Способ и набор для получения образца для применения в амплификации нуклеиновой кислоты

Способ и набор для получения образца для применения в амплификации нуклеиновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу и набору для получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты.

Уровень техники

Методы амплификации нуклеиновой кислоты, в том числе ПЦР и методы изотермальной петлевой амплификации (LAMP), стали применяться во многих областях биологии, таких как молекулярная биология и медицина, и широко используются для характеристики ДНК, в пищевых анализах, в анализах санитарного состояния окружающей среды и анализах растений.

Если образец является жидким, то он может быть непосредственно использован в качестве образца нуклеиновой кислоты для амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты, однако так как в биологическом образце мишеневая нуклеиновая кислота находится в клетках, то для получения образца нуклеиновой кислоты для амплификации биологический образец должен быть растворен с использованием клеточного лизата (например, щелочного раствора или поверхностно-активного вещества), а нуклеиновая кислота должна быть извлечена из клеток.

Например, к биологическому образцу может быть добавлен раствор, содержащий додецилсульфат натрия, и смесь может быть нагрета для денатурации белка, или к нему может быть добавлен водный раствор гидроксида натрия для разрушения клеточных мембран и для извлечения нуклеиновой кислоты для использования в качестве образца нуклеиновой кислоты для амплификации.

Мокрота и слюна являются очень важными биологическими образцами, используемыми для диагностики болезней легких, в том числе туберкулеза.

Однако, как правило, трудно добиться стабильной амплификации нуклеиновой кислоты из мокроты или слюны, и, следовательно, определение Mycobacterium в мокроте или слюне для диагностики обычно осуществляют путем растворения образца мокроты или слюны в гидроксиде натрия или аналогичного вещества и проведения разделения методом центрифугирования, сбора клеток Mycobacterium в качестве осадка и их культивирования (патентный документ 1).

При получении образца нуклеиновой кислоты для амплификации из другого биологического образца, нежели мокрота или слюна, такие вещества, как белки, полисахариды и липиды, выделяют вместе с нуклеиновой кислотой из клеток, частично или полностью ингибируют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты и, таким образом, получают невоспроизводимые результаты, или наличие или уровень экспрессии мишеневой нуклеиновой кислоты не может быть точно определен.

Кроме того, при получении образца нуклеиновой кислоты для амплификации из биологического образца используемое поверхностно-активное вещество может частично или полностью ингибировать реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, если оно присутствует в образце нуклеиновой кислоты для амплификации в концентрации, превышающей некоторое значение, и, следовательно, для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты образец нуклеиновой кислоты должен быть разбавлен.

По указанным причинам диагностика пациентов с помощью амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты и проведение точных анализов пищевых продуктов или санитарного состояния окружающей среды, а также животных и растений крайне затруднительны.

[Патентный документ 1] патентная заявка Японии HEI №9-173065, без проведения экспертизы по существу

Описание изобретения

Задачи, решаемые с помощью изобретения

Целью настоящего изобретения является удаление веществ, содержащихся в биологических образцах и экстрактах нуклеиновой кислоты, которые могут ингибировать амплификацию нуклеиновой кислоты, и получение возможности удобного и точного определения присутствия мишеневой нуклеиновой кислоты или уровня экспрессии мишеневого гена в биологическом образце с помощью способов амплификации нуклеиновой кислоты с использованием фермента.

Способы решения задач

Для достижения вышеуказанной задачи предложен способ получения образца в амплификации нуклеиновой кислоты, который будет использоваться в амплификации нуклеиновой кислоты биологического образца, причем способ включает стадию экстракции, на которой для получения экстракта нуклеиновой кислоты к биологическому образцу добавляют реагент для экстракции нуклеиновой кислоты, и стадию очистки, на которой экстракт нуклеиновой кислоты взаимодействует с цеолитом с получением образца нуклеиновой кислоты для амплификации, подходящего для амплификации нуклеиновой кислоты, что позволяет проводить высокочувствительную детекцию нуклеиновой кислоты.

Термин «цеолит» обозначает соли алюмокремниевых кислот, содержащие микропоры в их кристаллах, и они обладают базовой решеткой, являющейся трехмерной каркасной структурой тетраэдров SiO₄ и AlO₄, связанных общими атомами кислорода. Цеолиты в кристаллах содержат катионы, такие как ионы щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммонийные ионы или ионы водорода, и «протонированными цеолитами» являются цеолиты, содержащие в кристаллах ионы водорода. Цеолиты с «морденитной кристаллической структурой» являются цеолитами, которые имеют кристаллическую структуру, отображающую гексагональную колончатую решетчатую структуру. Предпочтительными цеолитами являются цеолиты с отношением S/A (отношение содержания кремния/алюминия) 20 или более, и более предпочтительны цеолиты с отношением S/А 39 или более.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вещества, которые ингибируют амплификацию нуклеиновой кислоты в биологических образцах и экстрактах нуклеиновой кислоты, эффективно адсорбируются на цеолите, тогда как сама мишеневая нуклеиновая кислота, которая используется в качестве матрицы для реакции амплификации нуклеиновой кислоты, не адсорбируется на цеолите. Термин «адсорбируется» означает, что вещество включается за счет связывания в поверхность цеолита или в его микропоры.

Так как вышеописанные способы позволяют удалить из образца нуклеиновой кислоты для амплификации вещества, ингибирующие амплификацию нуклеиновой кислоты, присутствующие в биологическом образце или экстракте нуклеиновой кислоты, то можно получить образец нуклеиновой кислоты для амплификации, с помощью которого будет возможно осуществить воспроизводимую детекцию мишеневой нуклеиновой кислоты даже из биологических образцов, с помощью которых обычно трудно амплифицировать нуклеиновую кислоту.

Предпочтительно реагент для экстракции нуклеиновой кислоты является реагентом, содержащим поверхностно-активное вещество и/или щелочь, причем предпочтительным поверхностно-активным веществом является анионное поверхностно-активное вещество.

Предпочтительно анионным поверхностно-активным веществом является по крайней мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из солей алкилсерной кислоты, солей эфиров серной кислоты и солей алкилбензолсерной кислоты, где наиболее предпочтительным является додецилсульфат натрия.

Соли алкилсерной кислоты, соли эфиров серной кислоты и соли алкилбензолсерной кислоты, являясь анионными поверхностно-активными веществами, могут увеличивать эффективность экстракции нуклеиновой кислоты из биологических образцов, тем самым давая эффективное удаление из образцов нуклеиновой кислоты для амплификации с использованием цеолита.

Стадия экстракции предпочтительно является стадией, на которой к биологическому образцу добавляют реагент для экстракции нуклеиновой кислоты с добавлением неорганической соли, для получения экстракта нуклеиновой кислоты.

Стадия очистки предпочтительно является стадией, на которой к экстракту нуклеиновой кислоты добавляют цеолит и смесь перемешивают и затем цеолит отделяют центрифугированием или фильтрацией с получением образца нуклеиновой кислоты для амплификации.

Стадия очистки также предпочтительно является стадией, на которой экстракт нуклеиновой кислоты пропускают через колонку для удаления, наполненную цеолитом, для удаления веществ, адсорбирующихся на цеолите, например веществ, которые ингибируют высокочувствительную детекцию нуклеиновой кислоты, с получением образца нуклеиновой кислоты для амплификации.

Использование колонки для удаления, наполненной цеолитом, исключает необходимость стадии удаления цеолита из образца нуклеиновой кислоты для амплификации с помощью разделения центрифугированием, и, следовательно, такое использование может сократить стадию получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты, также предотвратить потерю образца нуклеиновой кислоты для амплификации.

Способ получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты позволяет проводить получение образца нуклеиновой кислоты для амплификации, подходящего для амплификации нуклеиновой кислоты, независимо от того, является ли биологический образец кровью, спинномозговой жидкостью, мочой, калом, мокротой, слюной, выделением из носа или мазком, без устранения вязкости или разбавления веществ, ингибирующих амплификацию нуклеиновой кислоты.

Предпочтительно цеолит является протонированным цеолитом, и предпочтительно он имеет морденитную кристаллическую структуру.

С помощью протонированного цеолита можно в достаточной степени удалить анионные поверхностно-активные вещества из образцов нуклеиновой кислоты для амплификации, а морденитная кристаллическая структура позволяет одновременно проводить обессоливание и нейтрализацию образца нуклеиновой кислоты для амплификации.

Изобретение также относится к набору для получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты, для использования в вышеописанном способе получения, где набор содержит реагент для экстракции нуклеиновой кислоты и цеолит.

Таким образом, указанный набор для получения позволяет удалять вещества, ингибирующие амплификацию нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в биологическом образце или экстракте нуклеиновой кислоты, он легко позволяет получить образец нуклеиновой кислоты для амплификации, возможность осуществить воспроизводимую детекцию мишеневой нуклеиновой кислоты даже из биологических образцов, с помощью которых трудно амплифицировать нуклеиновую кислоту.

Реагент для экстракции нуклеиновой кислоты в вышеописанном наборе для получения предпочтительно является реагентом, содержащим поверхностно-активное вещество и/или щелочь, причем предпочтительным поверхностно-активным веществом является анионное поверхностно-активное вещество. Предпочтительно цеолит является протонированным цеолитом с морденитной кристаллической структурой.

Если цеолит является протонированным и имеет морденитную кристаллическую структуру, то можно эффективно удалять анионные поверхностно-активные вещества из образцов нуклеиновой кислоты для амплификации и одновременно проводить обессоливание и нейтрализацию.

Таким образом, набор для получения по изобретению позволяет получить образец нуклеиновой кислоты для амплификации, подходящий для высокочувствительной детекции нуклеиновой кислоты, с возможностью использовать его в качестве составного реагента в наборе для детекции амплификации нуклеиновой кислоты, и если все или часть реагентов в наборе для детекции амплификации нуклеиновой кислоты являются сухими реагентами, то можно обеспечить высокочувствительную детекцию и значительно улучшить функциональность при исследовании генов.

Эффект изобретения

Изобретение обеспечивает возможность удаления веществ, ингибирующих амплификацию нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в биологическом образце или экстракте нуклеиновой кислоты, из образца нуклеиновой кислоты для амплификации и получить образец нуклеиновой кислоты для амплификации, который позволяет осуществлять воспроизводимую детекцию мишеневой нуклеиновой кислоты даже из биологических образцов, которые обычно не позволяют легко амплифицировать нуклеиновую кислоту. Согласно изобретению, можно получить образец нуклеиновой кислоты для амплификации, который подходит для амплификации нуклеиновой кислоты, независимо от того, является ли биологический образец кровью, спинномозговой жидкостью, мочой, калом, мокротой, слюной, выделением из носа или мазком, без необходимости устранения вязкости или разбавления веществ, ингибирующих амплификацию нуклеиновой кислоты. Также изобретение обеспечивает возможность удовлетворительно удалять анионные поверхностно-активные вещества из образцов нуклеиновой кислоты для амплификации и одновременно проводить обессоливание и нейтрализацию образцов нуклеиновой кислоты для амплификации.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 является изображением в перспективе колонки для удаления, наполненной цеолитом.

Фиг.2 является графиком, показывающим результаты определения адсорбции мишеневой нуклеиновой кислоты на цеолите (HSZ-690HOA от Tosoh Corp.).

Фиг.3 является графиком, показывающим результаты определения эффекта цеолита по нейтрализации гидроксида натрия.

Фиг.4 является графиком, показывающим результаты определения эффекта цеолита по удалению додецилсульфата натрия.

Фиг.5 является графиком, показывающим результаты определения эффекта цеолита по обессоливанию.

Фиг.6 является графиком, показывающим результаты определения влияния получения биологического образца и состава экстракта нуклеиновой кислоты на амплификацию мишеневой нуклеиновой кислоты.

На Фиг.7 приведены результаты амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты, полученные путем изотермальной петлевой амплификации, с использованием образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного из крови за счет обработки цеолитом (образец, обработанный цеолитом), и образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного без обработки цеолитом (образец, необработанный цеолитом).

На Фиг.8 приведены результаты (1) анализа по определению того, как на реакцию амплификации нуклеиновой кислоты влияет введение количества образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного при обработке цеолитом, в реакционную смесь изотермальной петлевой амплификации (25 мкл).

На Фиг.9 приведены результаты (2) анализа по определению того, как на реакцию амплификации нуклеиновой кислоты влияет введение количества образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного при обработке цеолитом, в реакционную смесь изотермальной петлевой амплификации (25 мкл).

На Фиг.10 приведены результаты амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты, полученные посредством ПЦР, с использованием образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного при обработке цеолитом (образец, обработанный цеолитом), и образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного без обработки цеолитом (образец, необработанный цеолитом).

На Фиг.11 приведены результаты амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты, полученные посредством изотермальной петлевой амплификации в реальном времени, с использованием образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного при обработке цеолитом (образец, обработанный цеолитом), и образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного без обработки цеолитом (образец, необработанный цеолитом).

Расшифровка символов

1: Пробирка для центрифугирования, 3: цеолит, 5: кассета, 7: мембрана, 10: колонка для удаления.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Ниже приведено подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения.

Способ получения по изобретению является способом получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты, который будет использоваться в амплификации нуклеиновой кислоты биологического образца, где способ включает стадию экстракции, на которой к биологическому образцу добавляют реагент для экстракции нуклеиновой кислоты с получением экстракта нуклеиновой кислоты, и стадию очистки, на которой экстракт нуклеиновой кислоты взаимодействует с цеолитом с получением образца нуклеиновой кислоты для амплификации, подходящего для амплификации нуклеиновой кислоты, что позволяет осуществить высокочувствительную детекцию нуклеиновой кислоты.

Термин «цеолит» обозначает соли алюмокремниевых кислот, содержащие микропоры в их кристаллах, и они обладают базовой решеткой, являющейся трехмерной каркасной структурой тетраэдров SiO₄ и AlO₄, связанных общими атомами кислорода. Цеолиты в кристаллах содержат катионы, такие как ионы щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммонийные ионы или ионы водорода, и «протонированными цеолитами» являются цеолиты, содержащие в кристаллах ионы водорода. Цеолиты с «морденитной кристаллической структурой» являются цеолитами, которые имеют кристаллическую структуру, отображающую гексагональную колончатую решетчатую структуру. Предпочтительными цеолитами являются цеолиты с отношением S/A (отношение содержания кремния/алюминия) 20 или более, и более предпочтительны цеолиты с отношением S/А 39 или более.

Используемый на протяжении настоящего описания термин «биологический образец» означает препарат для получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты, который представляет собой целые либо части биологических клеток, тканей или органов, и он включает препараты, непосредственно полученные из тела, а также препараты, полученные из окружающей среды, такие как вода, масло или воздух. Термин «образец нуклеиновой кислоты для амплификации» означает образец в виде раствора, содержащий мишеневую нуклеиновую кислоту, полученный для амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты.

Например, биологическим образцом может быть кровь, спинномозговая жидкость, моча, кал, мокрота, слюна, выделение из носа или мазок.

Предпочтительно для экстракции нуклеиновой кислоты на стадии экстракции к биологическому образцу добавляют реагент для экстракции нуклеиновой кислоты, содержащий анионное поверхностно-активное вещество и/или щелочь, и анионное поверхностно-активное вещество предпочтительно является по крайней мере одним веществом, выбранным из группы, состоящей из солей алкилсерной кислоты, солей алкильных эфиров серной кислоты и солей алкилбензолсерной кислоты.

Примеры солей алкилсерной кислоты включают додецилсульфат натрия, децилсульфат натрия и лаурилсульфат натрия, примеры солей алкильных эфиров серной кислоты включают лаурилэфирсульфат натрия, полиоксиэтиленлаурилэфирсульфат натрия и полиоксиэтиленмиристилэфирсульфат натрия, и примеры солей алкилбензолсерной кислоты включают додецилбензолсульфат натрия, этилбензолсульфат натрия и бутилбензолсульфат натрия, среди которых предпочтительным является додецилсульфат натрия.

В качестве примеров щелочей можно назвать гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид лития, гидроксид кальция и аммиачную воду, где особенно предпочтительным является гидроксид натрия.

Способ проведения стадии экстракции может быть основан на методе кипячения или методе щелочного растворения, которые легко могут быть проведены специалистом в данной области техники.

В частности, при методе кипячения биологический образец помещают в микротрубку и в случае жидкого биологического образца (кровь, спинномозговая жидкость, моча, кал, мокрота, слюна, выделение из носа или мазок) непосредственно добавляют реагент для экстракции нуклеиновой кислоты, содержащий анионное поверхностно-активное вещество, и смесь кипятится в течение 15 минут, или его оставляют нагреваться в течение 10-15 минут в нагревательном устройстве при 95°С (далее обозначена как «термическая обработка»). Если биологический образец является твердым (таким как ткань или орган), то к микротрубке, содержащей биологический образец, может быть добавлено эквивалентное количество стерилизованной воды, и смесь быстро подвергают повторяющимся циклам заморозки и оттаивания или физически измельчают с использованием пипетки или шпателя и затем перед термической обработкой добавляют реагент для экстракции нуклеиновой кислоты, содержащий анионное поверхностно-активное вещество.

Также реагент для экстракции нуклеиновой кислоты может быть добавлен к суспензии биологического образца в стерилизованной воде или буферном растворе и подвергнут дополнительной обработке.

В случае биологических образцов, легко поддающихся экстракции, может быть добавлена стерилизованная вода и проведена тепловая обработка без добавления реагента для экстракции нуклеиновой кислоты, содержащего анионное поверхностно-активное вещество.

С другой стороны, при осуществлении способа щелочного растворения биологический образец помещают в микротрубку и, если биологический образец является жидким, непосредственно добавляют реагент для экстракции нуклеиновой кислоты, содержащий щелочь, и перед термической обработкой смесь встряхивают до растворения клеток.

Если биологический образец является твердым, то к микротрубке, содержащей биологический образец, может быть добавлено эквивалентное количество стерилизованной воды, и смесь быстро подвергают повторяющимся циклам заморозки и оттаивания или физически измельчают с использованием пипетки или шпателя аналогичным образом, как описано выше, и затем перед термической обработкой добавляют реагент для экстракции нуклеиновой кислоты, содержащей щелочь, и смесь встряхивают до растворения ткани или органа.

Для увеличения эффективности экстракции к реагенту для экстракции нуклеиновой кислоты, содержащей щелочь, для экстракции нуклеиновой кислоты из биологического образца может быть добавлено анионное поверхностно-активное вещество.

На стадии экстракции для получения экстракта нуклеиновой кислоты предпочтительно добавлять реагент для экстракции нуклеиновой кислоты к биологическому образцу вместе с неорганической солью. Условия добавления неорганической соли являются условиями, при которых неорганическую соль добавляют к биологическому образцу/смеси реагентов для экстракции нуклеиновой кислоты с использованием раствора неорганической соли в буферном или аналогичном растворе для разбавления биологического образца, или с использованием реагента для экстракции нуклеиновой кислоты, содержащего неорганическую соль, или с использованием комбинации обоих методов для экстракции нуклеиновой кислоты. Методы экстракции нуклеиновой кислоты из биологического образца могут быть проведены с использованием вышеуказанных методов при условии добавления неорганической соли.

Примеры неорганических солей включают натриевые соли и калиевые соли, где особенно предпочтительными являются хлорид натрия и хлорид калия. Количество добавляемой соли предпочтительно составляет конечную концентрацию 5-100 мМ и более предпочтительно 15-30 мМ в смеси биологического образца и реагента для экстракции нуклеиновой кислоты.

На стадии очистки экстракт нуклеиновой кислоты взаимодействует с цеолитом для удаления из экстракта нуклеиновой кислоты веществ, которые адсорбируются на цеолите, и предпочтительно цеолит является протонированным цеолитом и более предпочтительно обладает морденитной кристаллической структурой. Термин «адсорбируется» означает, что вещество включается за счет связывания в поверхность цеолита или в его микропоры.

Обобщенно термин «цеолит» обозначает соли алюмокремниевых кислот, содержащие микропоры в их кристаллах, и они обладают базовой решеткой, являющейся трехмерной каркасной структурой тетраэдров SiO₄ и AlO₄, связанных общими атомами кислорода. Цеолиты в кристаллах содержат катионы, такие как ионы щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммонийные ионы или ионы водорода, и «протонированными цеолитами» являются цеолиты, содержащие в кристаллах ионы водорода. Цеолиты с «морденитной кристаллической структурой» являются цеолитами, которые имеют кристаллическую структуру, отображающую гексагональную колончатую решетчатую структуру. Предпочтительными цеолитами являются цеолиты с отношением S/A (отношение содержания кремния/алюминия) 20 или более и более предпочтительны цеолиты с отношением S/А 39 или более.

В первом способе стадии очистки цеолит добавляют к экстракту нуклеиновой кислоты и смешивают с ним и затем цеолит выделяют разделением методом центрифугирования или фильтрацией с получением образца нуклеиновой кислоты для амплификации. Данный способ позволяет удалить вещества, которые адсорбируются на цеолите из экстракта нуклеиновой кислоты, таким образом, полученный раствор может быть использован в качестве образца нуклеиновой кислоты для амплификации.

Во втором способе стадии очистки экстракт нуклеиновой кислоты пропускают через колонку для удаления, наполненную цеолитом, для удаления веществ, адсорбирующихся на цеолите, для получения образца нуклеиновой кислоты для амплификации. Данный способ позволяет удалить из экстракта нуклеиновой кислоты вещества, которые ингибируют детекцию нуклеиновой кислоты с высокой чувствительностью, таким образом, раствор, элюируемый из колонки для удаления, может быть использован в качестве образца нуклеиновой кислоты для амплификации.

Вещества, которые ингибируют высокочувствительную детекцию нуклеиновой кислоты, являются ингибирующими компонентами, такими как соли препарата или щелочи, поверхностно-активные вещества и вода из реагента для экстракции.

Фиг.1 является изображением в перспективе колонки для удаления, наполненной цеолитом.

Колонка для удаления 10 включает кассету 5, наполненную цеолитом 3, удерживаемым в пробирке для центрифугирования 1. Кассета 5 прочно прикреплена к пробирке для центрифугирования 1 около центра между отверстием и нижней частью пробирки для центрифугирования и имеет такую структуру, что наносимый через отверстие пробирки для центрифугирования 1 экстракт нуклеиновой кислоты не может избежать контакта с цеолитом, наполняющим кассету 5.

В нижней части кассеты 5 предусматривается мембрана 7, и она разработана таким образом, что даже если колонка для удаления 10 будет центрифугироваться в центрифуге, то цеолит 3 будет удерживаться кассетой 5 и не будет падать на нижнюю часть пробирки для центрифугирования 1. Например, мембрана 7 может быть фильтровальной бумагой, стекловолокном, волокнистым нетканым материалом, вискозным волокном, синтетическими волокнами, фторсодержащей смолой и т.п. Вес загрузки цеолита 3 может быть приблизительно 300 мг для биологического образца до 100 мкл, и он может быть подходящим образом скорректирован в зависимости от типа и количества биологического образца.

Примеры способов удаления веществ, адсорбирующихся на цеолите 3 из экстракта нуклеиновой кислоты, с использованием колонки для удаления 10, включают способ, при котором экстракт нуклеиновой кислоты наносят на колонку для удаления 10 и оставляют до самостоятельного прохождения сверху вниз, и способ центрифугирования колонки для удаления в центрифуге, и при использовании каждого способа образец нуклеиновой кислоты для амплификации, из которого были удалены вещества, адсорбирующиеся на цеолите 3, может быть получен в нижней части колонки для удаления 10.

Различные типы реагентов, необходимые для осуществления способа получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, могут быть расфасованы для использования в виде набора для получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты или в виде набора для детекции амплификации нуклеиновой кислоты. Другими словами, также обеспечивается набор для получения образца для амплификации нуклеиновой кислоты и набор для детекции амплификации нуклеиновой кислоты, содержащие цеолит и реагент для экстракции нуклеиновой кислоты, включающий анионное поверхностно-активное вещество и/или щелочь.

Конкретные примеры анионного поверхностно-активного вещества, щелочи и цеолита были указаны выше.

Предпочтительно цеолит является протонированным и обладает морденитной кристаллической структурой, и вместо цеолита набор может содержать наполненную колонку для удаления 10.

Также если все или часть реагентов в каждом наборе представлены в лиофилизированном виде в необходимых количествах в качестве сухих реагентов, то можно достичь высокочувствительной детекции и также значительно улучшить функциональность при исследовании генов.

Примеры

Далее настоящее изобретение будет более подробно пояснено с использованием примеров, причем следует понимать, что изобретение не ограничивается данными примерами.

(Пример 1) Определение адсорбции мишеневой нуклеиновой кислоты на цеолите

Для удаления веществ с использованием цеолита, которые ингибируют реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, которые присутствуют в экстракте нуклеиновой кислоты, полученном из биологического образца (вещества, ингибирующие амплификацию нуклеиновой кислоты), важно, чтобы мишеневая нуклеиновая кислота, которая будет использована в качестве матрицы, не адсорбировалась на цеолите. Поэтому три различных типа циолита анализировали на адсорбцию мишеневой нуклеиновой кислоты, для дальнейшего использования в качестве матрицы.

Сначала в микротрубку добавляют 80 мкл стерилизованной воды и 100 мкл 2 × реагента для экстракции нуклеиновой кислоты (0,4 М NaOH, 1% додецилсульфат натрия) и смесь нагревают при 95°С в течение 15 минут и затем для охлаждения оставляют при комнатной температуре на 5 минут, после чего добавляют 20 мкл раствора мишеневой нуклеиновой кислоты. В качестве раствора мишеневой нуклеиновой кислоты используют раствор геномной ДНК (100 копий/мкл), экстрагированный из культивированной Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

Далее в микротрубку, содержащую раствор мишеневой нуклеиновой кислоты, добавляют 300 мг водной суспензии цеолита и содержимое перемешивают переворачиванием микротрубки, после чего смесь оставляют при комнатной температуре на 5 минут и полученную после центрифугирования надосадочную жидкость используют в качестве образца нуклеиновой кислоты для амплификации (образец, обработанный цеолитом), амплифицируя 10 мкл соответствующей мишеневой нуклеиновой кислоты с использованием метода изотермальной петлевой амплификации.

Используют цеолит 3 типов: HSZ-690HOA (протонированная форма и морденитная форма, производство Tosoh Corp.), HSZ-940HOA (протонированная форма и бета-форма, производство Tosoh Corp.) и HSZ-980HOA (протонированная форма и бета-форма, производство Tosoh Corp.) и испытывают каждый тип цеолита.

Для анализа, амплификацию мишеневой нуклеиновой кислоты проводят аналогичным образом посредством изотермальной петлевой амплификации с использованием вместо раствора мишеневой нуклеиновой кислоты образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного за счет добавления эквивалентного количества стерилизованной воды (отрицательный контроль), и образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного простым добавлением 9 мкл стерилизованной воды к 1 мкл раствора мишеневой нуклеиновой кислоты (содержащий 100 копий геномной ДНК: положительный контроль).

Для амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты изотермальной петлевой амплификацией используют указанный далее набор праймеров, используемая при изотермальной петлевой амплификации реакционная смесь имеет указанный далее состав, проводят при 67°С в течение 60 минут, и мутность, которая увеличивается по мере амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты, измеряется в реальном времени посредством турбидиметра (LA-200, производство Teramecs).

<Набор праймеров для метода изотермальной петлевой амплификации с использованием в качестве мишеневой нуклеиновой кислоты гена M. Tuberculosis Гираза В>

Праймер Гираза B FIP: 5'-gcggttgatgtgtttcacgcacaaagttaagagccg-3' (SEQ ID NO: 1)

Праймер Гираза B BIP: 5'-gcgattcatagcagcatcgttccattgcatcgcgatctccac-3' (SEQ ID NO: 2)

Праймер Гираза B F3: 5'-cgcagccgaatccact-3' (SEQ ID NO: 3)

Праймер Гираза B В3: 5'-cgactccgaatacccgg-3' (SEQ ID NO: 4)

Праймер Гираза B LF: 5'-gaagtccaccaggcc-3' (SEQ ID NO: 5)

Праймер Гираза B LB: 5'-tttccggcaagggcacc-3' (SEQ ID NO: 6)

<Состав реакционной смеси изотермальной петлевой амплификации (25 мкл)>

Заданное количество образца нуклеиновой кислоты для амплификации

20 мМ Трис-HCl (рН 8,8)

10 мМ KCl

10 мМ (NH₄)₂SO₄

8 мМ MgSO₄

0,1% Твин 20

5,6 мМ дНТФ

1,6 мкл FIP праймер

1,6 мкл BIP праймер

0,4 мкл F3 праймер

0,4 мкл B3 праймер

0,8 мкл LF праймер

0,8 мкл LB праймер

16 единиц Bst полимеразы

1 мкл FD (кальцеин)

1,6% Декстран T40

Фиг.2 является графиком, показывающим результаты определения адсорбции мишеневой нуклеиновой кислоты на цеолите (HSZ-690HOA от Tosoh Corp.). Вертикальная ось отображает мутность реакционной смеси изотермальной петлевой амплификации, и горизонтальная ось отображает время реакции.

В результате, время начала амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты с использованием образца нуклеиновой кислоты для амплификации, полученного с добавлением цеолита (HSZ-690HOA от Tosoh Corp.) (образец, обработанный цеолитом), аналогично положительному контролю, показывая, что обработка цеолитом не влияет на время начала амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты. Результат являлся по сути аналогичным для всех использованных цеолитов: HSZ-690HOA (протонированная форма и морденитная форма, производство Tosoh Corp.), HSZ-940HOA (протонированная форма и бета-форма, производство Tosoh Corp.) и HSZ-980HOA (протонированная форма и бета-форма, производство Tosoh Corp.), следовательно, тип используемого цеолита не влияет на время начала амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты.

Если вместо раствора мишеневой нуклеиновой кислоты был использован образец нуклеиновой кислоты для амплификации, полученный с добавлением эквивалентного количества стерилизованной воды (отрицательный контроль), то в течение 60 минут реакционного времени не было обнаружено амплификации мишеневой нуклеиновой кислоты.

Данные результаты показывают, что нуклеиновая кислота в образце нуклеиновой кислоты для амплификации в основном не адсорбируется на цеолите.

(Пример 2) Эффект щелочной нейтрализации реагента для экстракции нуклеиновой кислоты и эффект цеолита по удалению анионного поверхностно-активного вещества

Далее было исследовано, может ли обработка цеолитом удалить вещества, ингибирующие амплификацию нуклеиновой кислоты, присутствующие в реагентах для экстракции нуклеиновой кислоты.

Во-первых, для определения возможности нейтрализации щелочей, присутствующих в реагенте для экстракции нуклеиновой кислоты, за счет обработки цеолитом, 300 мг водной суспензии цеолита (HSZ-690HOA от Tosoh Corp.) добавляют к 6 различным растворам, указанным далее: Образцам №№1-6, содержащим 0,2-0,4 М гидроксида натрия, и смешивают переворачиванием и затем измеряют рН надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования (рН после обработки цеолитом), и сравнивают с рН до обработки цеолитом (рН перед обработкой цеолитом).

<Составы 6 различных растворов, содержащие 0,2-0,4 М гидроксида натрия>

Образец №1: 0,4 М NaOH

Образец №2: 0,4 М NaOH, 0,5% додецилсульфата натрия

Образец №3: 0,4 М NaOH, 0,5% додецилсульфата натрия, 75 мМ NaCl

Образец №4: 0,2 М NaOH

Образец №5: 0,2 М NaOH, 0,5% додецилсульфата натрия

Образец №6: 0,2 М NaOH, 0,5% додецилсульфата натрия, 75 мМ NaCl

Фиг.3 является графиком, показывающим результаты определения эффекта цеолита по нейтрализации гидроксида натрия. Вертикальная ось отображает рН, и горизонтальная ось отображает № Образца, где белые кружочки показывают рН перед обработкой цеолитом и черные кружочки показывают рН после обработки цеолитом.

В результате было обнаружено, что за счет обработки цеолитом рН 6 различных растворов, содержащих 0,2-0,4 М гидроксида натрия, было понижено до примерно нейтрального (рН 7-8), и снижение рН практически не зависит от 0,5% додецилсульфата натрия или 75 мМ NaCl.

Данные результаты говорят о том, что цеолит обладает эффектом нейтрализации щелочных компонентов, содержащихся в регентах для экстракции нуклеиновой кислоты.

Далее, для определения возможности удаления додецилсульфата натрия, присутствующего в реагенте для экстракции нуклеиновой кислоты, за счет обработки цеолитом, 80 мкл стерилизованной воды и либо 100 мкл 0,2% раствора додецилсульфата натрия либо 0,2% раствора додецилсульфата натрия, содержащего 75 мМ NaCl, добавляют в микротрубку и нагревают при 95°С в течение 15 минут и затем охлаждаю