Высокая частота введения нейротоксического компонента ботулотоксина

Высокая частота введения нейротоксического компонента ботулотоксина

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к способам лечения заболеваний и расстройств введением композиции, содержащей нейротоксический компонент токсинового комплекса Clostridium botulinum, где композиция лишена любого другого белка токсинового комплекса Clostridium botulinum, и где композицию вводят через короткие интервалы и/или в больших дозах.

В частности, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, вызванного или связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез пациента, способ, включающий введение композиции, включающей эффективное количество нейротоксического компонента токсинового комплекса Clostridium botulinum, композиции, лишенной любого другого белкового компонента токсинового комплекса Clostridium botulinum, где (a) пациент является человеком, (b) композицию вводят инъекцией, и (c) композицию вводят в интервале менее трех месяцев, интервал, включающий первую терапию и вторую терапию, где количество, введенное при второй терапии, может быть ниже, выше или идентично количеству, введенному при первой терапии. Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболевания или состояния, вызванного или связанного с патологической активностью мышцы пациента, способ, включающий введение композиции, включающей эффективное количество нейротоксического компонента токсинового комплекса Clostridium botulinum, композиции, лишенной любого другого белкового компонента токсинового комплекса Clostridium botulinum, в котором (a) пациент является человеком с тяжелым нарушением движения или тяжелой мышечной спастичностью; (b) композицию вводят инъекцией; и (c) эффективное вводимое количество превышает 500 Ед нейротоксического компонента у взрослых или превышает 15 Ед/кг массы тела у детей. Наконец, настоящее изобретение относится к способу сокращения складок или морщин или устранения асимметрии лица, способ, включающий введение субъекту композиции, включающей эффективное количество нейротоксического компонента токсинового комплекса Clostridium botulinum, композиции, лишенной любого другого белкового компонента токсинового комплекса Clostridium botulinum, где (a) субъект является человеком; (b) композицию вводят в виде подкожной или внутримышечной инъекции в, или рядом, одну или более мимических мышц или мышц, вовлеченных в образование морщин или асимметрии; и (c) композицию вводят в интервале менее чем три месяца, интервал, включающий первую терапию и вторую терапию, где количество, введенное при второй терапии, может быть ниже, выше или идентично количеству, введенному при первой терапии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ботулотоксин производится бактерией Clostridium. Есть семь антигенно-различных серотипов ботулотоксина, а именно, ботулотоксин А, В, C, D, E, F и G. Ботулотоксины при выделении из лизированных культур Clostridium в целом ассоциируются с другими бактериальными белками, которые вместе образуют токсиновый комплекс. Нейротоксическая подгруппа этого комплекса упомянута здесь как "нейротоксический компонент" комплекса ботулотоксина. Термины "ботулотоксин" или "ботулотоксины" относится к нейротоксическому компоненту, лишенному любых других клостридийных белков, но также и к "комплексу ботулотоксина": это используется в случаях, когда отсутствие дискриминации между двумя состояниями нейротоксического компонента необходимо или желательно. Этот комплекс обычно содержит дополнительные, так называемые "нетоксичные" белки, которые заявители называют "комплексообразующими белками" или "бактериальными белками". Комплекс нейротоксических составляющих и бактериальных белков упоминается как «токсиновый комплекс Clostridium botulinum» или «комплекс ботулотоксина». Молекулярная масса этого комплекса может изменяться от приблизительно 300000 до приблизительно 900000 Да. Комплексообразующими белками являются, например, различные гемагглютинины. Белки этого токсинового комплекса непосредственно не токсичны, но обеспечивают стабильность нейротоксическому компоненту и ответственны за оральную токсичность при ботулиновых интоксикациях. В отличие от токсинового комплекса, нейротоксический компонент в его выделенной и чистой форме, то есть лишенный любых комплексообразующих клостридийных белков, является неустойчивой кислотой и не сопротивляется агрессивной среде в желудочно-кишечном тракте.

Нейротоксичный ботулиновый компонент токсинового комплекса ботулизма первоначально образован как одиночная полипептидная цепь, имеющая, в зависимости от серотипа A, молекулярную массу приблизительно 150 кДа. В других серотипах нейротоксический компонент, как наблюдали, изменялся приблизительно между 145 и приблизительно 170 кДа, в зависимости от бактериального источника. В случае серотипа A, например, в результате протеолитической обработки полипептида образуется активированный полипептид в форме двойной полипептидной цепи, состоящей из тяжелой цепи и легкой цепи, которые связаны дисульфидным мостиком. У людей тяжелая цепь обуславливает закрепление с пресинаптическими холинергическими нервными окончаниями и поглощение клеткой токсина. Легкая цепь, как полагают, ответственна за токсические эффекты, действуя как цинк-эндопептидаза и расщепляя определенные белки, ответственные за мембранное слияние (SNARE комплекс) (см. например, Montecucco C., Shiavo G., Rosetto O: The mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins. Arch Toxicol. 1996; 18 (Suppl.): 342-354)). Нарушая процесс мембранного слияния в пределах клеток, ботулотоксины предотвращают высвобождение ацетилхолина в синаптической щели. Полный эффект ботулотоксина в нервно-мышечной передаче должен прервать нервно-мышечную передачу и в действительности денервировать мышцы. У ботулотоксина также имеется активность в других периферических холинергических синапсах, вызывающая уменьшение слюноотделения или потоотделения.

Каждый серотип ботулинового токсина связан с серотипом определенным клеточным рецептором на пресинаптическом нервном окончании. Специфичность ботулотоксина для холинергических нейронов основана на высоком сродстве тяжелой цепи к клеточным рецепторам этих нервных окончаний (Ссылка: Katsekas S., Gremminlon G., Pich E.V.: Nerve terminal proteins; to fuse to leam. Transneuro Science; 1994; 17: 368-379).

Несмотря на его токсические эффекты, комплекс ботулинового токсина использовали как терапевтическое средство для лечения большого количества заболеваний. Применение у людей серотипа А ботулинового токсина одобрили в Соединенных Штатах в 1989 г. для лечения страбизма, блефароспазма и других нарушений. Это коммерчески доступно в виде белкового комплекса ботулинового токсина A, например, под торговым наименованием BOTOX (Allergan Inc) или под торговым наименованием DYSPORT (Ipsen Ltd). Для терапевтического применения комплекс вводили непосредственно в мышцу, которую следует лечить. При физиологическом рН токсин высвобождается из белкового комплекса, что дает желательный фармакологический эффект. Действие ботулотоксина только временное, по этой причине может потребоваться повторное введение ботулотоксина для поддержания терапевтического эффекта. Во многих случаях устойчивость к ботулотоксину наблюдалась после повторного введения комплекса белка ботулотоксина. У пациентов развивались соответствующие уровни нейтрализующих антител, направленных против нейротоксического компонента и блокирования его активности (Göschel H, Wohlfarth K, Frevert J, Dengler R, Bigalke H. (1997) Exp Neurol. 1997 Sep; 147(1):96-102). В результате терапия комплексом ботулотоксина становилась не эффективной для упомянутых пациентов (использующих, например, Botox или Dysport). Последующее применение препаратов ботулотоксина, таких как Botox или Dysport, неэффективно. Титр антител может снизиться, если лечение комплексами белка ботулотоксина приостановлено. Однако период времени, в течение которого должно быть приостановлено лечение, может быть продолжительным (см., например, Dressier D, Bigalke H (2002) Botulinum toxin antibody titres after cessation of botulinum toxin therapy. Mov Disord 17:170-173).

Первоначально устойчивость к комплексу ботулотоксина считали редкой. Последующие сообщения позволили предположить частоту приблизительно 5% неэффективности лечения, вызванного антителами при терапии ботулотоксином пациентов при лечении цервикальной дистонии (Ссылка: Kessler KR, Skutta M, Benecke R., Long-term treatment of cervical dystonia with botulinum toxin A: efficacy, safety, and antibody frequency. German Dystonia Study Group. J Neurol. 1999 Apr; 246(4):265-74). Это наблюдение было основано на ретроспективных исследованиях пациентов в единственном месте. Недавно, однако, сообщили о намного большей частоте случаев, предполагая, что это приблизительно 20% пролеченных субъектов, которых это затронуло (Ссылка: The Muscular Nerve May 2004, p. 630). Вообще, полагают, что риск вызванного антителами неблагоприятного исхода терапии убедительно коррелирует с введенной единственной дозой ботулотоксина.

Полагают, что белки, содержащиеся в комплексе, могут усиливать иммунный ответ. Другим фактором риска вызванного антителами неблагоприятного исхода терапии ботулотоксином является интервал между инъекциями, то есть интервал между последующей серией инъекций. Поэтому общей практикой является введение ботулотоксина только раз в три месяца, чтобы снизить риск образования антител. Пациентов, у которых эффект введения ботулина заканчивается раньше, можно лечить пероральными формами лекарственных средств. Эффективность таких пероральных лекарственных средств, однако, ограничена.

Другой неблагоприятный эффект комплексов белка ботулотоксина - его местное или системное распространение после инъекций в мышцы-мишени. Электромиография каждого отдельного волокна (SF-EMG) показала увеличение колебаний в мышцах, удаленных от места инъекции. Например (Alny et al., 1988 (Alny R.K., Aminoff M.J., Gelb D.J., Löwenstein D.H.: Myomuscular effects distant from the site of botulinum neurotoxin injection. Neurology 1988; 38: 1780-1783), показано, что у пациентов, которых лечили, делая инъекции в мышцы шеи, увеличились колебания и плотность волокон в мышцах, удаленных от места инъекции. Эти расстройства возвращаются к норме приблизительно через три-шесть месяцев. Другим признаком системного распространения ботулотоксина после местной инъекции является возникновение изменений сердечно-сосудистых рефлексов и кровяного давления. (Ссылка: Alny R.K., Aminoff M.J., Gelb D.J., Löwenstein D.H.: Myomuscular effects distant from the site of botulinum neurotoxin injection. Neurology 1988; 38: 1780-1783)).

У некоторых пациентов введение протеинового комплекса ботулотоксина в больших дозах может воздействовать на мышцы, не предназначенные для лечения. Например, при лечении блефароспазма протеиновым комплексом ботулотоксина распространение может повредить мышцу, поднимающую веко, вызвав птоз.

Поэтому не только риск образования антител, но также и риск системного распространения заставляют вводить ботулотоксин в сравнительно низких и, таким образом, менее эффективных дозах. Следовательно, врачам настоятельно рекомендуют вводить BOTOX или DYSPORT не чаще, чем раз в три месяца. Это относится, в особенности, к пациентам, которые настаивают на больших дозах ботулинового токсина.

Ввиду вышеизложенного, объектом изобретения является предоставление лечения пациентам, страдающим упомянутыми нарушениями, которое делает возможным введение препарата терапевтического ботулотоксина через более короткие интервалы и/или при использовании сравнительно больших доз. Так как препараты терапевтического ботулотоксина следует применять в определенных тканях-мишенях (например, определенных мышцах или железах), важным требованием является то, чтобы его распространение в соседнюю ткань было ограничено. Последним, но не менее важным требованием является сниженная антигенность препарата терапевтического ботулотоксина. Также объектом изобретения является обеспечение способов лечения заболевания, связанного со спазмом или дистонией мышц, подходящим лекарственным средством в режиме гибких и/или частых интервалов. Другим объектом изобретения является обеспечение косметического лечения с применением лекарственного средства через короткие интервалы со сниженным риском формирования антител и/или сниженным системным распространением.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или состояния, вызванного или связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез пациента, включающему введение композиции, включающей эффективное количество нейротоксического компонента токсинового комплекса Clostridium botulinum, композиции, лишенной любого другого белкового компонента токсинового комплекса Clostridium botulinum, когда (a) пациент является человеком, (b) композицию вводят инъекцией и (c) композицию вводят в интервале менее чем три месяца, интервал, включающий первую терапию и вторую терапию, когда количество, введенное при второй терапии, может быть ниже, выше или идентично количеству, введенному при первой терапии.

Примечательно, что идея настоящего изобретения, которое включает введение нейротоксического компонента комплекса ботулотоксина, в целом, делает возможным лечение любого состояния, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышцы или экзокринной железы, где нейротоксический компонент блокирует секрецию ацетилхолина в синаптической щели. Поэтому лечение, предлагаемое в соответствии с настоящим изобретением, может быть направлено на любое из следующих показаний, большинство которых описано подробно в Dressler D. (2000) (Botulinum Toxin Therapy. Thieme Verlag, Stuttgart, New York):

дистония

краниальная дистония

блефароспазм

нижнечелюстная дистония

по открыточелюстному типу

по закрыточелюстному типу

бруксизм

синдром Meige

язычная дистония

апраксия открытия века

цервикальная дистония

насильственный наклон головы вперед

насильственный наклон головы назад

насильственный наклон головы в сторону

кривошея

фарингеальная дистония

гортанная дистония

спазматический тип дисфонии/по приводящему типу

спазматический тип дисфонии/по отводящему типу

спазматическое диспное

дистония конечности

дистония верхней конечности

дистония при выполнении специфических задач

писчий спазм

судороги музыканта

спазм игрока в гольф

дистония нижней конечности

приведение бедра, отведение бедра

коленное сгибание, коленное разгибание

сгибание лодыжки, разгибание лодыжки

эквиноварусная деформация

дистония стопы

стриарный палец ноги

сгибание пальца ноги

вытяжение пальца ноги

осевая дистония

пизанский синдром

балетная дистония

сегментарная дистония

гемидистония

генерализованная дистония

дистонии при Lubag

дистония при кортикобазальной дегенерации

дистонии при Lubag

остаточная дистония

дистония при спиноцеребральной атаксии

дистония при болезни Паркинсона

дистония при болезни Хантингтона

дистония при болезни Hallervorden Spatz

допа-индуцированная дискинезия/допа-индуцированная дистония

остаточная дискинезия/остаточная дистония

пароксизмальные дискинезии/дистонии

кинезиогенная

некинезиогенная

вызванная действием

небный миоклонус

миоклонус

миокимия

ригидность

доброкачественные мышечные спазмы

наследственный дрожащий подбородок

парадоксальная активность жевательных мышц

спазмы жевательных мышц

гипертрофическая бронхиальная миопатия

гипертрофия жевательных мышц

переднебольшеберцовая гипертрофия

нистагм

осциллопсия

супрануклеарный паралич фиксации взора

эпилепсия парциальная непрерывная

планируемая операция при спастической кривошее

паралич отводящей мышцы голосовой складки

устойчивая мутационная дисфония

дисфункция верхнего сфинктера глотки

гранулема голосовой складки

заикание

синдром Туретта

миоклонус среднего уха

защитное смыкание голосовой щели

постларингэктомическое нарушение речи

защитный птоз

заворот век

дисфункция сфинктера Одии

псевдоахалазия

неахалазийное эзофагиальное расстройство моторики

вагинизм

послеоперационная неподвижность

тремор

дисфункция мочевого пузыря

асинергия сфинктера детрузора

спазм сфинктера мочевого пузыря

гимифасциальный спазм

дискинезии реиннервации

косметическое использование

«гусиные лапки»

нахмуренный лоб

асимметрии лица

ямки подбородочной мышцы

синдром застывшего человека

столбняк

гиперплазия простаты

лечение ожирения

детский церебральный паралич

косоглазие

смешанное

паралитическое

содружественное

после операции при отслойке сетчатки

после операции удаления катаракты

при афакии

миозитное косоглазие

миопатическое косоглазие

диссоциированное вертикальное отклонение

как дополнение к хирургии косоглазия

сходящееся косоглазие

расходящееся косоглазие

ахалазия

анальные трещины

экзокринная гиперфункция железы

синдром Frey

синдром крокодиловых слез

гипергидроз

подмышечный

ладонный

подошвенный

ринорея

относительная гиперсаливация

при инсульте

при болезни Паркинсона

при боковом амиотрофическом склерозе

спастические состояния

при энцефалите и миелите

аутоиммунные процессы

рассеянный склероз

поперечные миелиты

синдром Devic

вирусные инфекции

бактериальные инфекции

паразитарные инфекции

микозы

при наследственном спастическом парапарезе

постапоплектический синдром

инфаркт полушарий

инфаркт ствола мозга

инфаркт спинного мозга

при травме центральной нервной системы

поражение полушарий

поражение спинного мозга

повреждение ствола мозга

при кровоизлиянии центральной нервной системы

кровоизлияние в мозг

субарахноидальное кровоизлияние

субдуральное кровоизлияние

кровоизлияние в спинной мозг

при неоплазиях

опухоли полушарий

опухоли ствола головного мозга

опухоли спинного мозга

Ботулотоксин получают, например, путем культивирования бактерий Clostridium. Предпочтительной разновидностью Clostridium согласно настоящему изобретению является Clostridium botulinum. Однако важно отметить, что нейротоксический компонент можно получить из любых других разновидностей бактерий, при условии, что это функциональный гомолог нейротоксического компонента, полученного из Clostridium botulinum. Композиция, используемая в способах настоящего изобретения, будет всегда содержать нейротоксический компонент, лишенный каких-либо белков Clostridium botulinum. Однако, производя нейротоксический компонент, токсин можно выделить из бактерий как комплекс, содержащий нейротоксический компонент, то есть белок, ответственный за токсическое действие у людей, а также другие бактериальные белки. Впоследствии нейротоксический компонент можно очистить от токсинового комплекса. Термины "токсиновый комплекс" или "комплекс ботулотоксина" или "комплекс ботулонейротоксина" означают, что они являются взаимозаменяемыми и относятся к комплексу с высоким молекулярным весом, включающему нейротоксический компонент приблизительно 150 кДа и, кроме того, нетоксичные белки Clostridium botulinum, включая гемагглютинин и белки негемагглютинина (Sakaguchi 1983; Sugiyama 1980).

Настоящее изобретение предусматривает лечение пациентов, характеризующихся наличием заболевания, связанного с гиперактивной холинергической иннервацией мышц или экзокринных желез. Термин "пациент" относится к пациентам, которые никогда не подвергались воздействию ботулотоксина, а также и к пациентам, которых подвергали воздействию ботулотоксина. У последней группы пациентов, возможно, образовались антитела, направленные против комплекса ботулотоксина или его компонентов. Такие антитела могут быть нейтрализующими антителами. Преимущественно, у пациентов нет титра антител выше 7 мЕд, в особенности, титра нейтрализующих антител выше 7 мЕд. Термин "титр антител не выше…" означает меньше чем 7 мЕд, например, от 1 мЕд до 6 мЕд или от 0,01 мЕд до 1 мЕд.

Термин "гиперактивная холинергическая иннервация" относится к синапсу, который характеризуется необычно высоким количеством высвобождения ацетилхолина в синаптическую щель. "Необычно высоко" относится к увеличению до 25%, до 50% или больше относительно активности, которую можно получить, сравнивая, например, высвобождение с тем же параметром в синапсе того же типа, но не находящемся в гиперактивном состоянии, при котором дистония мышцы может быть показателем гиперактивного состояния. «До 25%» означает, например, приблизительно от 1% до приблизительно 25%. Способы выполнения необходимых измерений известны в уровне техники.

Термин "приблизительно" в контексте настоящего изобретения означает "приблизительно" или "около". В контексте числовых значений, не передавая строгое числовое определение, термин можно рассмотреть для оценки значения, которое составляет ±10% от значения или указанного диапазона.

Термины "нейротоксический компонент" или "компонент нейротоксина" в контексте описания относится к подгруппе комплекса ботулотоксина, который имеет нейротоксическую активность и молекулярную массу приблизительно 150 кДа для серотипа A. Термин "нейротоксический компонент" также включает функциональные гомологи, обнаруженные в других серотипах Clostridium botulinum. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения нейротоксический компонент лишен любого другого белка C. botulinum, желательно также и РНК, потенциально связанной с нейротоксическим компонентом. Нейротоксический компонент может быть одноцепочечным белком-предшественником приблизительно 150 кДа или протеолитически обработанным нейротоксическим компонентом, включающим легкую цепь (L_c) приблизительно 50 кДа и тяжелую цепь (H_c) приблизительно 100 кДа, которые могут быть связаны одним или более дисульфидными мостиками (для обзора см. например, Simpson LL, Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2004; 44:167-93). Специалисты в данной области будут принимать во внимание, что полная биологическая активность достигнута только после протеолитической активации, даже при том, что, предположительно, необработанный предшественник может проявлять некоторые биологические функции или быть частично активным. "Биологическая активность" относится к (a) закреплению рецептора, (b) интернализации, (c) транслокации через эндосомальную мембрану в цитозоль, и/или (d) эндопротеолитическому распаду белков, вовлеченных в слияние мембраны синаптического пузырька. Пробы in vitro для оценки биологической активности включают LD₅₀ для мыши и гемидиафрагмальную пробу мыши, как описано Pearce LB, Borodic GE, First ER, MacCallum RD (1994) (Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) and Dressler D, Lange M, Bigalke H (2005) (The mouse diaphragm assay for detection of antibodies against botulinum toxin type B. Mov Disord 20:1617-1619).

Биологическая активность обычно выражается в Мышиных Единицах (МЕд). 1 МЕд означает количество нейротоксического компонента, который убивает 50% указанной популяции мышей после интраперитонеальной инъекции, то есть введения мыши LD₅₀ внутрибрюшинно (Schantz & Kauter, 1978). Термины "МЕд" и "Единица" или "Ед" являются взаимозаменяемыми. Альтернативно, биологическая активность может быть выражена в единицах летальной дозы (LDЕд)/нг белка (то есть нейротоксического компонента). Термин "МЕд" используют в настоящем описании взаимозаменяемо с терминами "Ед" или "LDЕд".

Термин "эффективное количество" означает количество нейротоксического компонента, после введения которого симптомы заболевания исчезают частично или полностью. Эффективное количество находится, в целом, в диапазоне от 1 до 2000 МЕд, но также можно использовать и дозы до 5000 МЕд. Когда пациенту следует вводить большие дозы нейротоксического компонента, это может быть целесообразно для деления лечения на более чем одну процедуру. Термин "более чем одна процедура" означает, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 процедур.

Предпочтительно, чтобы нейротоксический компонент, применяемый в способах по настоящему изобретению, был очищен от культуры C. botulinum. Способы для культивирования C. botulinum и очистки токсинового комплекса были описаны в уровне техники, рассмотренном в (Schantz & Kauter, 1978. Microbiological methods. Standardized assay for Clostridium botulinum neurotoxins. J Assoc Off Anal Chem 1978; 61(1):96-99). Нейротоксический компонент может быть очищен от C. Botulinum по существу, как описано в способе DasGupta & Sathyamoorthy (DasGupta BR, Sathyamoorthy V. Purification and amino acid composition of type A botulinum neurotoxin. Toxicon. 1984; 22(3):415-24). С этой целью Clostridium botulinum типа A культивировали, например, в 20 I биореакторе в питательной среде, состоящей из 2% пептона протеозы, 1% экстракта дрожжей, 1% глюкозы и 0,05% тигликолата натрия. После роста в течение 72 часов токсин осаждали, добавляя 3N серной кислоты (окончательный рН 3,5). Осажденную и центрифугированную биомассу извлекали с помощью 0,2М фосфатно-натриевого буфера при рН 6,0. После удаления нуклеиновых кислот осаждением сульфатом протамина, токсин преципитировали, добавляя сульфат аммония. Осадок, который растворили и диализировали при 50 мМ фосфата натрия и рН 6,0, связали с колонкой DEAE-Sephadex® при том же рН и элюировали со 150 мМ NaCl. Это сопровождалось хроматографией на колонке QAE-Sephadex®, которая была уравновешена 50 мМ Tris/HCl буфером рН 7,9. Токсин элюировали через градиент NaCl. На последней стадии токсин хроматографировали с помощью SP-SEPHADEX® при рН 7,0. В этом случае связанный токсин элюировали из колонки, используя градиент NaCl (0-300 мМ). Очищенный токсин проанализировали с помощью электрофореза SDS-полиакриламидным гелем (SDS-PAGE), и в целом он демонстрирует чистоту 95±5%.

Ботулонейротоксины, в особенности токсиновый комплекс, описанный выше, были ранее отнесены к семи серологически различным типам А, В, C, D, E, F и G. В последние годы были идентифицированы различные группы А-(A1 и A2) и C-серотипов (C1 и C2). Здесь эти группы определяются как "подтипы".

Нейротоксический компонент серотипа A коммерчески доступен под торговой маркой XEOMIN производства Merz Pharmaceuticals в композиции, лишенной любых других белков токсинового комплекса Clostridium botulinum.

Альтернативно, нейротоксический компонент, используемый в способах настоящего изобретения, может быть произведен рекомбинантной генной экспрессией. С этой целью открытая рамка считывания, кодирующая нейротоксический компонент или его мутант, может быть клонирована в вектор, приспособленный к генной экспрессии в клетке-хозяине. Способы рекомбинантной генной экспрессии и белковой очистки известны опытным в данной области специалистам.

Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая нейротоксический компонент, может быть получена из известной последовательности нуклеиновой кислоты или может быть повторно объединена из двух или более известных последовательностей рекомбинантными способами или химическим синтезом. Примером рекомбинантного нейротоксического компонента является молекула, образованная слиянием, например, легкой цепи первого серотипа с тяжелой цепью второго серотипа нейротоксического компонента. Примером химического синтеза является химический синтез всего нейротоксического компонента.

Также включены генетически модифицированные нейротоксические компоненты, содержащие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или до 20 мутаций аминокислоты. Мутация может быть заменой, вставкой или делецией. Предпочтительно, мутация не ставит под угрозу ни одну из биологических активностей, указанных выше. Однако также предусмотрено использование мутации для модулирования биологической активности нейротоксического компонента.

Также включены нейротоксические компоненты ботулотоксинов, содержащих химически измененные аминокислоты, например, одну или более аминокислот, которые являются гликозилированными, ацетилированными или модифицированными иначе, что может быть целесообразно для поглощения или стабильности токсина. Особенно предпочтительна липидизация нейротоксического компонента. Модифицирующие остатки можно добавить к нейротоксическому компоненту, например, посредством ферментативной реакции in vitro или при использовании адекватных химических условий реакции. Альтернативно, изменение ферментативных функций можно обеспечить in trans экспрессией фермента в клетке-хозяине.

Применение способа, описанного выше, позволяет значительно увеличивать частоту лечения, не вызывая образования нейтрализующих антител, направленных против нейротоксического компонента. В этом отношении следует отметить, что до настоящего изобретения известные режимы лечения строго избегали введения ботулотоксина в интервалах менее чем три месяца, так как более частое введение ботулотоксина, как считали, увеличивало вероятность стимулирования иммунного ответа у пациента, которого лечили. Примеры раскрыли подтверждение понятия, что использование нейротоксического компонента вместо комплекса ботулотоксина позволяет избежать таких проблем.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения вторая процедура лечения выполнена надлежащим образом для улучшения эффекта первой процедуры лечения. Это позволит более эффективно вводить адекватные дозы ботулотоксина. Например, в первой процедуре лечения можно вводить субоптимальную дозу нейротоксического компонента. Если симптомы заболевания пациента не отвечают в достаточной степени, во второй или последующей процедуре(ах) лечения можно вводить большее количество нейротоксического компонента. Поэтому, с точки зрения снижения риска, связанного со способами настоящего изобретения, несколько процедур лечения можно применять, чтобы приблизиться к оптимальной дозе, необходимой для эффективного лечения пациента.

В соответствии с настоящим изобретением, первую, вторую и последующую процедуру лечения можно наметить спустя, по меньшей мере, один день после предыдущей процедуры лечения. Термин "спустя, по меньшей мере, один день после" означает, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель. Однако идеей настоящего изобретения также предусмотрено, что второе лечение намечают спустя лишь несколько часов после первого лечения, например, через 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 часов.

В предпочтительном воплощении второе (последующее) лечение выполняют тогда, когда эффективность первого (предыдущего) лечения начинает снижаться. Такой режим лечения позволяет достичь устойчивого качества жизни для пациентов.

Определение параметра "устойчивое качество жизни" пациентов в виде примера описано далее в отношении одного состояния, которое лечат согласно настоящему изобретению, а именно, блефароспазма, на основе так называемого индекса BSDI (Blepharospasm Disability Index). Индекс BSDI - это опросник для самооценки, путем исследования, ухудшения определенных повседневных действий, обусловленного BEB Goertelmeyer R, Brinkmann S, Comes G, Delcker A, The Blepharospasm Disability Index (BSDI) for the Assessment of Functional Health in Focal Dystonia, Clin. Neurophysiol. 2002; 113(1): S77-S78.

Пациент должен заполнять опросник при каждом посещении врача. Вопросник включает 6 вопросов для оценки с помощью перечня из 5 пунктов (то есть, 0-4 пункта в вопросе) в диапазоне от "нет ухудшения", "небольшое/умеренное/тяжелое ухудшение" до "уже невозможно из-за моего заболевания". Это следующие 6 вопросов: "Вождение транспортного средства", "Чтение", "Просмотр телевизора", "Покупки", "Ходьба" и "Выполнение повседневных действий". В отличие от других функциональных опросников, которые игнорируют вычисление в случае неприменимых тем, BSDI учитывает ответ как «не применимый» для пяти тем, за исключением темы "Выполнение повседневных действий".

BSDI означает, что оценку не пропущенных вопросов вычисляли путем сложения всех применимых вопросов, а также вопросов, на которые ответили, и путем деления на количество вопросов, на которые ответили.

Однако такие параметры действительны для многих других заболеваний и состояний, которые будут лечить в пределах настоящего изобретения, например, опросник при краниоцервикальной дистонии (CCDQ 24) для цервикальной дистонии (Mueller J, Wissel J, Kemmler G, Bodner T, Poewe W, Quality of life in patients with craniocervical dystonia: development of the CCDQ-24, Mov. Disord. 2000; 15(Suppl 3): 761, and HRQL, by the Swedish Short Form 36 Health Survey Questionnaire (SF-36) for spasticity (Welmer AK, von Arbin M, Widen Holmqvist L, Sommerfeld DK, Spasticity and its association with functioning and health-related quality of life 18 months after stroke, Cerebrovasc. Dis. 2006; 21 (4): 247-253).

При каждой повторной инъекции в процессе лечения или при последнем лечении пациента, разница ∆_BSDI между фактическим BSDI и исходным BSDI вычисляется следующим образом:

∆_BSDI = BSDI_факт ^_ BSDI_исходн

BSDI_исходн определяют во время первого посещения пациента для лечения и перед первой инъекцией препарата. BSDI_actual определяют после соответствующей (повторной) инъекции препарата и через 3 недели после нее, соответственно.

На основе оценки ∆_BSDI , зарегистрированной при первом лечении, каждого пациента относят к одному из трех уровней следующим образом:

Уровень 1 (умеренное улучшение): -1,00≤∆_BSDI≤-0,65.

Уровень 2 (отмеченное улучшение):-1,35≤∆_BSDI<-1,00.

Уровень 3 (исчезновение признаков и симптомов): ∆_BSDI<-1,35.

Пациент классифицирован как респондент, то есть, пациент демонстрирует устойчивый уровень качества жизни, если ни одна из вычисленных оценок ∆_BSDI не превышает порог ∆_С . Оценка порога ∆_С зависит от уровня, к которому отнесен пациент. Оценки порогов следующие:

Уровень 1: ∆_С=-0,40

Уровень 2: ∆_С=-0,75

Уровень 3: ∆_С=-1,10

Респонденты демонстрируют снижение их первоначальной оценки BSDI и, тем самым, улучшение качества их жизни. Минимальная величина улучшения выражена порогом ∆_С . Оценки ∆_С снижаются с номером уровня, потому что пациенты уровня 2 показывают более сильную реакцию на начальную инъекцию, чем пациенты уровня 1 (заканчивающегося меньшей разницей BSDI), и пациенты уровня 3 реагируют даже сильнее, чем пациенты уровня 2.

Наконец, наблюдаемые различия между уровнем BSDI в день повторной инъекции и начальным уровнем BSDI проанализируют, чтобы исследовать, есть ли какое-нибудь улучшение уровня качества жизни в течение продолжительного времени ко времени повторной инъекции (ожидаемое время снижения эффекта лечения).

Вышеуказанные (и заявленные в формуле изобретения) способы введения лекарственного средства, как применяют в настоящем изобретении, обычно относят к активностям врачей, лечащих пациентов. Однако способ введения может быть описан в инструкции к лекарственному средству, например, упаковка лекарственного средства содержит специально предназначенную листовку с инструкциями для врача и/или пациента, и/или упаковка специально предназначена для того, чтобы осуществить введение согласно настоящему изобретению.

Как используется везде в описании настоящего изобретения, термин "общее количество, введенное при лечении" относится к полной дозировке и означает, что количество нейротоксина вводилось пациенту во время единственного лечения. Единственное лечение может включать одну или более инъекций. Например, лечение M. sternocleidomastoideus, M. splenius capitis, M. semispinalis capitis и M. trapezius может включать 1, 2, 3, 4 или 5 инъекций, тогда как лечение M. levator scapulae или Mm scaleni может включать только 1-3 инъекции. Как указано ранее, количество, используемое для лечения, зависит от ряда параметров, которые известны в уровне техники. Такие параметры включают, например, серотип нейротоксического компонента, ткань-мишень, в которую будут делать инъекцию, и многие определенные факторы, зависящие от пациента. Идеей настоящего изобретения предусмотрено, что единственное лечение может быть разделено на две или более процедуры лечения, во время которых вводят вышеупомянутое общее количество нейротоксического компонента. Это будет в особенности иметь место в случае, если следует вводить большое количество нейротоксического компонента.

Кроме того, основанным на этом воплощении способом настоящего изобретения теперь будет возможно более эффективно лечить пациента при необходимости дополнительного введения нейротоксического компонента. Это может иметь место, например, после первого или предыдущего лечения, если установлено, что дополнительные мышцы способствуют симптомам болезни или в случае, когда мышцы были пропущены.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения пациент является пациентом, нуждающимся в введении больших доз нейротоксического компонента. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения, (a) пациент является пациентом с тяжелым нарушение