Рекомбинантная вирусная вакцина

Рекомбинантная вирусная вакцина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Представленное изобретение обеспечивает новые рекомбинантные вирусные вакцины. В особенности, представленное изобретение обеспечивает конбинированные продукты, которые включают рекомбинантные вирусные векторы и специфичные составы, способные повысить иммунную реакцию, образующуюся в условиях in vivo на указанные рекомбинантные вирусные векторы.

Традиционные способы вакцинации, которые включают введение в систему животных антигена, который может вызвать имунную реакцию, и таким образом защитить животное от инфекции, были известны много лет назад. Эти способы включали существование как живых, так и инактивированных вакцин. Живые вакцины - это типично аттенуированные не патогенные версии инфекционного агента, которые способны к праймированию имунной реакции, направленной против патогенной версии инфекционного агента. В последние годы были достигнуты успехи в развитии рекомбинантных вакцин, особенно рекомбинантных живых вакцин, в которых нативные антигены, которые представляют интерес, закодированы и экспрессированы с помощью вектора. Среди них являются представленными те векторы, которые основаны на рекомбинантных вирусах, и они показали большую перспективу и играют важную роль в развитии новых вакцин. Многие из вирусов были исследованы относительно их способности экспрессировать белки, которые происходят от чужеродных болезнетворных микроорганизмов или от опухолевой ткани, и относительно способности вызывать специфичные иммунологические ответы против этих антигенов в условиях in vivo. В целом же, эти основанные на гене вакцины могут стимулировать мощные гуморальные и клеточные иммунные ответы, и вирусные векторы могли бы быть эффективной стратегией и для доставки кодирующих антиген генов, и для помощи в повышении презентации антигена. Для того чтобы быть использованным как носитель для вакцины, идеальный вирусный вектор должен быть безопасным и позволить эффективно презентировать необходимых патоген-специфичных для болезнетворного микроорганизма антигенов к иммунной системе. Это должно также показать низкосвойственную иммуногенность, чтобы учесть ее репредставление для того, чтобы повысить соответствующие специфичные иммунные ответы. Кроме того, векторная система должна соответствовать критериям, которые позволяют реализовывать ее производство на крупномасштабной основе. Несколько вирусных векторов вакцины таким образом появились до настоящего времени, все они имеют относительные преимущества и пределы в зависимости от предложенного применения, и к настоящему времени ни один из них, как оказалось, не был идеальными носителем для вакцины.

Рекомбинантные поксвирусные векторы явлются примерами вирусных векторов для вакцин. Они были использованы как индукторы как гуморальных, так и клеточных свободных ответов, индуцируя как СD4+, так и СD8+Т клетки, и поэтому представляют систему доставки, особенно предпочтительно для лечения рака или антивирусной иммунотерапии (Arlen и др., 2005, Semin Oncol., 32, 549-555 или Essajee и Kaufman, 2004, Expert Opin Biol Ther., 4, 575-588). Несмотря на преимущества, связанные с поксвирусной вакцинацией, и относительно других способов лечения вакцинированием (см., например, Souza и др., 2005, Braz J Med Biol Res 509-522), является, тем не менее, желательным выявить те адъювантные составы, которые адаптированы к этому вирусному вектору, и которые будут предназначены для того, чтобы усилить имунную реакцию, вызванную указанной вакциной.

Было предпринято серьезное усилие в последние годы, и завершившееся существенным успехом, которое было направлено на то, чтобы обнаружить новые составы препарата, которые действуют, стимулируя специфичные ключевые аспекты иммунной системы. Эти составы, известные как свободные модификаторы ответа (IRMs) или адъюванты, как предполагают, действуют через основные механизмы иммунной системы через Toll - подобные рецепторы (TLRs) для того, чтобы вызвать биосинтез различных специфичных цитокинов (например, это интерфероны, интерлейкины, факторы некроза опухоли и т.д.). Такие составы, как было показано, стимулировали быстро высвобождаемый выход специфичных моноцит / макрофаг - дочерних цитокинов и также способны к стимулированию В клеток для того, чтобы секретировать антитела, которые играют важную роль в антивирусной и антиопухолевой активности составов IRM. Один из преобладающих иммуностимулирующих ответов, вызванных IRMs, является индукцией интерферон IFN - альфа - продуцирования, которое, как полагают, очень важно в остром антивирусном и антиопухолевом действиях. Кроме того, регулирование других цитокинов, таких как, например, фактор некроза опухоли (TNF), IL-1 и IL-6 также имеет потенциально выгодную активность и, как полагают, способствует антивирусным свойствам и антиопухолевым свойствам этих составов. Свободные модификаторы ответа (IRMs) были раскрыты как такие, которые являются полезными для лечения большого количества болезней и расстройств, включая вирусные заболевания (например, вирус папилломы человека, гепатит, герпес), неоплазии (например, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, актинический кератоз, меланома), и ТН 2 - медиированные заболевания (например, астма, аллергический ринит, атопический дерматит).

Примеры таких свободных модификаторов ответа (IRMs), включают Ср G олигонуклеотиды (см., например, US 6194388; US 2006094683; WO 2004039829), липополисахариды, кислотные комплексы полиинозил: полицитидил (Kadowaki и др., 2001, J. Immunol. 166, 2291-2295), и полипептиды и белки, известные как индуцирующие продукцию цитокинов из дендритных клеток и/или моноцит / макрофагов. Другими примерами таких свободных модификаторов ответа (IRMs) являются маленькие органические молекулы, такие как имидазолхинолин амины, имидазолпиридин амины, 6,7 сплавленные циклоалкил имидазолпиримидин амины, имидазол пиримидин амины, оксазолхинолин амины, триазолохинолин амины и 1,2 соединенные имидазолхинолин амины (см., например, US 4689338; US 5389640; US 6110929; и US 6331539).

В частности, имидазолхиполин амины продемонстрировали сильную потенцию в качестве индукторов интерферона альфа (IFN), фактора некроза опухоли альфа (TNF), интерлейкина бета IL-1, IL-6, альфа IL-1, антагониста рецептора IL-1, IL-10, фактора стимулирования колонии макрофагов гранулоцитов (GM-CSF), гранулоцит CSF (Г-CSF), и макрофаг воспалительных белков 1 альфа в условиях in vitro и в условиях in vivo (Gibson и др., 1995, J Interferon Cytokine Res., 15, 537-545; Tomai и др., 1995, Antiviral Res., 28, 253-264; Testerman и др., 1995, J Leukoc Biol., 58, 365-372) и, как показано, вызвали разнообразные биологические функции, включая антивирусную, антипролиферативную и антиопухолевую активность (для обзора, см. Syed, 2001, Expert Opin Pharmacother., 2, 877-882 или Li и др., 2005, J Drugs Dermatol., 4, 708-717). Более подробно, изобретатели заявки на патент WO 93/20847 показали, что имидазолхинолин амины были в состоянии усилить имунную реакцию к определенным антигенам, таким как живые вирусные и бактериальные иммуногены, полученные из опухоли, протозоа, полученные из организмов, грибковые и бактериальные иммуногены, токсоиды, токсины, полисахариды, белки, гликопротеины, пептиды и т.п., когда эти антигены были введены с составами этой категории. Антивирусная активность составов имидазолхинолин аминов была далее продемонстрирована относительно многих вирусов, особенно поксвирусов (Bikowski, 2004, Cutis., 73, 202-206; US 20050048072), и их клиническая эффективность была продемонстрирована против остроконечных бородавок (Scheinfeld и Lehman, 2006, Dermatol Online J., 12, 5), генитального герпеса (Miller и др., 2002, Int Immunopharmacol., 2, 443-451) и контагиозного моллюска (Stulberg и Galbraith Hutchinson, 2003, Am. Fam. Physician, 67, 1233-1240).

После наблюдения в начале 1990-х о том, что векторы ДНК плазмиды могли непосредственно трансфецировать клетки животных в условиях in vivo, были предприняты существенные усилия по исследованию, направленные на то, чтобы развить способы вакцинирования, основанные на использовании плазмид ДНК для того, чтобы вызвать имунную реакцию, прямым введением в животных ДНК, которая кодирует аллергенные пептиды. Такие способы, которые широко отнесены к ДНК вакцинации, теперь используются для того, чтобы выявить защитные иммунные ответы в большом количестве моделей болезней. Позже, имидазол хинолин амины были предложены как адъюванты для вакцинации ДНК (WO 02/24225), особенно в иммунотерапии рака (WO 2006/042254; Smorlesi и др, 2005, Gene Therapy, 12, 1324-1332). Для обзора ДНК вакцин, см. Reyes - Sandoval и Ertl, 2001 (Current Molecular Medicine, 1, 217-243).

Существующее изобретение имеет отношение к усовершенствованным рекомбинантным вирусным вакцинам, которые экспрессируют в условиях in vivo no крайней мере одну гетерологичную последовательность нуклеотида, особенно последовательность нуклеотида, которая кодирует антиген. Это имеет отношение в особенности к рекомбинантной вирусной вакцине, содержащей по крайней мере один рекомбинантный вирусный вектор, который экспрессирует по крайней мере один антиген и по крайней мере один адъювант, который способен к значительному усиление иммунности, ориентированной на указанный антиген относительно той же самой рекомбинантной вирусной вакцины без адъюванта, и который является совершенно подходящим для этого типа вакцины. Это далее имеет отношение к способам вакцинации.

Заявитель неожиданно пришел к выводу о том, что специфичные имидазолилхинолин аминовые составы способны обладать сильной антивирусной потенцией, которая явлется направленной на то, чтобы усилить имунную реакцию в ответ на действие рекомбинантных вирусных вакцин к антигену, закодированному рекомбинантным вирусным вектором, и, более подробно, для вакцины, основанной на рекомбинантном гене поксвирусного вектора, и это проявляется в неочевидных пропорциях.

Предметом существующего изобретения, посему, является рекомбинантная вирусная вакцина, содержащая (i) по крайней мере один рекомбинантный вирусный вектор, который экспрессирует в условиях in vivo по крайней мере одну гетерологичную последовательность нуклеотида, особенно гетерологичную последовательность нуклеотида, которая кодирует антиген, и (ii) по крайней мере одну 1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин производную.

Согласно одному воплощению существующего изобретения, указанная 1Н-имидазо[4,5-с]-хинолин-4-амин производная усиливает иммунные ответы у пациента к упомянутому антигену, где упомянутую рекомбинантную вирусную вакцину вводят указанному пациенту.

Так, как используется здесь по всему описанию, артикли используются в том смысле, что они подразумевают "по крайней мере один", "по крайней мере первое", "один или более" или "множество" составов, на которые ссылаются, или этапов, если контекст не имеет в виду иное. Например, термин "клетка" включает множество клеток, включая смесь указанных. Более определенно, "по крайней мере один" и "одно или более" средств являются значением, которое является единицей или более чем единица, со специальным предпочтением в единицу, два или три.

Термин "и/или" везде, как используется здесь, включает значение "и", "или" и "все или любая другая комбинация элементов, связанных указанным термином".

Термин "об" или "приблизительно" так, как используется здесь, означает средства в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10%, и, более предпочтительно, в пределах 5% данного значения или диапазона.

Как используется здесь, термин "включение", "содержание" определяет те продукты, составы и способы, которые предназначены для того, чтобы означать, что продукты, составы и способы включают составы, на которые ссылаются, или этапы, но не исключая другие.

Термин "пациент" относится к позвоночному животному, особенно к тем членам семейства, которые относятся к разновидностям млекопитающих, и включает, но не ограничивает, домашних животных, диких животных, приматов, включая людей.

Термин "пациент" никоим образом не ограничен отдельным статусом болезни, он охватывает и пациентов, у которых уже развилась болезнь, представляющая интерес, и пациентов, которые еще не больны.

В том значении, как использующийся здесь, термин "лечить" или "лечение" охватывает профилактику и/или терапию. Соответственно, рекомбинантные вирусные вакцины существующего изобретения не ограничены терапевтическими применениями и могут использоваться для профилактики.

Согласно более преимущественному воплощению, рекомбинантный вирусный вектор согласно существующему изобретению - это поксвирусный вектор (см., например, Сох и др. in "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J.M.Hos, Carolina Academic Press). Согласно другому преимущественному воплощению изобретения, он является выбранным из группы, состоящей из вируса коровьей оспы, подходящие вирусы коровьей оспы включают, однако не ограничены, Копенгагенский штамм (Goebel и др., 1990, Virol. 179, 247-266 и 517-563; Johnson и др., 1993, Virol. 196, 381-401), штамм Wyeth и сильно аттенутированный вирус, полученный из указанного, включая MVA (для обзора см. Mayr, А., и др., 1975, Infection 3, 6-14), а также производные указанного (такие как штаммы вируса коровьей оспы MVA 575 (ЕСАСС V00120707 - US 6913752), NYVAC (см. WO 92/15672 - Tartaglia и др., 1992, Virology, 188, 217-232). Он может также быть получен от любого другого представителя поксвирусов, при специфическом оспа - дифтерите птиц (TROVAC, см. Paoletti и др., 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163); вирус оспы канареек (ALVAC, WO 95/27780, Paoletti и др., 1995, Dev Biol Stand., 84, 159-163); вирус оспы голубей, вирус оспы свиней и т.п. Посредством примера специалисты, квалифицированные в данной отрасли техники, могут обратиться к WO 9215672 (включено здесь в качестве ссылки), в которой описано производство векторов экспрессии, основанных на поксвирусах, которые способны к экспрессии такой гетерологической последовательности нуклеотида, особенно последовательности нуклеотида, которая кодирует антиген.

В том значении, как используется здесь, термин "антиген" относится к любому веществу, которое является способным к тому, чтобы быть мишенью для иммунного ответа. Антиген может быть мишенью, например, для медиированных клеток и/или гуморальных имунных реакций, возникающих у пациентов. Термин "антиген" охватывает, например, вирусные антигены, опухоль - специфические или - связанные антигены, бактериальные антигены, антигены, происходящие от паразитов, аллергены и т.п.:

- вирусные антигены включают, например, антигены, происходящие из вирусов гепатита А, В, С, D и Е, ВИЧ, вирусы герпеса, цитомегаловирус, ветряная оспа зостер, вирусы папилломы, вирус Эпштейна Барра, вирусы гриппа, вирусы парагриппа, аденовирусы, вирусы коксаки, пикорна вирусы, рота вирусы, дыхательные сцинцитиальные вирусы, вирусы сифилиса, рино вирусы, вирус краснухи, папо вирусы, вирус свинки, вирус кори; некоторые не ограничивающие примеры известных вирусных антигенов включают следующее: антигены, полученные из ВИЧ 1 такие, как tat, nef, gp 120 или gp 160, gp 40, p 24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev или часть и/или комбинации указанных; антигены, которые имеют происхождение из человеческих вирусов герпеса, такие как gH, gL gM gB gC gK gE или gD или часть и/или комбинации указанных или медиированный ранний белок такой, как as ICP27, ICP47, ICP4, ICP36 из HSV1 или HSV2; антигены, которые имеют происхождение из цитомегаловируса, особенно из человеческого цитомегаловируса, такие как gB или производные указанного; антигены, которые имеют происхождение из вируса Эпштейна Барра, такие как gp 350 или производные указанного; антигены, которые имеют происхождение из вируса Varicella Zoster, такие как asgp 1, 11, 111 и IE 63; антигены, которые имеют происхождение из вируса гепатита, такие как гепатит В, гепатит С или гепатит Е вирусные антигены (например, env белок Е1 или Е2, коровый белок, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7, или часть и/или комбинации указанных HCV); антигены, которые имеют происхождение из человеческих вирусов папилломы (например, HPV 6, 11, 16, 18, например, L1, L2, Е1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7, или часть и/или комбинации указанных); антигены, которые имеют происхождение из других вирусных болезнетворных микроорганизмов, таких как сцинцитиальный вирус дыхательных путей (например, F и белки Г или производные указанного), вирус пара гриппа, вирус кори, вирус свинки, флави вирусы (например, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки, тик-борн энцефалитный вирус, вирус японского энцефалита) или вирусы гриппа, поражающие клетки (например, ХА, NP, NA или М белки, или части и/или комбинаций указанных);

- опухоль - специфичные или связанные антигены включают, например, антигены, которые имеют происхождение от рака молочной железы, рака ободочной кишки, ректального рака, рака головы и шеи, почечного рака, малигнизированной меланомы, гортанного рака, рака яичников, рака шейки матки, рака простаты. Антигены рака - это те антигены, которые могут потенциально стимулировать только специфичные для опухоли иммунные ответы. Некоторые из этих антигенов являются закодированными, хотя не обязательно являются выраженными, нормальными клетками. Эти антигены могут быть охарактеризованы как те, которые обычно спокойны (то есть не являются выраженными) в нормальных клетках, те, которые экспрессированы только на специфичных стадиях дифференцирования, и те, которые временно экспрессированы, такие как эмбриональные и эмбриональные антигены. Другие антигены рака закодированы мутантными клеточными генами такие, как онкогены (например, активизированный ras онкоген), гены супрессоры (например, мутантный р53), сплавляющиеся белки, возникающие благодаря существованию внутренних делеций или хромосомных аббераций. Тем не менее другие антигены рака могут быть закодированы вирусными генами, такими как продолженные РНК и вирусные опухолевые ДНК. Некоторые неограничивающие примеры специфичных опухолевых или связанных антигенов включают MART-1/Melan-A, gp100, дипептид пептидазу IV (DPPIV), аденозин деаминаз - обязательный белок (ADA bp), циклофилин b, колоректальный связанный антиген (CRC)-С017-1А/GA 733, эмбриокарциномный антиген (СЕА) и его иммуногенный кеп антигенных детерминант 1 и кеп 2, etv 6, am 11, простат - специфичный антиген (PSA) и его иммуногенные антигенные детерминанты PSA-1, PSA-2 и PSA-3, специфичный для простаты мембранный антиген (PSMA), Т-клеточный рецептор / CD3 - зетта цепи, MAGE - семейство антигенов опухоли (например, MAGE-А1, MAGE-А2, MAGE-А3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-В3), MAGE-Xp4 (MAGE-В4), MAGE-С1, MAGE-С2, MAGE-С3, MAGE-С4, MAGE-С5), GAGE - семейство антигенов опухоли (например, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, Gn Т-V, MUM-1, CDK4, тирозиназа, р53, семейство MUC (например, MUC-1), HER 2/neu, р21ras, RCAS1, альфа-фетопротеин, бета-катенин, альфа-катенин, бета-катенин и гамма-катенин, р120ctn, gp100.sup. Pme 1117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, аденоматный полиозный поли - белок (АРС), фодрин, Connexin 37, Ig-идиотип, р15, gp 75, GM2 и GD2 ганглиозиды, вирусные продукты, такие как человеческие вирусные папилломные белки, семейство Smad антигенов опухоли. Imp-1, P1A, EBV - закодированный ядерный антиген (EBNA)-1, брэйн гликоген фосфорилаза, SSX-1, SSX-2 (НОМ-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 и ЦЕМЕНТ 7, и с-erbB-2.;

- бактериальные антигены включают, например, антигены, которые имеют происхождение из Mycobacteria, порожденнные ТВ и лепрой, пневмоцисты, аэробные грамм - отрицательные бациллы, микоплазмы, стафилококковые инфекции, стрептококковые инфекции, сальмонеллы, хламидии, нейсеррии;

- другие антигены включают, например, антигены которые имеют происхождение от малярии, лейшманиоза, трипаносомы, токсоплазмы, шистозомиазы, филлариазы;

- аллергены являются таким веществом, которое может вызвать аллергический или астматический ответ в отношении к восприимчивому субъекту. Перечень аллергенов огромен и может включать пыльцу, яды насекомого, пыль от животных, грибковые споры и лекарственные средства (например, пенициллин). Примеры естественных, животных и аллергенных растений включают, но не являются ограниченными белками

В особенно преимущественном воплощении гетерологичная последовательность нуклеотида существующего изобретения, кодирует один или больше или часть из всех следующих антигенов HBV - PreS1 PreS2 и Surface env белки, коровый и polHIV - gp120, gp40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef; HPV - E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, L1, L2 (см., например, примеры из WO 90/10459, WO 98/04705, WO 99/03885); HCV env белок E1 или E2, коровый белок, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a, NS5b, p7; Muc-1 (см., например, US 5861381; US 6054438; WO 98/04727; WO 98/37095).

Нуклеиновая кислота, которая кодирует антиген, является операбельно линкированной с последовательностью экспрессированного гена, которая направляет экспрессию нуклеиновой кислоты антигена в пределах эукариотической клетки. Последовательность экспрессированного гена - это любая регуляторная последовательность нуклеотида, такая как последовательность промотора или комбинация энхансер - промотор, которая облегчает эффективную транскрипцию и трансляцию нуклеиновой кислоты антигена, к операбельному линкеру. Последовательность экспрессии гена может, например, иметь отношение к млекопитающим или вирусным промоторам, таким как конститутивный или индуцибельный промотор. Конститутивные и те, которые имеют отношение к млекопитающим, промоторы включают, но не являются ограничеными, промоторы для следующих генов: гипоксантин фосфорибозил трансфераза (HPRT), аденозин деаминаза, пируават киназа, b - актиновый промотор и другие конститутивные промоторы. Среди ярких вирусных промоторов, которые функционируют конститутивным образом, в эукариотических клетках, например, являются промоторы из цитомегаловируса (CMV), обезьяноподобный вирус (например, SV40), вирус папилломы, аденовирус, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса саркомы Роуса, цитомегаловирус, длинные терминальные повторения (LTR) вируса лейкемии Молони и другого ретровируса, и промотора киназы тимидина вируса герпеса простого. Другие конститутивные промоторы известны как таковые для средних специалистов данной отрасли техники. Среди промоторов, полезных как последовательности экспрессии гена изобретения, также являются индуцибельные промоторы. Индуцибельные промоторы экспрессированы в присутствии агента стимулирования. Например, металлотиониновый промотор вынужден способствовать транскрипции и трансляции в присутствии специфичных ионов металлов. Другие индуцибельные промоторы известны как таковые для средних специалистов данной отрасли техники. В целом же, последовательность экспрессии гена должна включать, по мере необходимости, 5' не - транскрибирующиеся и 5' не - транслирующиеся последовательности, которые являются связанными с инициированием транскрипции и трансляции, соответственно, такие как ТАТА box, последовательность кэпа, последовательность СААТ, и т.п. В особенности, такие 5' не - транскрибирующиеся последовательности будут включать регион промотора, который включает последовательность промотора для транскрипционного контроля операбельно присоединенной нуклеиновой кислоты антигена. Последовательности экспрессии гена произвольно включают последовательности энхансера или последовательности активатора в качестве преимущественных. Среди преимущественных промоторов для использования в поксвирусном векторе (см. ниже) без ограничения, используются, промоторы вируса коровьей оспы 7.5К, H5R, ТК, р28, р11 и K1L, химерные промоторы, которые расположены между ранними и поздними поксвирусными промоторами, так же как синтетические промоторы, такие, как описано в Chakrabarti и др. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond и др. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) и Kumar и Boyle (1990, Virology 179, 151-158).

Согласно другому особенному воплощению существующего изобретения, указанная гетерологичная последовательность нуклеотида кодирует все или часть антигена (ов) HPV, которые являются выбранными из группы, которая состоит из Е6, рано кодирующего региона HPV, Е7, рано кодирующего региона HPV и производных или комбинации указанного.

Антиген HPV, закодированный рекомбинантным вирусным вектором согласно изобретению, является выбранным из грппы, которая состоит из HPV Е6 полипептида, HPV Е7 полипептида или обоих, HPV Е6 полипептида и HPV Е7 полипептида. Существующее изобретение охватывает использование любого HPV Е6 полипептида, который является связанным с р53, является измененным или по крайней мере значительно уменьшенным и/или использование любого HPV Е7 полипептида, который является связанным с Rb, является измененным или по крайней мере значительно уменьшенным (Monger и др., 1989, EMBO J. 8, 4099-4105; Crook и др., 1991, Cell 67, 547-556; Heck и др., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelps и др., 1992, J. Virol. 66, 2148-2427). У не онкогенного HPV-16 Е6 варианта, который является подходящим для целей существующего изобретения, является удаленным один или более остатков аминокислоты, которые являются расположенными от приблизительно положения 118 к приблизительно положению 122 (+1 представление первого остатка метионина нативного HPV-16 Е6 полипептида), со специальным преимуществом полного удаления остатков 118-122 (СРЕЕК). У не онкогенного HPV-16 Е7 варианта, который является подходящим для целей существующего изобретения, является удаленным один или более остатков аминокислоты, которые являются расположенными от приблизительно положения 21 к приблизительно положению 26 (+1 представление первой аминокислоты нативного HPV-16 Е7 полипептида, со специальным преимуществом полного удаления остатков от 21 к 26 (DLYCYE). Согласно преимущественному воплощению, одно или большее количеству HPV-16 раннего полипептида(-ов) в использовании для изобретения являются далее измененными для того, чтобы усилить класс I МНС и/или представление класса II МНС, и/или стимулировать анти - HPV иммунитет. HPV Е6 и Е7 полипептиды являются ядерными белками, и было ранее уже показано то, что мембранное представление разрешает усиливать их терапевтическую эффективность (см., например, WO 99/03885). Таким образом, может быть желательным изменение по крайней мере одного из HPV раннего полипептида(ов) для того, чтобы быть представленным на мембране клетки. Мембранное закрепление может быть легко реализовано путем инкорпорирования в HPV ранний полипептид мембран - презентированной последовательности и в том случае, если нативный полипептид испытывает недостаток секреторной последовательности (то есть сигнального пептида). Мембран - закрепленные и секреторные последовательности являются известными для специалистов данной отрасли техники. Вкратце, секреторные последовательности присутствуют на N - конце мембраны и являются представленными или секретированными полипептидами и их проникновение является инициированным на эндоплазматическом ретикулуме (ER). Они обычно включают 15-35 сильно гидрофобных аминокислот, которые потом могут быть разрушены определенным образом локализированной ER - эндопептидазой для того, чтобы дать возможность образоваться зрелому полипептиду. Мембран - закрепленные последовательности являются обычно сильно гидрофобными в природе и не природных условиях для того, чтобы закрепить на мембране полипептиды (см., например, Branden и Tooze, 1991, in Introduction to Protein Structure p.202-214, NY Garland).

Спектр мембран - закрепленных последовательностей и секреторных последовательностей, которые могут использоваться в контексте существующего изобретения, является широким. Они могут быть получены из любого мембранзакрепленного и/или секреторного полипептида, включающего такие полипептиды, как, например, клеточные или вирусные полипептиды, такие как гликопротеин вирусной гидрофобии, вирусный гликопротеин ВИЧ или F белок вируса кори, или могут быть синтетическими. У мембранзакрепленных последовательностей и/или секреторных последовательностей, инсертированных в каждый из ранних полипептидов HPV-16, используемых согласно изобретению, может быть общее или различное происхождение. Преимущественный участок вставки секреторной последовательности-N-терминальный конец в направлении вниз по ходу кодона для инициирования трансляции, а мембранзакрепленная последовательность является С-терминальным концом, например, по направлению вверх от стоп кодона.

HPV Е6 полипептид для использования в существующем изобретении предпочтительно изменен вставкой секреторных и мембранзакрепленных сигналов F белка кори. Произвольно или в комбинации, HPV E7 полипептид для использования в существующем изобретении предпочтительно изменен вставкой секреторных и мембранзакрепленных сигналов гликопротеина вирусной гидрофобии.

Терапевтическая эффективность рекомбинантного вирусного вектора может также быть усилена при использовании одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих иммунопотенциирующие полипептид(ы). Например, может быть выгодно связать HPV ранний полипептид(ы) с полипептидом, таким как кальцийретикулярный полипептид (Chen и др., 2000, Cancer Res. 60, 1035-1042), убихитин (Rodriguez и др., 1997, J. Virol. 71, 8497-8503) или область перемещения бактериального токсина, такого как экхотоксин Pseudomonas (ETA(dIII)) (Hung и др., 2001 Cancer Res. 61, 3698-3703).

Согласно другому и предпочтительному воплощению существующего изобретения, рекомбинантный вирусный вектор согласно изобретению включает нуклеиновую кислоту, которая кодирует один или более ранний полипептид(ы), как было выше указано, и более подробно HPV-16 и/или HPV-18 ранние Е6 и/или полипептиды Е7.

Согласно другому специальному воплощению существующего изобретения, указанная гетерологичная последовательность нуклеотида, кодирует все или часть MUC1 антигена или производные указанного.

Если это является необходимым, то молекула нуклеиновой кислоты для использования в данном изобретении, может быть оптимизирована для того, чтобы обеспечить высокий уровень экспрессии антигена (например, HPV ранний полипептид(ы)) в специфической клетке хозяине или организме, например, в человеческой клетке хозяине или в организме. Как правило, оптимизация кодона является выполненной, заменяя один или более "нативных" (например, HPV) кодонов, которые являются соответствующими кодону, который является используемым в относящейся к млекопитающим клетке хозяине одним или более кодонами, кодирующими ту же самую аминокислоту, которая используется более часто. Это может быть достигнуто обычным мутагенезом или химическими синтетическими способами (например, приводящими к синтезу нуклеиновой кислоты). Не является необходимым заменить все нативные кодоны, соответствующие не часто используемым кодонам, так как усиленная экспрессия может быть достигнута даже с частичной заменой. Кроме того, некоторые отклонения от строгой придерженности к оптимизированному использованию кодона могут быть реализованы, если использовать введение сайта(ов) рестрикции.

Как уже было упомянуто выше, поксвирусный вектор является предпочтительным, и более определенно сильно аттенуированным штаммом вируса коровьей оспы. Определение полной последовательности генома MVA и сравнение с вирусный геном копенгагенским вирусом коровьей оспы позволило точно идентифицировать семь делеций (от I до VII), которые произошли в геноме MVA (Antoine и др., 1998, Virology 244, 365-396), любая из которых может использоваться для того, чтобы инсерцировать антиген (например, HPV ранний полипептид или MUC1), кодирующий нуклеиновую кислоту.

Основная техника, которая используется для того, чтобы инсерцировать нуклеиновую кислоту и связанные регулирующие элементы, требуемые для экспрессии в поксвирусном геноме, уже является описанной во многих документах, доступных для среднего специалиста, квалифицированного в данной отрасли техники (Paul и др., 2002, Cancer gene Ther. 9, 470-477; Piccini и др., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4769330; US 4772848; US 4603112; US 5100587 и US 5179993). Обычно, процедура реализуется благодаря гомологичной рекомбинации между наложившимися последовательностями (то есть желаемым сайтом рестрикции), и является представленной в вирусном геноме и в плазмиде, несущей нуклеиновую кислоту для инсерции.

Нуклеиновая кислота, которая кодирует антиген согласно существующему изобретению, является предпочтительно инсерцированной в несущественный локус поксвирусного генома для того, чтобы рекомбинантный поксвирусный ген остался жизнеспособным и инфекционным. Несущественные области не кодируют интегриновые области или любой ген, для которого инактивация или удаление значительно не ослабляют вирусный рост, репликацию или инфекцию. Можно также предусмотреть вставку в существенном вирусном местоположении при том условии, что дефектная функция будет супплиирована во время продуцирования вирусных частиц, например, при использовании клеточной линии адъюванта, несущей комплементарные последовательности, которые, соответственно, являются удаленными в поксвирусном геноме.

Можно использовать копенгагенский вирус коровьей оспы, который кодирует нуклеиновую кислоту антигена, предпочтительно вставленную в ген тимидин киназы (tk) (Hruby и др., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir и др, 1983, J. Virol. 46, 530-537). Однако, другие участки вставки являются также соответствующими, например, в гемагглютининовом гене (Guo и др., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), в местоположении K1L, в и гене (Zhou и др., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190) или в левом конце генома вирус коровьей оспы, где множество непосредственных или сконструированных делеций были уже описаны в литературных источниках (Altenburger и др., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Moss и др. 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali и др., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus и др., 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus и др., 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus и др., 1991, Virol. 180, 406-410).

При использовании MVA, которая кодирует антиген нуклеиновая кислота может быть инсерцирована в любую из идентифицированных делеций от I к VII, так же как в местоположении D 4R, но вставка в удалении II или III является предпочтительной (Меуег и др., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-1038; Sutter и др., 1994, Vaccine 12, 1032-1040).

Используя вирус fowlpox, хотя вставку в пределах гена тимидин киназы можно определить, нуклеиновая кислота, которая кодирует антиген, является предпочтительно введенной в интергенную область, которая расположена между ORFs 7 и 9 (см., например, ЕР 314569 и US 51806755).

Предпочтительно, нуклеиновая кислота, которая кодирует антиген, для использования в данном изобретении, находится в форме, подходящей для ее экспрессии в клетке хозяине или организме, и это означает то, что последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антиген (например, полипептид Е6 и/или последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид Е7), помещена под контроль одной или более регуляторных последовательностей, необходимых для экспрессии в клетке хозяине или организме. В том значении, как используется в данном описании, термин "регуляторная последовательность" относится к любой последовательности, которая обеспечивает, привносит или модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты в данной клетке хозяине, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию, стабилизацию и/или транспортирование нуклеиновой кислоты или одной из ее производных (то есть м РНК) в клетку хозяина. Это будет высоко оценено специалистами, которые являются квалифицированными в данной отрасли техники, потому что выбор регулирующих последовательностей может зависеть от факторов, таких как клетка хозяин, вектор и уровень желательной экспрессии.

Промотор имеет особое значение, и существующее изобретение охватывает использование конститутивных промоторов, которые непосредственно обеспечивают экспрессию нуклеиновой кислоты во многих типах клеток хозяина, и тех, которые непосредственно обеспечивают экспрессию только в специфичных клетках хозяина или в ответ на специфические явления или внешние факторы (например, температура, пищевые добавки, гормоны или другие лиганды). Подходящие промоторы широко описаны в литературных источниках, можно указать, более точно, такие вирусные промоторы, как RSV, SV40, CMV и промоторы MLP. Среди преимущественных промоторов для использования в поксвирусных векторах, но, не ограничиваясь ими, - это промоторы вируса коровьей оспы 7.5К, H5R, ТК, р28, р11 и K1L, химерные промоторы между ранними и поздними поксвирусными промоторами, а также, такие, как синтетические промоторы, такие как промоторы, которые описаны в Chakrabarti и др. (1997, Biotechniques 23, 1094-1097), Hammond и др. (1997, J. Virological Methods 66, 135-138) и Kumar и Boyle (1990, Virology 179, 151-158).

Специалисты, которые являются квалифицированными в данной отрасли техники, будут ценить то, что регулирующие элементы, которые контролируют экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению, могут далее включать дополнительные элементы для последующей инициации, регулирования и/или терминации транскрипции (например, поли А последовательности терминации транскрипции), транспорта м РНК (например, ядерные последовательности сигнальной локализации), процессинга (например, сплайсирующие сигналы), и стабилизации (например, интроны и некодирующие 5' и 3' последовательности), трансляции (например, сигнальные пептиды, пропептиды, трехсторонние лидерные последовательности, связывающие участки рибосомы,