Способ и тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов

Способ и тест-система определения циркулирующих иммунных комплексов

Реферат

Изобретение относится к клинической иммунологии, и может быть использовано для определения содержания циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови человека.

Проблема определения уровня ЦИК в сыворотке крови человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что в лабораторной диагностике отсутствуют доступные, точные тест-системы для рутинных исследований, которые абсолютно необходимы для ранней диагностики аутоиммунных заболеваний на доклинической стадии.

Известен способ определения ЦИК в сыворотке крови преципитацией их 3,5% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ)-6000. Изменение мутности раствора регистрируют спектрофотометрически. Считается, что 3,5% ПЭГ-6000 флокулирует наиболее распространенные «промежуточные» иммунные комплексы [1].

Недостатком этого способа являются преципитация липопротеинов низкой и очень низкой плотности вместе с ЦИК, противоречивость результатов при тяжелых аутоиммунных заболеваниях, недостаточная точность.

Задачей изобретения является разработка способа и тест-системы определения уровня ЦИК для рутинных исследований с высокой точностью.

Эта задача решается тем, что специфическую преципитацию ЦИК сыворотки крови человека проводят путем обработки ее буферным раствором, содержащим ПЭГ-3350, инкубируют при комнатной температуре, преципитат осаждают центрифугированием, отмывают, растворяют в буфере и определяют содержание ЦИК либо спетрофотометрически при длинах волн 280 нм и 260 нм, рассчитывают по известной формуле, либо по методу Лоури. При уровне содержания ЦИК свыше 1,0 мг/мл констатируют повышенный уровень.

Тест-система содержит следующее:

1. Буфер для преципитации ЦИК, 10% полиэтиленгликоль с молекулярной массой 3350 в 0,01М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl;

2. Буфер для растворения преципитата ЦИК, 0,01М Трис-HCl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.

3. Калибровочный раствор, сывороточный альбумин человека с концентрацией 6 г/л в 0,01 М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl.

Способ определения циркулирующих иммунных комплексов осуществляют следующим образом. Проводят забор крови натощак, готовят сыворотку и определяют уровень циркулирующих иммунных комплексов путем обработки сыворотки крови буфером для преципитации ЦИК в соотношении 1:1, инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин, осаждения преципитата центрифугированием, отмывки, растворения в буфере для растворения преципитата ЦИК, уровень ЦИК определяют либо по оптической плотности при длинах волн 280 нм и 260 нм, либо по методу Лоури, и при содержании ЦИК свыше 1,0 мг/мл констатируют повышенный уровень.

Комплементсвязывающую способность ПЭГ-преципитата исследовали с помощью гемолитических тестов с использованием комплемента морской свинки, эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл), сенсибилизированных кроличьими антителами (ЕА), в вероналовом солевом буфере, содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15 мМ CaCl₂ (VBS²⁺). Уровень содержания комплементсвязывающих ЦИК определяли по калибровочному графику, как описано в работе [2].

Этап 1. Определение оптимальной концентрации ПЭГ-3350 для осаждения иммунных комплексов из пулированной сыворотки крови здоровых доноров.

1.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при различных концентрациях ПЭГ-3350. К 50 мкл пулированной сыворотки крови здоровых доноров добавляли от 25 до 200 мкл буфера, содержащего 10% ПЭГ (молекуляная масса 3350), тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, и осадок 2 раза отмывали буфером, содержащим 5% ПЭГ-3350. Осадок растворяли в исходном объеме 0,01 М трис-HCl-буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4.

1.2. Определение холестерина, триглицеридов и общих белков в ПЭГ-преципитатах, приготовленных при разных концентрациях ПЭГ-3350. В ПЭГ-преципитатах после двукратной отмывки и растворения в 50 мкл буфера определяли содержание холестерина, триглицеридов, общего белка с использованием наборов реагентов фирмы «Диакон-ДС» (Россия), а также содержание белка определяли в ПЭГ-преципитате спектрофотометрически при длинах волн 280 нм и 260 нм и рассчитывали по формуле: Концентрация белка (мг/мл)=1,55A₂₈₀-0,76А₂₆₀. Общий белок в ПЭГ-преципитате представляет собой циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), включающие как комплементсвязывающие, так и не связывающие иммунные комплексы. Полученные результаты представлены в таблице 1.

1.3. Определение комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК-1) в ПЭГ-преципитатах. К 10 мкл растворов ПЭГ-преципитатов, разбавленных в соотношении 1:99 буфером VBS²⁺, полученных при различных концентрациях ПЭГ 3350, добавляли 20 мкл раствора разбавленного 1:19 комплемента морской свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS²⁺и инкубировали 20 мин при 37°С. После предварительной инкубации добавляли 200 мкл ЕА и повторно инкубировали 30 мин при 37°С. После 30-минутной инкубации реакцию останавливали добавлением 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглобина в супернатант. Контрольная проба не содержала ПЭГ-преципитата. Пониженный гемолиз в опытных пробах по сравнению с контролем свидетельствовал о наличии связывания комплемента. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:

У(%)=[(X-R)/(H-R)×l00],

где Н, R и Х - величины оптической плотности А₄₁₂ в гемолитических системах контрольной пробы, в контроле спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе, соответственно. Степень связывания комплемента (ССК) определяли по формуле:

ССК(%)=100-У. Содержание ЦИК-1 в ПЭГ-преципитатах определены по калибровочному графику, как описано в работе [2], и представлены в таблице 1.

1.4. Определение ЦИК, не связывающих комплемент (ЦИК-2). ЦИК-2 рассчитывали как разность между общим белком ПЭГ-преципитата (ЦИК) и ЦИК-1. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что при концентрации ПЭГ-3350 до 5,0% в системе не наблюдается агрегация и преципитация липопротеинов низкой (ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП). Показателями преципитации ЛПНП и ЛПОНП являются содержание холестерина и триглицеридов в ПЭГ-преципитате. Дальнейшее увеличение концентрации ПЭГ выше 5% в системе приводит к преципитации нативных ЛПНП и ЛПОНП.

Таким образом, при концентрации 5% ПЭГ-3350 из пулированной сыворотки контрольных доноров наблюдается избирательная преципитация циркулирующих иммунных комплексов и не наблюдается агрегация и преципитация нативных липопротеинов низкой плотности.

Этап 2. Определение оптимальной концентрации ПЭГ-3350 для осаждения иммунных комплексов из пулированной сыворотки крови больных ИБС.

2.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при различных концентрациях ПЭГ-3350. К 50 мкл пулированной сыворотки крови больных ИБС добавляли от 25 до 200 мкл раствора 10% ПЭГ (молекуляная масса 3350), тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, и осадок 2 раза отмывали раствором ПЭГ-3350 с соответствующей концентрацией, при которой преципитат был получен. Осадок растворяли в исходном объеме 0,01 М трис-HCl-буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4.

2.2. Определение холестерина, триглицеридов и общих белков в ПЭГ-преципитатах, приготовленных при разных концентрациях ПЭГ-3350 проводили, как описано выше. Результаты представлены в таблице 2.

2.3. Определение комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК-1) в ПЭГ-преципитатах из пулированной сыворотки больных ИБС проводили, как описано выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.

2.4. Определение ЦИК, не связывающих комплемент (ЦИК-2). ЦИК-2 рассчитывали как разность между общим белком ПЭГ-преципитата (ЦИК) и ЦИК-1. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Из пулированной сыворотки больных ИБС при концентрации 5% ПЭГ-3350 начинают преципитировать модифицированные липопротеины плотности, обладающие комплементсвязывающими свойствами. Увеличение концентрации ПЭГ-3350 выше 5% приводит к преципитации нативных липопротеинов. Об этом свидетельствует стабильный уровень ЦИК при возрастании уровня холестерина и триглицеридов в преципитате. При концентрации 5% ПЭГ-3350 в системе эффективно также преципитируют циркулирующие иммунные комплексы, причем преимущественно не связывающие систему комплемента.

Таким образом, при концентрации 5% ПЭГ-3350 из пулированной сыворотки больных ИБС наблюдается избирательная преципитация циркулирующих иммунных комплексов и не наблюдается агрегация и преципитация нативных липопротеинов низкой и очень низкой плотности.

Этап 3. Определение содержания циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови доноров и больных ишемической болезнью сердца.

3.1. Приготовление преципитата сыворотки крови при условиях 5% ПЭГ-3350. К 50 мкл сыворотки крови больных ИБС и доноров добавляли 50 мкл буфера, содержащего 10% ПЭГ (молекуляная масса 3350) в 0,01М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15М NaCl, тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, и осадок 2 раза отмывали буфером, содержащим 5% ПЭГ-3350. Осадок растворяли в исходном объеме 0,01 М трис-HCl-буфера, содержащего 0,15 М NaCl, рН 7,4.

3.2. Определение циркулирующих иммунных комплексов (общих белков) в 5% ПЭГ-преципитатах, приготовленных из сыворотки 15 больных ИБС и 15 здоровых доноров. В ПЭГ-преципитатах после двукратной отмывки и растворения в 50 мкл буфера определяли содержание общего белка с использованием набора «Общий белок» фирмы «Эколаб» (Россия), а также белок определяли в ПЭГ-преципитате спектрофотометрически при длинах волн 280 нм и 260 нм и рассчитывали по формуле. Общий белок в ПЭГ-преципитате представляет собой циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), включающие как комплементсвязывающие, так и не связывающие иммунные комплексы. Полученные результаты представлены в таблице 3.

3.3. Определение комплементсвязывающих циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК-1) в ПЭГ-преципитатах. Комплементсвязывающие циркулирующие иммунные комплексы определяли в тесте связывания комплемента, как описано выше. Данные содержания ЦИК-1 представлены в таблице 3.

3.4. Определение ЦИК, не связывающих комплемент (ЦИК-2). ЦИК-2 рассчитывали как разность между общим белком ПЭГ-преципитата (ЦИК) и ЦИК-1. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, в группе доноров средний уровень ЦИК составил 0,80±0,12 (0,72±0,13) мг/мл, колебания составили от 0,53 до 1,04 мг/мл. Средний уровень ЦИК у больных ИБС равнялся 2,13±0,68 (2,14±0,76) мг/мл, колебания составили от 1,4 до 3,54 мг/мл.

Таким образом, способ позволяет повысить точность количественного определения циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови. Доступность реагентов и простота теста определения ЦИК в лабораторной практике позволит проводить углубленное исследование патогенеза хронических заболеваний, сопровождающихся накоплением ЦИК в органах и тканях, что приводит к системной и органной патологии. С другой стороны, реализация изобретения позволит контролировать эффективность проводимого лечения и выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов, аутоиммунных и опухолевых процессов.

Литература

1. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник / Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др./ Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987 - 368 с.

2. Шойбонов Б.Б., Борголов В.М., Сониев В.М., Зинченко А.А., Федоров А.А., Петрова В.Д., Буянова С.Н. Способ определения циркулирующих иммунных комплексов // Патент РФ №2343484 от 10.01.2009 г.

Таблица 1
Содержание холестерина, ТАГ, ЦИК, ЦИК-1 и ЦИК-2 в ПЭГ-преципитатах пулированной сыворотки крови доноров в зависимости от концентрации ПЭГ-3350
Концентрация ПЭГ-3350, %	3,3	5,0	6,0	6,7	7,1	7,5	8,0
Холестерин, мг/дл	0	0	3	6	21	42	60
ТАГ, мг/дл	0	0	6	15	31	52	76
ЦИК, мг/мл	0,3	0,5	2,0	4,0	5,0	6,0	8,0
ЦИК-1, мг/мл	0,13	0,36	1,23	3,52	3,86	3,86	3,89
ЦИК-2, мг/мл	0,17	0,14	0,77	0,48	1,14	2,14	4,11

Таблица 2
Содержание холестерина, ТАГ, ЦИК, ЦИК-1 и ЦИК-2 в ПЭГ-преципитатах пулированной сыворотки крови больных ИБС в зависимости от концентрации ПЭГ-3350
Концентрация ПЭГ-3350, %	3,3	5,0	6,0	6,7	7,1	7,5	8,0
Холестерин, мг/дл	0	13,7	30,7	49,9	73,0	98,8	133,9
ТАГ, мг/дл	0	31,2	46,1	52,8	67,0	76,6	87,0
ЦИК, мг/мл	2,5	3,2	10,6	12,2	12,6	12,9	12,9
ЦИК-1, мг/мл	0,13	2,15	3,69	3,73	3,82	2,92	3,0
ЦИК-2, мг/мл	1,37	1,05	6,91	8,47	8,78	9,98	9,9

Таблица 3
Содержания циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови доноров и больных ИБС
Доноры	ЦИК (Биуретовый метод). мг/мл	ЦИК A280/260. мг/мл	ЦИК-1, мг/мл	ЦИК-2, мг/мл	Больные ИБС	ЦИК (Биуретовый метод), мг/мл	ЦИК A280/260. мг/мл	ЦИК-1, мг/мл	ЦИК-2, мг/мл
1	0,66	0,704	0,2	0,504	1	2,28	2,12	1,5	0,62
2	0,83	0,704	0,21	0,493	2	1,58	2,01	1,24	0,77
3	0,83	0,825	0,13	0,695	3	1,58	2,0	1,62	0,38
4	1,04	0,887	0,19	0,697	4	1,4	1,12	0,99	0,13
5	0,91	0823	0,12	0,603	5	1,87	1,85	1,62	0,23
6	0,75	0,704	0,22	0,484	6	3,54	2,38	1,58	0,80
7	0,75	0,529	0,14	0,389	7	1,83	1,95	1,65	0,30
8	0,91	0,882	0,46	0,422	8	2,52	2,77	1,80	0,97
9	0,79	0,707	0,10	0,607	9	1,91	1,65	1,44	0,21
10	0,87	0,88	0,54	0,34	10	2,96	3,37	2,53	0,74
11	0,87	0,709	0,17	0,539	11	1,83	1,59	1,57	0,02
12	0,72	0,7	0,24	0,46	12	1,83	2,01	1,62	0,39
13	0,53	0,42	0,12	0,30	13	1,5	1,24	1,04	0,20
14	0,72	0,65	0,1	0,55	14	3,45	4,03	3,80	0,23
15	0,80	0,68	0,11	0,57	15	1,91	1,96	1,42	0,54
M±m	0.8±0.12	0,72±0,13	0,2±0,13	0,51±0,12	M±m	2.13±0,68	2,14±0,76	1,69±0,68	0.44±0,29

1. Способ определения уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), включающий приготовление преципитата из сыворотки крови человека в растворе полиэтиленгликоля, его центрифугирование, растворение, определение общего уровня ЦИК либо по оптической плотности при длинах волн 280 нм и 260 нм, либо по методу Лоури, определение ЦИК, связывающих комплемент, отличающийся тем, что преципитат готовят путем обработки сыворотки крови буфером для преципитации ЦИК, содержащим 10%-ный раствор ПЭГ 3350, в соотношении 1:1, инкубируя сыворотку в течение 10 мин при комнатной температуре, а также рассчитывают ЦИК, не связывающие комплемент, как разность между общим уровнем ЦИК и ЦИКом, связывающим комплемент.

2. Тест-система для определения уровня ЦИК в сыворотке крови человека, включающая буфер для преципитации ЦИК, представляющий собой 10%-ный ПЭГ 3350 в 0,01 М Трис-НСl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl; буфер для растворения преципитата ЦИК, представляющий собой 0,01М Трис-НСl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl; и калибровочный раствор, содержащий сывороточный альбумин человека в концентрации и 6 г/л в 0,01М Трис-НСl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl.