Лиганды для g-белок сопряженных рецепторов

Лиганды для g-белок сопряженных рецепторов

Реферат

Изобретение относится к получению библиотеки соединений, обогащенной агонистами и антагонистами представителей класса G-белок сопряженных рецепторов.

Представители класса мембранных белков G-белок сопряженных рецепторов (G-protein coupled receptors, GCPR) (также известные как рецепторы, содержащие семь трансмембранных доменов (7ТМ) или «змеевидные» (serpentine) рецепторы) опосредуют предачу сигналов в клетку (клеточный сигналинг) в ответ на чрезвычайно широкий спектр внеклеточных сигналов, включая гормоны, нейротрансмиттеры, цитокины и даже вещества из внешней среды, например, ответственные за запах и вкус. В ответ на взаимодействие лиганда с внеклеточной частью рецептора (обычно N-концевой «хвост» рецепторного белка), рецептор временно переходит в активированное состояние (это преобразование обычно обозначают как R+L→R*L, где R - неактивный рецептор, R* - активированный рецептор и L - лиганд).

Рецептор в активированной конформации (или R*) затем способен взаимодействовать с представителями семейства G-белков. G-белки представляют собой большое семейство внутриклеточных тримерных белков, связывающих нуклеотиды гуанина. После взаимодействия с активированным рецептором (вероятно, по механизму, называемому «ударное сопряжение» (collisional coupling)) G-белок обменивает связанный гуанозиндифосфат (ГДФ) на гуанозинтрифосфат (ГТФ). При этом тример G-белка в ГТФ-связанной форме диссоциирует, высвобождая субъединицу Gα и димер βγ. И Gα и βγ субъединицы затем могут участвовать в дальнейших сигнальных каскадах. Например, субъединица Gα может активировать фермент аденилатциклазу (АЦ), вырабатывающий циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) из аденозинтрифосфата. Субъединица βγ может активировать представителей семейства PI-3-киназ. В конечном счете эти сигналы могут привести к модулированию практически всех аспектов поведения клетки, от сокращения до подвижности, от изменения метаболизма до дальнейшей передачи сигналов.

После активации сигнал затем постепенно затухает под действием различных механизмов. ГТФ, связанный с субъединицей Gα, гидролизуется обратно в ГДФ, что приводит к реассоциации Gα и βγ субъединиц с формированием неактивного тримерного G-белка, связанного с ГДФ. Сам рецептор, сопряженный с G-белком, подвергается фосфорилированию в С-концевой внутриклеточной области, что предотвращает дальнейшее взаимодействие с G-белками. Наконец, связанный лиганд также может диссоциировать.

Этот общий сигнальный путь является настолько основополагающим и распространенным в физиологии млекопитающих, что до 40% лицензированных фармацевтических препаратов имеют среди своих молекулярных мишеней G-белок сопряженный рецептор. Аналогично бактерии эволюционировали таким образом, чтобы воздействовать на опосредованную G-белками передачу сигналов с целью нарушения физиологии и иммунитета хозяина: Vibrio cholerae (возбудитель холеры), например, производит белок, известный как холерный токсин, который необратимо ингибирует субъединицу Gα широко распространенных G-белков, называемых G_s. Аналогично Bordetella pertussis (возбудитель коклюша) производит белок, известный как токсин коклюша, который оказывает аналогичный эффект на другой G-белок, G_i.

Один из подходов для идентификации фармацевтических препаратов, воздействующих на передачу сигналов G-белок сопряженными рецептора, заключался в проведении скрининга библиотек большого числа произвольных соединений на способность препятствовать связыванию лиганда с препаратами мембран, содержащими рекомбинантные или очищенные G-белок сопряженные рецепторы. Для облегчения обнаружения связывания при проведении такого рода скринингов с высокой пропускной способностью были разработаны различные способы. Например, при анализе с помощью проксимальной сцинтилляции связывание меченного радиоактивным изотопом лиганда с рецептором приводит к сближению радионуклида с молекулой сцинтиллятора, связанной с рецептором, когда радионуклид распадается, испускается излучение, которое можно детектировать и количественно анализировать. Альтернативно лиганд может быть помечен флуоресцентной меткой, и связывание выявляют по поляризации флуоресценции (зависящей от уменьшения вращательных степеней свободы флуоресцентной метки в результате иммобилизации лиганда при связывании с рецептором).

Хотя применение этих способов в некоторых случаях имело успех, и были выявлены соединения, на основе которых впоследствии были разработаны фармацевтические препараты для человека (например, антагонист рецептора 5НТ₃ Ondansetron, применяемый для лечения мигрени), остается множество G-белок сопряженных рецепторов, для которых, несмотря на интенсивный скрининг в фармацевтической индустрии, было идентифицировано лишь несколько (или вообще не было идентифицировано) подходящих непептидных агонистов или соединений-антагонистов. Например, для семейства хемокиновых рецепторов, сопряженных с G-белком, выявлено незначительное количество специфических непептидных антагонистов и не выявлено агонистов. Поскольку хемокины играют центральную роль в иммунной регуляции, такие молекулы, как ожидают, должны быть чрезвычайно ценными фармацевтическими препаратами с иммуномодулирующими свойствами, полезными при лечении широкого спектра заболеваний, включающих воспалительную составляющую.

Возможный успех программ по проведению скрининга произвольных соединений лимитируют два фактора: во-первых, существует огромное количество соединений, которые требуется проверить, и даже с применением технологии с наибольшей пропускной способностью и наилучших подходов комбинаторной химии для создания разнообразных библиотек, может быть исследована лишь малая доля всех возможных молекулярных структур; во-вторых, даже если наилучшие образцы были успешно идентифицированы, коровые фармакофоры часто не пригодны для применения in vivo, поскольку выявленные соединения и их аналоги могут быть просто слишком токсичными.

Другая основная проблема при подходах «негативного скрининга» (где выявляют способность исследуемой библиотеки блокировать связывание меченого лиганда) заключается в том, что большинство из выявленных образцов являются антагонистами рецептора. Лишь немногие из образцов имеют какую-либо агонистическую активность (как предполагается, агонистическая активность требует способности связываться с рецептором и затем приводить его в активированное состояние, тогда как для антагониста требуется только способность связываться с рецептором или лигандом таким образом, чтобы предотвратить их взаимодействие), а создание аналогов исходных образцов антагонистов с преобразованием их в агонисты является бессистемным подходом с очень низкой степенью успеха.

Один из способов разрешения данной проблемы мог бы заключаться в замене библиотеки произвольных соединений на библиотеку молекулярных структур, которая имеет высокое содержание соединений, связывающихся с G-белок сопряженным рецептором как результат их предварительного отбора. Такая библиотека в идеальном случае должна содержать как антагонисты, так и агонисты в равном соотношении так, чтобы и те и другие можно было бы легко выявить. Также было бы идеально, если основные молекулярные структуры, представленные в указанной библиотеке, являлись нетоксичными.

Могут ли быть созданы такие реальные библиотеки, приближенные к таким идеальным, или нет, не ясно. Если да, то необходимо существование предполагаемого «идеального» субстрата для G-белок сопряженного рецептора, который бы взаимодействовал с различными G-белок сопряженными рецепторами вне зависимости от их природного сродства к определенным лигандам. Получая такой идеализированный субстрат с различными заместителями, его можно было бы делать более селективным по отношению к одному рецептору в классе по сравнению со всеми остальными.

В данной заявке мы описываем «идеальный» субстрат для G-белок сопряженного рецептора, который можно применять в качестве трехмерного каркаса, который может быть различным образом замещен с получением агонистов и/или антагонистов ряда различных G-белок сопряженных рецепторов. Изобретение также предусматривает создание библиотеки вышеуказанных замещенных соединений для применения в ходе скрининга с целью получения лигандов для G-белок сопряженных рецепторов с любым заданным набором характеристик. Таким образом, становится возможным «конструировать» лиганд для G-белок сопряженного рецептора с известным набором свойств (например, лиганд, который имеет агонистическую активность по отношению к рецепторам допамина D2 и в то же самое время антагонистичекую активность по отношению к 5HT_1a (рецепторам) серотонина). В противоположность этому, выявление таких смешанных лигандов из произвольных библиотек является редкой счастливой случайностью.

Изобретение предлагает соединения и их соли общей формулы (I)

где y представляет собой любое целое число от 1 до 8;

z представляет собой любое целое число от 0 до 8 при условии, что у и z не могут одновременно быть равными 1;

Х представляет собой -CO(Y)_k-(R¹)_n или SO₂(Y)_k-(R¹)_n;

k представляет собой 0 или 1;

Y представляет собой циклоалкил или полициклоалкил (такой как адамантил, адамантанметил, бициклооктил, циклогексил, циклопропил)

или Y представляет собой циклоалкенил или полициклоалкенил;

каждый R¹ независимо выбран из водорода или алкила, галоалкила, алкокси, галоалкокси, алкенила, алкинила, алкиламино, алкиламиноалкила, алкиламинодиалкила, имеющего заряд алкиламинотриалкила или имеющего заряд алкилкарбоксилата, содержащего от 1 до 20 атомов углерода,

или каждый R¹ независимо выбран из фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, оксиалкила, амино, аминоалкила, аминодиалкила, имеющего заряд аминотриалкила, или карбоксилатрадикала и

n - любое целое число от 1 до m, где m - максимальное количество заместителей, возможных в циклической группе Y.

Кроме того, R¹ может быть выбран из пептидного радикала, например, содержащего от 1 до 4 пептидных звеньев, соединенных пептидной связью (например, пептидный радикал, содержащий от 1 до 4 аминокислотных остатков).

Этот класс соединений описан как α-аминоциклолактамы. Ключевой структурной особенностью данных молекул являются наличие лактамамида в системе циклоалкильного кольца с аминогруппой, присоединенной к атому углерода, следующего за лактамкарбонильной группой (обозначается как α-углерод).

Термины «α-аминоциклолактам» и «система циклоалкильного кольца», используемые в данном описании, охватывают как моноциклические, так и бициклические кольца.

Если в формуле (I) z=0, то соединения представляют собой α-аминоциклолактамы;

если в формуле (I) z=1-8, то соединения представляют собой α-аминобициклолактамы.

α-Углерод α-аминоциклолактамов может быть асимметричным (если y<>z в общей формуле (I)) и, следовательно, некоторые из соединений согласно настоящему изобретению имеют две возможные энантиомерные формы, то есть R и S конфигурации. Настоящее изобретение охватывает две энантиомерные формы и все комбинации этих форм, включая рацемические RS смеси. Для упрощения, если в структурных формулах не показана конкретная конфигурация, то следует понимать, что представлены две энантиомерные формы и их смеси.

Соединения общей формулы (I) представляют собой N-замещенные α-аминоциклолактамы или их фармацевтически приемлемые соли. N-Заместитель представляет собой либо карбонамид, либо сульфаниламид. Геометрия атома углерода, следующего за карбонильной группой карбонамида или сульфонильной группой сульфаниламида («ключевой» углерод) может быть важна для биологической активности молекулы. Природа N-заместителей может быть таковой, что кольцо или кольца Y ограничивают углы валентных связей при «ключевом» углероде, делая их, по существу, тетраэдрическими (т.е. sp³ гибридные связи). Любой заместитель R¹ может быть заместителем в любом допустимом положении кольца или колец циклической группы Y. В частности, следует отметить, что изобретение включает соединения, у которых «ключевой углерод» входит в состав циклической группы и при этом сам является замещенным. Определение (R¹)_n охватывает соединения согласно изобретению без заместителей (т.е. R¹ = водород), соединения согласно изобретению однозамещенные (т.е. R¹ не является водородом и n=1), а также с несколькими замещениями (т.е., по меньшей мере, две R¹ группы не являются водородом и n=2 или более).

Изобретение также предусматривает фармацевтические составы, содержащие в качестве активного компонента соединение общей формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель и/или носитель:

где у представляет собой любое целое число от 1 до 8;

z представляет собой любое целое число от 0 до 8 при условии, что у и z не могут одновременно быть равными 1;

Х представляет собой -CO(Y)_k-(R¹)_n или SO₂(Y)_k-(R¹)_n;

k представляет собой 0 или 1;

Y представляет собой циклоалкил или полициклоалкил (например, адамантил, адамантанметил, бициклооктил, циклогексил, циклопропил)

или Y представляет собой циклоалкенил или полициклоалкенил;

каждый R¹ независимо выбран из водорода или алкила, галоалкила, алкокси, галоалкокси, алкенила, алкинила, алкиламино, алкиламиноалкила, алкиламинодиалкила, имеющего заряд алкиламинотриалкила или имеющего заряд алкилкарбоксилата, содержащего от 1 до 20 атомов углерода,

или каждый R¹ независимо выбирают из фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, оксиалкила, амино, аминоалкила, аминодиалкила, имеющего заряд аминотриалкила, или карбоксилатрадикала и

n - любое целое число от 1 до m, где m - максимальное количество заместителей, возможных в циклической группе Y.

Кроме того, R¹ может быть выбран из пептидного радикала, например, содержащего от 1 до 4 пептидных звеньев, соединенных пептидными связями (например, пептидный радикал, содержащий от 1 до 4 аминокислотных остатков).

Под фармацевтически приемлемой солью понимают, в частности, аддитивные соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, сульфат, фосфат, бифосфат и нитрат или соли органических кислот, такие как ацетат, малеат, фумарат, тартрат, сукцинат, цитрат, лактат, метансульфонат, п-толуолсульфонат, пальмитат и стеарат. Также в область охвата настоящего изобретения, в случаях, когда их можно применять, включены соли, образованные из оснований, например, из гидроокиси натрия или калия. Другие примеры фармацевтически приемлемых солей см. в работе "Salt selection for basic drugs", Int. J. Pharm. (1986), 33, 201-217.

Фармацевтический состав может быть в твердой форме, например в виде порошков, гранул, таблеток, желатиновых капсул, липосом или суппозиториев. Подходящей твердой основой может служить, например, фосфат кальция, стеарат магния, тальк, сахара, лактоза, декстрин, крахмал, желатин, целлюлоза, метилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, поливинилпирролидин и воск. Другие подходящие фармацевтически приемлемые наполнители и/или носители известны специалистам в данной области техники

Фармацевтические составы согласно изобретению также могут быть представлены в жидкой форме, например в виде растворов, эмульсий, суспензий или сиропов. Подходящей жидкой основой может быть, например, вода, органические растворители, такие как глицерол или гликоли, а также их водные смеси в различных пропорциях.

Изобретение также предусматривает применение соединения общей формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственных препаратов, предназначенных для модулирования активности одного или более представителей класса G-белок сопряженных рецепторов:

где y представляет собой любое целое число от 1 до 8;

z представляет собой любое целое число от 0 до 8 при условии, что у и z не могут одновременно быть равными 1;

Х представляет собой -CO(Y)_k-(R¹)_n или SO₂(Y)_k-(R¹)_n;

k представляет собой 0 или 1;

Y представляет собой циклоалкил или полициклоалкил (например, адамантил, адамантанметил, бициклооктил, циклогексил, циклопропил)

или Y представляет собой циклоалкенил или полициклоалкенил;

каждый R¹ независимо выбран из водорода или алкила, галоалкила, алкокси, галоалкокси, алкенила, алкинила, алкиламино, алкиламиноалкила, алкиламинодиалкила, имеющего заряд алкиламинотриалкила или имеющего заряд алкилкарбоксилата, содержащего от 1 до 20 атомов углерода,

или каждый R¹ независимо выбран из фтора, хлора, брома, йода, гидрокси, оксиалкила, амино, аминоалкила, аминодиалкила, имеющего заряд аминотриалкила, или карбоксилатрадикала и

n - любое целое число от 1 до m, где m - максимальное количество заместителей, возможных в циклической группе Y.

Кроме того, R¹ может быть выбран из пептидного радикала, например, содержащего от 1 до 4 пептидных звеньев, соединенных пептидными связями (например, пептидный радикал, содержащий от 1 до 4 аминокислотных остатков).

Изобретение предлагает соединения, составы и способы применения соединений общей формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей, у которых радикал R¹ содержит «ключевой» углерод, замещенный двумя одинаковыми или разными группами, выбранными из алкил, галоалкил, алкокси, галоалкокси, алкенил, алкинил или алкиламинорадикалов.

Изобретение предлагает соединения, составы и способы применения, в которых «ключевой» углерод является хиральным.

Изобретение предлагает соединения, составы и способы применения, в которых «ключевой» углерод образует sp³ гибридные связи.

Изобретение предлагает соединения, составы и способы применения, в которых «ключевой» углерод имеет, по существу, тетраэдрические углы валентных связей.

Соединения общей формулы (I) при применении в изобретении или их соли могут быть таковыми, что кольцо или кольца Y ограничивают углы валентных связей при «ключевом» углероде, делая их по существу тетраэдрическими (т.е. sp³ гибридные связи).

В альтернативном варианте реализации изобретения общую формулу (I) модифицируют так, что вместо С3-С7-алкильного мостика -(СН₂)_у- присутствует группа, независимо выбранная из группы, включающей алкенил, галоалкил, алкиламино, алкиламиноалкил, алкиламинодиалкил, заряженный алкиламинотриалкил, заряженный алкилкарбоксилат и алкилгидроксигруппы, имеющие углеродную цепочку, содержащую от 1 до 8 атомов.

Изобретение предусматривает применение, состав или соединение, где у и z представляют собой одинаковые целые числа от 1 до 8, в результате чего кольцо бициклолактама не является хиральным.

Изобретение предусматривает применение, состав или соединение, в котором у и z представляют собой не одинаковые целые числа от 1 до 8, в результате чего кольцо бициклолактама является хиральным.

Изобретение предусматривает применение, состав или соединение, в котором z представляет собой 3 и у представляет собой 1, 2 или 4-8, в результате чего соединение содержит лактамное кольцо, которое является семичленным.

Изобретение предусматривает применение, состав или соединение, в котором z представляет собой 2 и у представляет собой 1 или 3-8, в результате чего соединение содержит лактамное кольцо, которое является шестичленным.

Примерами соединений общей формулы (I) и их солей в соответствии с настоящим изобретением являются:

4-(адамантан-1-карбониламино)-3-оксо-2-азабицикло[2.2.2]октан,

5-(адамантан-1-карбониламино)-10-оксо-9-азабицикло[3.3.2]декан,

4-(2',2'-диметилдодеканоиламино)-3-оксо-2-азабицикло[2.2.2]октан,

5-(2',2'-диметилдодеканоиламино)-10-оксо-9-азабицикло[3.3.2]декан и их соли.

Изобретение также предлагает сульфаниламидные аналоги приведенных в качестве примеров соединений, т.е. сульфонил-α-аминоциклолактамные эквиваленты соединений формулы (I).

Изобретение охватывает указанные соединения, составы и применение при этом соединения находятся в гидратированной или сольватированной форме.

Амидные и сульфонамидные производные α-аминоциклолактамов, описанных в данной заявке, являются функциональными агонистами G-белок сопряженных рецепторов. Они стабильны в сыворотке крови человека и, следовательно, имеют превосходные фармакокинетические свойства; биодоступны при пероральном приеме; являются сильнодействующими агонистами G-белок сопряженных рецепторов; их введение не сопровождается какой-либо значительной острой токсичностью при дозах, необходимых для достижения максимального терапевтического эффекта. В целом эти свойства указывают на то, что амидные и сульфонамидные производные α-аминоциклолактамов представляют собой совокупность соединений с улучшенными свойствами агонистов и антагонистов G-белок сопряженных рецепторов.

Центральная часть, состоящая из «ключевого» углерода, карбонильной или сульфонильной группы, α-аминогруппы и системы циклолактама (в частности, ограниченная система бициклолактамного кольца), представляет собой пример «идеального» лиганда для G-белок сопряженного рецептора. Меняя заместители данной центральной части, можно получать агонисты и антагонисты G-белок сопряженных рецепторов с широким спектром желаемых свойств намного более легким способом, чем с помощью скрининга библиотек произвольных соединений.

В результате изобретение также предлагает библиотеку, состоящую из двух или более представителей класса соединений, определяемых общей формулой (I), такую, что можно проводить скрининг указанной библиотеки для идентификации молекулы с некоторым желательным набором свойств в отношении модулирования процесса передачи сигналов от одного (или более) G-белок сопряженных рецепторов. Затем можно провести скрининг вышеупомянутой библиотеки на антагонистическую или агонистическую активность по отношению к вышеупомянутому G-белок сопряженному рецептору (рецепторам) с применением способов, хорошо известных в данной области техники. Например, можно скринировать библиотеки на способность отдельных ее элементов блокировать связывание меченного радиоактивным изотопом лиганда G-белок сопряженного рецептора с препаратами мембраны, содержащими рекомбинантный или очищенный G-белок сопряженный рецептор. Кроме того, можно проводить скрининг библиотеки на способность отдельных ее элементов стимулировать образование цАМФ в клетках, экспрессирующих рекомбинантный G-белок сопряженный рецептор.

Изобретение также обеспечивает способы лечения, облегчения или профилактики симптомов болезни или состояния, выбранного из группы, включающей гипертонию, атеросклероз, астму, ожирение, нейродегенеративные заболевания, аутоиммунные заболевания или психопатические заболевания путем введения пациенту эффективного количества соединения, состава или лекарственного препарата согласно изобретению, предназначенного для модулирования активности G-белок сопряженного рецептора.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин «приблизительно» относится к интервалу, который включает рассматриваемое значение. При использовании в данной заявке на патент «приблизительно X» означает интервал от значения Х минус 10% от значения Х до значения Х плюс 10% от значения X, предпочтительно интервал от значения Х минус 5% от значения Х до значения Х плюс 5% от значения X.

Использование числового диапазона в данном описании предназначено для того, чтобы однозначно включить в область охвата изобретения каждое конкретное целое значение данного диапазона и все комбинации значений верхнего и нижнего пределов расширенной области данного диапазона. Таким образом, например, диапазон от 1 до 20 атомов углерода, указанный (в числе прочего) в отношении формулы I, охватывает все целые числа от 1 до 20 и все подобласти каждой комбинации верхних и нижних значений, приведенных или не приведенных в качестве примеров в явной форме.

Термины «включающий» и «содержащий», используемые в данном описании, следует понимать и как «включающий» (имеющий в составе) и как «состоящий из». Таким образом, если указано, что изобретение относится к «фармацевтическому составу, включающему/содержащему в качестве активного компонента» соединение, то данные термины относятся и к составам, в которые могут входить другие активные компоненты, и к составам, состоящим только из одного активного компонента, как определено.

Термин «пептидные звенья», используемый в настоящей заявке, обозначает следующие 20 природных аминокислотных остатков:

СИМВОЛ	ЗНАЧЕНИЕ
Ala	Аланин
Cys	Цистеин
Asp	Аспарагиновая кислота
Glu	Глутаминовая кислота
Phe	Фенилаланин
Gly	Глицин
His	Гистидин
Ile	Изолейцин
Lys	Лизин
Leu	Лейцин
Met	Метионин
Asn	Аспарагин
Pro	Пролин
Gln	Глутамин
Arg	Аргинин
Ser	Серин
Thr	Треонин
Val	Валин
Trp	Триптофан
Tyr	Тирозин

Модифицированные и редко используемые аминокислотные остатки, как и пептидомиметики, также входят в объем понятия «пептидные звенья».

Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют значение, которое обычно понимается средним специалистом в области техники, к которой принадлежит данной изобретение. Аналогично содержание всех публикаций, заявок на патент, всех патентов и других источников, упоминаемых в настоящем описании, включено в настоящее описание посредством ссылки (если это юридически допустимо).

Следующие примеры иллюстрируют, но никоим образом не ограничивают область изобретения.

ПРИМЕРЫ

Общий способ синтеза исходных соединений

Гидрохлориды (R) и (S)-3-аминокапролактама и гидропирролидин-5-карбоксилаты (R,R) и (S,S)-3-аминокапролактама синтезировали согласно способам, описанным в литературе (ср. Boyle et al., J. Am. Chem. Soc. (1979), 44, 4841-4847; Rezler et al., J. Med. Chem. (1997), 40, 3508-3515).

ПРИМЕР 1

4-(Адамантан-1-карбониламино)-3-оксо-2-азабицикло[2.2.2]октан

ПРИМЕР 2

5-(Адамантан-1-карбониламино)-10-оксо-9-азабицикло[3.3.2]декан

ПРИМЕР 3

4-(2',2'-Диметилдодеканоиламино)-3-оксо-2-азабицикло[2.2.2]октан

ПРИМЕР 4

5-(2',2'-диметилдодеканоиламино)-10-оксо-9-азабицикло[3.3.2]декан

Фармакологическое исследование продуктов согласно изобретению

Принципы исследования

А. Антагонисты G-белок сопряженных рецепторов

Как правило, соединения согласно изобретению можно исследовать на антагонистическую активность по отношению к конкретному G-белок сопряженному рецептору, воздействуя на рецептор меченным радиоизотопом лигандом в подходящих для связывания условиях при отсутствии и в присутствии различных концентраций исследуемого соединения. Далее оценивают количество метки, связавшейся с рецептором. В случае, если исследуемое соединение способно конкурировать с меченным лигандом за связывание, количество метки, связавшейся с рецептором, уменьшается с увеличением концентрации исследуемого соединения. По графику зависимости количества связавшегося лиганда от концентрации исследуемого соединения можно оценить сродство исследуемого соединения к связыванию с рецептором.

Таким образом, такой способ анализа требует:

(1) Источник представляющего интерес G-белок сопряженного рецептора. Последовательность каждого члена суперсемейства G-белок сопряженных рецепторов человека на настоящий момент доступна в результате секвенирования генома человека. Такие последовательности можно клонировать в соответствующем векторе и экспрессировать в клетках соответствующего типа (например, Т-клетки Jurkat, которые, как известно, фактически не экспрессируют эндогенные G-белок сопряженные рецепторы, за исключением хемокинового рецептора CXCR4). После селекции с применением антибиотика, соответствующего используемому вектору, можно получить стабильные клеточные линии с высоким уровнем экспрессии выбранного G-белок сопряженного рецептора.

Мембранные фракции клеточных линий, экспрессирующих выбранный G-белок сопряженный рецептор, можно получить с применением ряда способов, хорошо известных в данной области техники. Например, согласно Куо с соавторами (Kuo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77:7039), клетки можно ресуспендировать в буфере 25 мМ HEPES - (N-2-гидроксиэтилпиперзин-N'-2-этансульфоновая кислота), рН 7,5, содержащем 0,25 М сахарозу, 2,5 мМ MgCl₂, 2,5 мМ EGTA и 50 мМ β-меркаптоэтанол, а также ингибиторы протеаз, такие как PMSF и леупептин, и разрушить с высвобождением компонент с применением гомогенизатора Даунса. Затем суспензию центрифуговали при 120×g для получения осадка из неразрушенных клеток и больших фрагментов клеток и отбирали надосадочную жидкость, содержащую небольшие фрагменты мембраны и компоненты цитозоля. Затем полученную надосадочную жидкость ультрацентрифугировали при 100000×g, получая осадок из фрагментов мембраны с высоким содержанием выбранного G-белок сопряженного рецептора. Осадок ресуспендируют в подходящем для связывания буфере и определяют общую концентрацию белка с применением, например, коммерчески доступных наборов для белкового анализа, таких как Coomassie Plus (Pierce). Препарат мембраны можно довести до нужного объема для получения стандартизированной общей концентрации белка, например 1 мг/мл. Препарат можно хранить при - 85°С в аликвотах до необходимости применения.

(2) Меченый лиганд с высоким сродством к выбранному G-белок сопряженному рецептору. Соответствующие лиганды большинства G-белок сопряженных рецепторов хорошо известны в литературе. Такие лиганды могут представлять собой природные лиганды рецептора (например, допамин) или представлять собой фармакологическое средство (как, например, домперидон). Список пригодных лигандов щирокого спектра изученных G-белок сопряженных рецепторов приведен в таблице, но, как очевидно для специалиста в данной области техники, для многих из этих рецепторов существуют другие подходящие лиганды. Лиганды, наиболее пригодные для данных целей, должны иметь константу сродства для связывания с выбранным рецептором, по крайней мере, 1 мкМ, предпочтительно менее чем 100 нМ и более предпочтительно менее чем 10 нМ.

Рецептор	Радиолиганд	Конц. (нМ)	Конкурент	Конц. (мкМ)
аденозин A1,	[3H]DPCPX	1	DPCPX	1
аденозин A2	[3H]CGS 21680	6	NECA	10
аденозин А3	[125I]АВ-МЕСА	0.1	IB-MECA	1
α1-адреноцептор	[3H]празосин	0.25	празосин	0.5
α2-адреноцептор	[3H]RX 821002	0.5	(-)-эпинфрин	100
β1-адреноцептор	[3H](-)-CGP 12177	0.15	альпренолол	50
β2-адреноцептор	[3H](-)-CGP 12177	0.15	альпренолол	50
ангиотензин AT1	[125I][sar1,ile8] - все	0.05	Ангиотензин II (все)	10
ангиотензин АТ2	[125I]CGP 42112A	0.05	Ангиотензин II (все)	1
центральный БДЗ	[3H]флюнитразепам	0.4	диазепам	3
периферический БДЗ	[3H]PK 11195	0.2	PK 11195	10
бомбезин (нс)	[125I][Tyr4]бомбезин	0.01	бомбезин	1
брадикинин B2	[3H]Брадикинин	0.2	Брадикинин	1
CGRP рецептор	[125I]hCGRPα	0.03	hCGRPα	1
каннабиноид СВ1	[3H]WIN 55212-2	2	WIN 55212-2	10
холецистекинин А	[125I]CCK-8	0.08	CCK-8	1
холецистекинин В	[125I]CCK-8	0.025	CCK-8	1
допамин D1	[3H]SCH 23390	0.3	SCH 23390	1
допамин D2s	[3H]спиперон	0.3	(+)-бутакламол	10
допамин D3	[3H]спиперон	0.3	(+)-бутакламол	10
допамин D4.4	[3H]спиперон	0.3	(+)-бутакламол	10
допамин D5	[3H]-SCH 23390	0.3	SCH 23390	10
эндотелин ETA	[125I]эндотелин-1	0.03	эндотелин-1	0.1
эндотелин ЕТв	[125I]эндотелин-1	0.03	эндотелин-1	0.1
ГАМК (нс)	[3H]-ГАМК	10	ГАМК	100
галанин GAL1	[125I]галанин	0.03	галанин	1
галанин GAL2	[125I]галанин	0.05	галанин	1
ИЛ8RB (CXCR2)	[125I]ИЛ-8	0.025	ИЛ-8	0.3
CCR1	[125I]MIP1α	0.03	MIP1α	0.1
гистамин H1	[3H]пириламин	3	пириламин	1
гистамин Н2	[125I]APT	0.2	тиотидин	100
МС4	[125I]NDP-α-MCГ	0.05	NDP-α-МСГ	1
мелатонин ML1	[125I]йодомелатонин	0.025	мелатонин	1
мускариновый M1	[3H]пирензепин	2	атропин	1
мускариновый M2	[3H]AF-DX 384	2	атропин	1
мускариновый М3	[3H]4-DAMP	0.2	атропин	1
мускариновый M4	[3H]4-DAMP	0.2	атропин	1
мускариновый М5	[3H]4-DAMP	0.2	атропин	1
нейрокинин NK1	[125I][sar9,met11]-SP	0.15	[sar9,met11]-SP	1
нейрокинин NK2	[125I]NKA	0.1	[nle10]-NKA(4-10)	10
нейрокинин NK3	[3H]SR 142801	0.2	SB 222200	10
нейропептид Y1	[125I]пептидYY	0.05	Нейропептид Y	1
нейропептид Y2	[125I]пeптидYY	0.015	Нейропептид Y	1
нейротензин NT1	[125I][Tyr3]-нейротензин	0.02	нейротензин	1
δ опиоид (δ2)	[3H]DADLE	0.5	налтрексон	10
κ опиоид	[3H]U 69593	0.7	налоксон	10
µ опиоид	[3H]DAMGO	0.5	налоксон	10
ORL1 опиоид	[3H]носисептин	0.2	носисептин	1
Гипофизарный активирующий аденилатциклазу пептид (РАСАР)	[125I]РАСАР (1-27)	0.02	РАСАР (1-27)	0.1

пурин Р2Х	[3H]α,β-МеАТФ	3	α,β-МеАТФ	10
пурин P2Y	[3S]дАТФαS	10	дАТФαS	10
серотонин 5HT1A	[3H]8-OH-DPAT	0.5	8-OH-DPAT	10
серотонин 5НТ1в	[125I]CYP	0.1	серотонин	10
серотонин 5HT2A	[3H]кетансерин	0.5	кетансерин	1
серотонин 5HT2C	[3H]мезулургин	1	SB 242084	10
серотонин 5НТ3	[3H]BRL 43694	0.5	MDL 72222	10
серотонин 5НТ5А	[3H]LSD	1	серотонин	100
серотонин 5НТ6	[3H]LSD	2	серотонин	100
серотонин SHT7	[3H]LSD	4	серотонин	10
сигма рецептор (нс)	[3H]DTG	8	галоперидол	10
соматостатин (нс)	[125I][Tyr11]-sst14	0.05	sst14	0.3
вазопрессин VIP1	[125I]VIP	0.04	VIP	0.3
Используемая аббревиатура: (нс) = неселективный

После выбора лиганда, возможно, его будет необходимо пометить, чтобы впоследствии можно было определить количество лиганда, связавшегося с выбранным G-белок сопряженным рецептором (хотя можно провести анализ и без мечения лиганда, при условии доступности чувствительного и точного способа определения количества несвязанного лиганда, например, можно применять твердофазный ИФА (ELISA) для измерения не связавшегося лиганда, таким способом, определяя количество с