» парвовируса крупного рогатого скота, «Bovigrip», «Bovigrip plus», в состав которых включены инактивированные антигены реовирусов штаммы «Lang-I» и «Dearing-2», производства «Hoecht Veterinär GmbH» (Animal Health Products. - 1992. - P.37, 41, 117)) как наиболее близкого по совокупности признаков по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности «Новизна».

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения.

Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания, а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая ассоциированная вакцина соответствует условию патентоспособности «Изобретательский уровень».

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1

Антигенный материал из штамма «Parvo 32459-ДЕП» парвовируса типа I крупного рогатого скота для изготовления предлагаемой вакцины готовят из матрового вируса, выращенного на монослое первичной культуры клеток почек эмбриона коровы (ПЭК), на комбинированной среде, и проявляющего инфекционную активность в культуре клеток ПЭК не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и ГА-активность не менее 1:2048 ГАЕ. Для получения антигенного материала используют выращенную в матрасах культуру клеток ПЭК 3-суточного возраста с посевной концентрацией клеток 140-150 тыс. клеток на 1 мл среды. Для получения 10 литров суспензии парвовируса берут 55-60 матрасов с культурой клеток емкостью 1,5 дм³ каждый.

Ростовую среду, состоящую из среды ГЛА - 80%, среды 199 - 10%, эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков, сливают и вносят по 3-5 см³ парвовируса матровой расплодки. После 40-60 минут инкубирования при температуре (37±2)°С в матрасы вносят по 150-200 см³ поддерживающей среды (ГЛА - 90%, среды 199 - 10%, антибиотики). Зараженные матрасы помещают в термостат для культивирования при температуре (37±2)°С. Срок культивирования от 72 до 96 часов. В качестве контроля оставляют 3 незараженных матраса, в которых ростовую среду меняют на 200 см³ поддерживающей среды без сыворотки. Инфицированные и контрольные матрасы ежесуточно микроскопируют. Матрасы, в которых наблюдаются цитопатические изменения с поражением, более 80-90% клеток, отбирают, трехкратно замораживают при температуре 20°С и оттаивают. Затем вируссодержащий материал очищают от клеточного детрита путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 минут, соблюдая стерильные условия.

Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации 1.2-аминоэтилазиридином. Для этого аминоэтилазиридин разводят буфером до 5% концентрации, доводят рН до 8,2-8,4 ледяной уксусной кислотой (рабочий раствор) и вносят в вирусную суспензию при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,1%. Инактивацию ведут в термостате при температуре (37±2)°С в течение 24 ч с периодическим перемешиванием.

Концентрирование парвовирусной суспензии проводят с помощью ПЭГ-600 до конечной концентрации 7% (вес/объем) и NaCl до 0,3 М в течение 16-18 ч при 4°С. Осадок собирают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 60 минут и ресуспендируют. Парвовирусный антиген стандартизируют путем количественного определения специфического белка на спектрофотометре. Концентрация белка должна составлять в пределах 1,8-2 мг/см³. Концентрированный антигенный материал проверяют на стерильность, авирулентность и ГА-активность.

Пример 2

Антигенный материал из штамма «Reo I Lang-ДЕП» реовируса типа I для изготовления предлагаемой вакцины готовят из матрового вируса, выращенного в перевиваемых культурах клеток «Vero» и (или) «ПТ-80» и «МДВК» 3-суточного возраста с концентрацией клеток 120-140 тыс. кл/см³. Матровый вирус считается пригодным для наработки вирусного сырья, если он соответствует следующим требованиям: титр инфекционности после репродукции в монослое клеток «Vero» и (или) «ПТ-80» и «МДВК» 6,0 lg ТЦД₅₀/см³, ГА-активность не менее 1:64, рН 7,2-7,4 и при отсутствии контаминации.

Для изготовления 10 литров культурального производственного реовируса берут 55-60 матрасов с культурой клеток емкостью 1,5 дм³ каждый. После слива ростовой среды в матрасы вносят по 5 см³ вируссодержащего материала матровой расплодки. Адсорбцию вируса проводят при 37°С в течение часа. После этого в матрасы вносят поддерживающую среду (Игла MEM 40%, среду ГЛА 60%, трипсин 20 мкг/см³, антибиотики) в объеме 150-200 см³.

Культивирование ведут при 37°С в течение 4-5 суток. Для контроля незараженными оставляют 3 матраса, в которых не должно быть каких-либо деструктивных изменений в период культивирования. Зараженные матрасы с 80-90% поражением клеточного монослоя отбирают, трехкратно замораживают при -20°С и оттаивают.

Клеточный детрит осаждают ц