Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях

Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях

Реферат

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для изучения количественного определения метаболитов углеводного обмена (гликогена, глюкозы, лактата) в биологических тканях (печени, скелетной и сердечной мышцах) трупов человека и животных для изучения метаболизма углеводов в организме и дальнейшей диагностики патологических состояний и причины смерти.

Известен способ определения метаболитов углеводного обмена (гликогена, глюкозы, молочной кислоты) в биологических тканях (печени, миокарде, скелетной мышце): "Судебно-медицинская оценка некоторых показателей углеводного обмена при смерти от острого отравления этиловым алкоголем и ишемической болезни сердца: Метод. рекоменд. / №583/01-02 бюро главн. суд.-мед. эксперт. М., 1994. 28 с.", заключающийся в том, что исследуют свежие биологические ткани, определение суммарного содержания глюкозы и гликогена проводят по методу Kemp, Kits van Heijningen, определение лактата (молочной кислоты) колориметрическим методом с параоксифенилом по Н.И.Мешковой и С.Е.Северину.

Недостатки известного способа.

Способ рассчитан на проведение анализа в первые сутки после взятия объектов исследования (в течение нескольких часов). Для практических целей необходим больший срок. В постмортальном периоде даже при хранении образцов в холодильнике происходит изменение показателей углеводного обмена, поэтому рекомендуется замораживать объекты исследования до момента исследования. Транспортировка объектов исследования в данных условиях представляет определенные трудности. Способ позволяет определять отдельно суммарное содержание глюкозы и гликогена в тканях и отдельно содержание лактата, то есть используются две пробы биологического материла. Способ не позволяет определять раздельное содержание глюкозы и гликогена. Используются неспецифические химические методы определения метаболитов углеводного обмена, результаты которых недостоверны.

Технический результат: определение ряда метаболитов углеводного обмена в одной пробе биологического материала, возможность исследования объектов в течение длительного периода после забора материала - количественный результат не зависит от длительности периода между забором объекта и проведением лабораторного исследования.

Указанные задачи достигаются путем предварительного фиксирования биологического материала в ацетоне с последующей пробоподготовкой и определением метаболитов углеводного обмена в фиксаторе (в ацетоне), при этом исследуют содержание метаболитов в межтканевой жидкости и самой ткани высокоспецифичными ферментными методами.

Способ осуществляют следующим образом: биологические ткани, например части печени, скелетной мышцы, миокарда и др. массой около 0,5-2,0 г, помещают в отдельные стеклянные или пластиковые флаконы с плотно закрывающимися пробками, заливают ацетоном для фиксирования объектов в объемном соотношении не менее 1:5. Исследования проводят через трое и более суток (для более полной фиксации).

Из флаконов аккуратно извлекают кусочки тканей, помещают на фильтровальную бумагу. Проводят измерение количества фиксатора (в мл). В предварительно маркированные фарфоровые тигли вносят фиксатор (по 0,5-1,0 мл) и проводят испарение в вытяжном шкафу. Для ускорения процесса используют электрический фен. Далее в тигли вносят соответствующий объем дистиллированной воды (0,5-1,0 мл) и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. В полученном растворе определяют метаболиты углеводного обмена ферментными методами.

Кусочки тканей освобождают на фильтровальной бумаге от остатка фиксатора в вытяжном шкафу, помещают в термостат (37°C) на 10-15 мин, проводят взвешивание. Навески тканей растирают с небольшим количеством кварцевого песка в фарфоровых ступках с добавлением 8% раствора трихлоруксусной кислоты. Гомогенизат сливают в мерные центрифужные пробирки. Отмечают уровень жидкости. Пробирки, прикрытые резиновыми пробками, ставят в термоблок или на кипящую водяную баню на 30 минут (при этом весь гликоген подвергают гидролизу до глюкозы). После охлаждения центрифугируют 10 минут при 1600 g. Нейтрализуют до рН 7-8 10% NaOH и доводят уровень жидкости до метки дистиллированной водой. Вновь центрифугируют 15 минут при вышеуказанных условиях. В надосадочной жидкости определяют содержание метаболитов углеводного обмена ферментными методами.

Количественное определение глюкозы проводят стандартным унифицированным глюкозооксидазным методом [Балаховский И.С.в кн. «Лабораторные исследования в клинике» под ред. Меньшикова В.В., 1987 г., с.230-234] (набор реагентов «Фотоглюкоза» фирмы «Импакт» - Москва). Количественное определение молочной кислоты (лактата) проводят энзиматическим колоримертическим методом (набор реагентов "Lactic Acid" фирмы "Vital Diagnostics SPb" - Санкт-Петербург).

Расчет проводят по формуле:

С - концентрация метаболита в образце (мкмоль/г);

D_ОП - оптическая плотность образца при исследуемой длине волны;

D_CT - оптическая плотность стандартного раствора исследуемого вещества;

C_CT - концентрация стандартного раствора (ммоль/л);

М - масса фиксированного объекта или навески (г);

V - объем раствора (мл), в котором гомогенизировали ткань или объем фиксатора (мл);

Р - коэффициент дополнительного разведения.

Пример

Определение метаболитов углеводного обмена в фиксаторе позволяет выявлять их количественное содержание в межтканевой жидкости, а в фиксированной ткани - в самой ткани.

Определение количественного содержания глюкозы в фиксаторе (ацетоне): С_ст=1,25 ммоль/л; D_ст=0,408

Объект исследования	М (г)	V (мл)	Р	D	С (мкмоль/г)
Печень	0,86	7,2	3	0,562	43,3
Скелетная мышца	0,55	7,1	-	0,087	3,4
Миокард	0,61	7,9	-	0,309	12,3

Определение количественного содержания лактата в фиксаторе (ацетоне): С_ст=3,33 ммоль/л; D_ст=0,369

Объект исследования	М (г)	V (мл)	Р	D	С (мкмоль/г)
Печень	0,86	7,2	-	0,244	18,4
Скелетная мышца	0,66	7,1	-	0,134	15,6
Миокард	0,61	7,9	3	0,180	63,1

Определение количественного содержания гликогена в тканях (в пересчете на глюкозу): С_ст=1,25 ммоль/л; D_ст=74

Объект исследования	М г)	V (мл)	Р	D	С (мкмоль/г)
Печень	0,25	6,0	3	0,380	91,4
Скелетная мышца	0,50	6,0	-	0,281	11,3
Миокард	0,50	6,0	-	0,385	15,4

Определение количественного содержания лактата в тканях: С_ст=3,33 ммоль/л; D_ст=0,280

Объект исследования	М (г)	V(мл)	Р	D	С (мкмоль/г)
Печень	0,25	6,0	-	0,077	22,0
Скелетная мышца	0,50	6,0	-	0,244	34,8
Миокард	0,50	6,0	3	0,196	83,9

Аналогично проводят исследования и других тканей, а также измерения других интересующих метаболитов, например пировиноградной кислоты.

Положительный эффект.

Способ определения метаболитов углеводного обмена в тканях позволяет проводить измерения ряда параметров в одном объекте исследования, результат не зависит от длительности периода между забором объекта и проведением лабораторного исследования.

Способ определения метаболитов углеводного обмена в биологических тканях путем гомогенизации биологической ткани, проведения гидролиза в растворе трихлоруксусной кислоты, центрифугирования и определения в супернатанте метаболитов углеводного обмена, отличающийся тем, что каждый кусочек биологической ткани перед исследованием помещают в отдельный флакон с плотно закрывающейся пробкой, заливают ацетоном в соотношении не менее 1:5, выдерживают в течение от 3-х суток и более, достают кусочек ткани, проводят измерение объема ацетона и массы кусочка биологической ткани, затем отбирают часть ацетона в фарфоровый тигель, проводят испарение ацетона в вытяжном шкафу, после этого добавляют такое же количество дистиллированной воды, тщательно перемешивают и определяют метаболиты углеводного обмена ферментными методами, далее берут навеску ткани, гомогенизируют в 8%-ном растворе трихлоруксусной кислоты, гомогенизат сливают в мерные центрифужные пробирки, отмечают уровень жидкости, проводят гидролиз в течение 30 мин, при этом весь гликоген подвергают гидролизу до глюкозы, центрифугируют, нейтрализуют 10%-ным раствором NaOH до рН 7, 8, доводят уровень жидкости до метки, вновь центрифугируют и определяют в надосадочной жидкости метаболиты углеводного обмена ферментными методами.