Иммунотерапевтическое лечение

Иммунотерапевтическое лечение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к иммунотерапевтическим способам терапии сердечно-сосудистого заболевания.

Уровень техники

Атеросклероз является заболеванием, зависящим от многих факторов, развивающимся преимущественно у субъектов, демонстрирующих биохимические факторы риска, которые включают среди прочих курение, гипертонию, сахарный панкреатический диабет, гиперхолестеринемию, повышенное содержание в плазме липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов, гиперфибриногенемию и гипергликемию. Атеросклероз является хроническим заболеванием, которое вызывает утолщение глубинного слоя (интимы) артерий большого и среднего размера. Это уменьшает кровоток и может вызвать ишемию и разрушение тканей в органах, питание которых осуществляется поврежденными сосудами. Атеросклеротические поражения развиваются у людей в течение нескольких десятилетий, приводя к осложнениям, таким как коронарные и церебральные ишемические и тромбоэмболические заболевания, и инфарктам миокарда и церебральным инфарктам.

Атеросклероз является главной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, включая инфаркт миокарда, инсульт и заболевание периферических артерий. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности в промышленно развитых странах и непрерывно прогрессируют в развивающихся странах, главной патологией, лежащей в основе заболеваний, является коронарный атеросклероз. Современная терапия атеросклероза не является полностью эффективной в предотвращении развития заболевания и осложнений.

Заболевание возникает при накоплении липопротеидов, главным образом ЛПНП, во внеклеточном матриксе сосуда. Данные частицы ЛПНП агрегируют и претерпевают окислительную модификацию. Окисленные ЛПНП токсичны и вызывают повреждение сосудов. Атеросклероз представляет во многих аспектах реакцию (включая воспаление и фиброз) на данное повреждение.

Высокие уровни холестерина в плазме, и особенно высокие уровни ЛПНП, обычно признаются движущими силами развития атеросклероза, в то время как высокие уровни липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) препятствуют развитию атеросклероза. Соответственно, ЛПВП были названы хорошим холестерином, в то время как ЛПНП был названы плохим холестерином. Упрощенно, ЛПВП транспортируют холестерин в ткани, в то время как ЛПНП абсорбируют холестерин из тканей и переносят их в печень, где происходит их деградация. Терапевтические стратегии уменьшения ЛПНП и увеличения ЛПВП для лечения атеросклероза находятся в процессе разработки. Одна особенно интересная и перспективная стратегия включает мутированный вариант ЛПВП, так называемый АроА-1_Milano. Данный вариант ЛПВП крайне эффективен в транспортировке холестерина из тканей и в экспериментах на животных (Shah et al., 1998), кроме того, результаты клинических испытаний (Nissen et al., 2003) продемонстрировали, что он может вызывать значительное уменьшение отложений атеросклеротических бляшек.

Как было описано в разделе «Уровень техники» патентной заявки WO 02/080954, Palinski и соавторы (1989) обнаружили у людей циркулирующие антитела к окисленным ЛПНП. Данное наблюдение означало, что атеросклероз может быть аутоиммунным заболеванием, которое вызвано иммунными реакциями на окисленные липопротеины. В настоящее время несколько лабораторий начали поиск взаимосвязи между титром антител к окисленным ЛПНП и сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Было обнаружено, что антитела к окисленным ЛПНП присутствуют как у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, так и у здоровых контрольных участников исследования. Это привело исследователей к изучению того, действительно ли аутоиммунные реакции на окисленные ЛПНП в стенке сосудов играют некоторую роль в развитии атеросклероза, путем иммунизации животных к их собственным окисленным ЛПНП. Идея, лежащая в основе данного подхода, заключалась в том, что, если аутоиммунные реакции на окисленные ЛПНП при использовании классических методик иммунизации будут усилены, результатом этого будет увеличение сосудистого воспаления и прогрессирование атеросклероза. Для проверки этой гипотезы кроликов иммунизировали аутологичными окисленными ЛПНП и затем индуцировали атеросклероз путем кормления животных диетой с высоким содержанием холестерина в течение 16 недель (Ameli et al., 1996; Freigang et al., 1998). Однако в противоположность исходной гипотезе иммунизация окисленными ЛПНП оказывала защитный эффект, уменьшая развитие атеросклероза примерно на 50%. Аналогичные результаты были также получены в последующем исследовании, в котором диету с высоким содержанием холестерина комбинировали с повреждением сосудов при помощи вводимого внутрь баллона для индукции более активного образования бляшек (Nissen et al., 1997). В совокупности доступные данные означают, что существуют иммунные реакции, которые защищают от развития атеросклероза, и что эти реакции включают аутоиммунные реакции против окисленных ЛПНП.

Данные наблюдения свидетельствуют о возможности разработки иммунной терапии или «вакцины» для лечения у людей сердечно-сосудистых заболеваний, возникших на основе атеросклероза. Одним из способов осуществления такой терапии могла бы стать иммунизация особи собственным ЛПНП после его окисления, например, при его контакте с медью.

Palinski и соавторы (1995) и George и соавторы (1998) показали, что иммунизация против окисленных ЛПНП уменьшает развитие атеросклероза. Аналогично этому Zhoiu и соавторы (2001) продемонстрировали, что антитела, реагирующие с эпитопами, обнаруженными на окисленной форме ЛПНП, на животных моделях защищают от развития атеросклероза.

В заявке WO 02/080954 сообщается, что вакцинация животных, склонных к развитию атеросклероза, окисленными формами определенных пептидов, полученных из аполипопротеина В-100 (АроВ-100), защищает их от развития атеросклероза. Предыдущие эксперименты продемонстрировали, что антитела, которые связываются с окисленными эпитопами, присутствующими в частицах ЛПНП (Schpou et al., 2004), в животных моделях оказывают защитное действие против развития атеросклеротических бляшек. Более того, меченные радиоактивным изотопом формы антител, которые связываются с окисленными ЛПНП, также могут быть использованы для радиоиммуноанализа атеросклеротических повреждений сосудов у экспериментальных животных (Tsimikas et al., 2000). Для детектирования бляшек у мышей и кроликов было использовано меченное I¹²⁵ антитело к лизиновому эпитопу MDA, и было обнаружено, что введенные антитела локализуются в бляшках в аорте. Это указывает на то, что иммунные реакции против окисленных ЛПНП могут оказывать защитный эффект.

Также было показано, что рекомбинантные человеческие антитела, выработанные против MDA-модифицированных пептидов, полученных из АроВ-100 человека, в соответствующих животных моделях существенно ингибируют образование бляшек (Schpou et al., (2004); заявка WO 2004/030607). Механизмы, лежащие в основе действия на разрастание бляшки, не известны, однако предполагается влияние на активацию макрофагов и воспаление (Schiopu et al., 2004). Известно, что окисленные ЛПНП активируют макрофаги, что приводит к увеличенному воспалительному ответу, который, в свою очередь, индуцирует развитие атеросклероза (Smith et al., 1995). Однако не было ни теоретических, ни экспериментальных данных, которые говорили бы о том, что иммунный ответ против окисленных ЛПНП или введение заранее полученных антител к окисленным ЛПНП может в результате дать обратное развитие уже существующих атеросклеротических повреждений.

В предыдущей работе также было продемонстрировано, что антитела к окисленным пептидам, полученным из АроВ-100, так же как и антитела к другим окисленным эпитопам ЛПНП, включая фосфатидилхолин, могут предотвращать развитие атеросклеротических бляшек у экспериментальных животных (2004/030607; US 6716410). Инъекция человеческих иммуноглобулинов, содержащих природные антитела к окисленным ЛПНП, уменьшало атеросклероз у мышей с врожденным отсутствием АроЕ (Nicoletti et al., 1998).

Насколько мы знаем, никто из авторов любой из данных публикаций не оценил по достоинству то, что антитела к окисленным эпитопам ЛПНП могут вызывать уменьшение атеросклеротических бляшек, они не предполагали, что подобные антитела могут быть использованы у больных людей для уменьшения отложений атеросклеротических бляшек.

Раскрытие изобретения

Удивительным и неожиданным было то, что мы теперь обнаружили, что антитела к окисленным эпитопам ЛПНП не только действительно препятствуют образованию бляшек, они также индуцируют уменьшение уже образовавшихся атеросклеротических бляшек. Такие антитела могут применяться для терапии запущенного атеросклероза для интенсивного образного развития болезни, что приведет к уменьшению отложений бляшек.

Аналогично этому, поскольку у млекопитающих титры специфичных антител могут быть получены как пассивной, так и активной иммунизацией, уменьшение уже существующих бляшек может быть достигнуто при помощи любого из этих двух подходов.

Таким образом, настоящее изобретение относится к применению иммунотерапии против окисленных ЛПНП для индуцирования уменьшения уже существующих атеросклеротических бляшек у человека.

Иммунотерапия может представлять собой либо активную иммунизацию при введении окисленных эпитопов ЛПНП, либо пассивную иммунизацию при введении антител, индуцированных против окисленных эпитопов ЛПНП.

В понятие «обратное развитие атеросклеротических бляшек» мы включаем значение уменьшения размера, и/или количества, и/или распространенности атеросклеротических бляшек. В основном, обратное развитие атеросклеротических бляшек ведет к уменьшению площади внутренней поверхности артерии, покрытой бляшками. Поэтому в понятие «обратное развитие атеросклеротических бляшек» мы включаем уменьшение суммарного отложения бляшек у особи, а также уменьшение размера некоторых или всех атеросклеротических бляшек особи. Обратное развитие атеросклеротических бляшек также ведет к увеличению просвета сосудов, что способствует усилению кровотока.

Способы измерения размера, и/или количества, и/или распространенности атеросклеротических бляшек у человека хорошо известны специалистам в данной области техники и включают рентгенографию кровеносных сосудов, ультразвуковое исследование сосудов, компьютерную томографию и магнитную резонансную томографию.

В понятие «уменьшения размера, и/или количества, и/или распространенности» мы включаем уменьшение приблизительно на 1-25%, например уменьшение приблизительно на 1, или 2, или 3, или 4, или 5%, или более значительное уменьшение приблизительно на 6, или 7, или 8, или 9, или 10%, или уменьшение на 10-25%. Более предпочтительным является большее уменьшение на 25-50% или на 50-75% или еще большее уменьшение.

Под уменьшением площади внутренней поверхности артерии, покрытой атеросклеротическими бляшками, мы имеем в виду уменьшение приблизительно на 1-25%, например уменьшение приблизительно на 1, или 2, или 3, или 4, или 5%, или более значительное уменьшение приблизительно на 6, или 7, или 8, или 9, или 10%, или уменьшение на 10-25%. Более предпочтительным является большее уменьшение на 25-50% или на 50-75% или еще большее уменьшение.

В понятие эффективного поперечного сечения артериального сосуда мы включаем увеличение на 1-25%, например увеличение приблизительно на 1, или 2, или 3, или 4, или 5%, или более значительное увеличение приблизительно на 6, или 7, или 8, или 9, или 10%, или увеличение на 10-25%. Более предпочтительным является большее увеличение на 25-50%, или на 50-75%, или на 75-100%. Более предпочтительным является увеличение эффективного поперечного сечения артериального сосуда в 2, или 3, или 4, или 5, или в 10 раз или еще большее увеличение. Очевидно, что степень увеличения поперечного сечения артериального сосуда зависит от уровня закупорки артерии, вызванного атеросклеротическими повреждениями до терапии.

Атеросклеротические бляшки, которые будут регрессировать, обычно находятся в аорте больного, хотя также могут быть обнаружены в других артериях больного, таких как бедренная, сонная и коронарная артерии.

Более предпочтительно, если иммунотерапия направлена против окисленных эпитопов, присутствующих в окисленных ЛПНП, но не в нативных ЛПНП. Подобные эпитопы могут быть определены при помощи методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, и описанных в патенте WO 02/080954.

Еще более предпочтительно, если иммунотерапия направлена против окисленных эпитопов, присутствующих у АроВ-100 в окисленных ЛПНП.

Окисленные ЛПНП содержат несколько различных эпитопов, которые могут распознаваться антителами. ЛПНП могут подвергаться окислению и деградации в широком спектре различных химических реакций, которые включают реакции, вызванные различными видами модификаций, вызываемых активностью кислорода, ферментов (например, миелопероксидазы), ионов металла (например, Fe²⁺ и Сu²⁺), свободных радикалов и других видов химического стресса.

Некоторые из окисленных эпитопов обнаружены в белковой части ЛПНП (Yang et al., 2001), однако другие эпитопы представляют собой модификации липидов, присутствующих в частице ЛПНП. Может происходить образование множества модифицированных окислением и биологически активных фосфолипидов (Нееrу et al., 1995; Friedman et al., 2002; Watson et al., 1999). Полиненасыщенные жирные кислоты превращаются в гидроперекиси жирных кислот, которые быстро образуют продукты с высокой реакционной способностью, такие как малоновый диальдегид и 4-гидроксиноненаль (Smiley et al., 1991). Этот вид промежуточных продуктов может продолжать превращение в ковалентное основание Шиффа и продукты реакции Майкла с лизином в белке в АроВ-100 из ЛПНП. Реакционноспособные альдегиды также могут быть обнаружены в жирных кислотах, присоединенных через эфирные связи в области фосатидилхолинового остатка (Witzum & Berliner, 1998). Часто встречаемый фосфолипид - 1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолин (ПАФХ) - близкий к конечному продукт окисления, который дает альдегид на sn-2 атоме углерода окисленной арахидоновой кислоты, в результате чего получается ПОВФХ (1-пальмитоил-2-(5-оксо)валероил-sn-глицеро-3-фосфорилхолин). ПОВФХ может реагировать с лизином и также с фосфолипидами, содержащими амины, такими как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. Конечный результат представляет собой множество окисленных аддуктов липид-белок и окисленных аддуктов липид-липид. Некоторые из этих окислений катализируются ферментами, такими как секреторная фосфолипаза (Leitinger et al., 1999). Другие изменения, катализируемые ферментами, такие как нитрование и добавление HOCL, катализирует миелопероксидаза (Саrr et al., 2000). Считается, что все новые эпитопы являются иммуногенными и биологически активными (McIntire et al., 1999; Esterbauer et al., 1991). Также критические эпитопы, которые представляют собой результат окислительной модификации частицы ЛПНП, которые сами не окислены, как фосфорилхолин и фрагменты белков, являются отличительным признаком окисленных ЛПНП, и подобные эпитопы представляют выгодную мишень для иммунотерапии.

За последнее время авторы настоящего изобретения из библиотеки рекомбинантных фрагментов создали человеческие антитела, названные n-CoDer^®, которые направлены против окисленных пептидов, полученных из человеческого АроВ-100 (WO 02/080954). Данные пептидные эпитопы АроВ-100, взятые из Таблицы 1 патентной заявки WO 02/080954, перечислены ниже в Таблице 1. Разработанные антитела в животных моделях защищали от развития атеросклеротических поражений (Schiopu et al., 2004; патентная заявка WO 2004/030607). Последовательности антител против окисленного АроВ-100, раскрытых в патентной заявке WO 2004/030607, в особенности IEI-A8, IEI-D8, IEI-E3, IEIG8, KТТ-В8 и KTT-D6, включены в данный документ посредством отсылки. Во избежание недоразумений, каждое из антител, описанных в заявке WO 2004/030607 и в работе Schiopu et al. (2004), являются примерами антител, которые могут быть применены в контексте данного изобретения.

Как показано выше в таблице 1, пептиды могут быть разделены по группам на 6 категорий с общими характеристиками:

Категория А: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgG к пептидам, модифицированным MDA (малоновым диальдегидом) (n=3).

Категория В: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgM, но отсутствует различие между нативными пептидами и пептидами, модифицированным MDA (n=9).

Категория С: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgG, но отсутствует различие между нативными пептидами и пептидами, модифицированным MDA (n=2).

Категория D: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgG к пептидам, модифицированным MDA, и титры антител в пуле NНР, которые были, по меньшей мере, в два раза выше, чем титры антител в пуле АНР (n=5).

Категория Е: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgM, к пептидам, модифицированным MDA, и титры антител в пуле NHP, которые были, по меньшей мере, в два раза выше по сравнению с титрами антител в пуле АНР (n=11).

Категория F: Фрагменты, которые вызывают высокие титры антител IgG, но отсутствует различие между нативными пептидами и пептидами, модифицированными MDA, и титры антител в пуле АНР, которые были, по меньшей мере, в два раза выше по сравнению с титрами антител в пуле NHP (n=7).

Известно, что пептидные фрагменты АроВ-100 могут быть приготовлены при использовании методик белковой химии, например при использовании частичного протеолиза (как экзогенного, так и эндогенного), или посредством синтеза de novo. Как альтернативный вариант варианты могут быть созданы при помощи технологии на основе рекомбинантной ДНК. Соответствующие методики для клонирования, работы, модификации и экспрессии нуклеиновых кислот, а также очистки экспрессированных белков хорошо известны в этой области техники и описаны, например, в Sambrook et al. (2001) "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 3-е издание, Sambrook et al. (eds). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, включено в данный документ посредством отсылки.

Понятие «пептид» включает в себя не только молекулы, в которых аминокислотные остатки соединены пептидными связями (-CO-NH-), но и молекулы с обращенной пептидной связью. Подобные копирующие пептиды молекулы с обращенной связью (ретроэнантиомеры) могут быть созданы с помощью методов, известных в этой области техники, например методов, описанных в Meziere et al., 1997. Данный подход включает создание псевдопептидов, содержащих изменения в остове молекулы, но не в ориентации боковых цепей. Было показано, что данные псевдопептиды эффективны, по меньшей мере, в случае ответов ГКГС класса II и Т-хелперных клеток. Пептиды-ретроэнантиомеры, которые содержат связи «-NH-CO-» вместо пептидный связей «-CO-NH-», более устойчивы к протеолизу. Аналогично, пептидная связь может совсем отсутствовать при том условии, что используется соответствующий линкерный участок, который фиксирует пространство между CI атомами аминокислотных остатков; особенно предпочтительно, если линкерный участок обладает в основном тем же распределением заряда и в основном такой же планарностью, как и пептидная связь. Также известно, что пептид может быть блокирован на N- или С-конце для того, чтобы уменьшить подверженность экзопротеолитическому расщеплению.

Таким образом, настоящее изобретение включает использование окисленных пептидных эпигонов АроВ-100, перечисленных в Таблице 1, или использование активного фрагмента одного или более из этих пептидов для иммунотерапии против окисленных ЛПНП для индуцирования обратного развития уже существующих атеросклеротических бляшек посредством активной иммунизации или пассивной иммунизации, а именно введением антител, индуцированных против данных окисленных эпитопов.

Известно, что для вакцинации пептиды АроВ-100 могут быть введены как в окисленной, так и не в окисленной форме вследствие того, что пептиды, по всей видимости, окисляются при введении in vivo. Поэтому в понятие «введение окисленного эпитопа ЛПНП» мы включаем введение неокисленного эпитопа, который станет окисленным in vivo.

Во избежание недоразумений в контексте данного изобретения все антитела для пассивной иммунизации связываются с окисленными ЛПНП.

В понятие «фрагмент» пептидного эпитопа АроВ-100, включенного в Таблицу 1, мы включаем, по меньшей мере, 6 последовательных аминокислот данной последовательности. Таким образом, фрагмент может содержать 6, или 7, или 8, или 9, или 10, или 11, или 12, или 13, или 14, или 15, или 16, или 17, или 18, или 19 последовательных аминокислот данной последовательности. «Активным» называется фрагмент, который в окисленном состоянии может быть использован для индукции антител, которые индуцируют обратное развитие атеросклеротических бляшек у человека в результате активной иммунизации или пассивной иммунотерапии. Способы определения того, является ли тот или иной фрагмент пептидных эпитопов, перечисленных в Таблице 1, активным, представлены в Примерах.

В одном аспекте настоящего изобретения иммунотерапия включает введение особи, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП.

Таким образом, настоящее изобретение включает способ индуцирования обратного развития атеросклеротических бляшек у человека, которому это необходимо, способ, включающий введения больному, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП.

Настоящее изобретение также включает применение, по меньшей мере, одного антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП в препарате лекарственного средства, которое индуцирует обратное развитие атеросклеротических бляшек у человека.

В воплощении настоящего изобретения введение антитела, которое селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, включает введение особи полинуклеотида, кодирующего указанную молекулу антитела.

Способы введения полинуклеотидов пациенту хорошо известны специалистам в данной области техники и включают применение иммунолипосом, вирусных векторов (включая вакцинии, модифицированные вакцинии и аденовирус) и прямой доставки ДНК, например, при применении генной пушки и электропорации. Например, Svensson et al., 1999, описывает доставку рекомбинантных генов в кардиомиоциты посредством инъекции внутрь миокарда или инфузией в коронарный сосуд кардиотропных векторов, таких как рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы, результатом чего являлась экспрессия трансгена в кардиомиоцитах мыши in vivo. Melo et al., 2004, опубликовали обзор по генной и клеточной терапии сердечных заболеваний. Альтернативный предпочтительный путь введения - введение через катетер или стент. Стенты предоставляют привлекательную альтернативу для локального трансгеноза, поскольку они обеспечивают платформу для пролонгированного высвобождения гена и эффективной трансдукции артериальных стенок. Данная стратегия переноса генов имеет потенциал для уменьшения системного распространения вирусных векторов, из-за чего происходит уменьшение иммунного ответа хозяина. Как для синтетических, так и для природных оболочек стентов была показана возможность обеспечения пролонгированного высвобождения гена без значительных побочных реакций (Sharif et al., 2004).

Предпочтительно, если полинуклеотид, кодирующий молекулу антитела, функционально связан с адресующими и/или регуляторными последовательностями, которые направляют экспрессию антител в артерии и желательно в артериальные стенки. Таким образом, полинуклеотид делает возможным образование специфичных антител внутри больного человека. Соответствующие последовательности для адресования и регуляции известны специалистам.

Может оказаться желательным уметь регулировать экспрессию полинуклеотида в клетке во времени. Поэтому может оказаться желательным, чтобы экспрессия полинуклеотида находилась прямо или косвенно (см. ниже) под контролем промотора, который мог бы регулироваться, например, концентрацией небольшой молекулы, которую можно было бы вводить больному, когда будет необходимо активировать или, что более вероятно, репрессировать (в зависимости от того, действует ли небольшая молекула на активацию или на репрессию упомянутого промотора) экспрессию антитела, кодируемого полинуклеотидом. Это может быть особенно удобно, если экспрессия конструкции стационарна, то есть с конструкции антитела могут экспрессироваться (в присутствии любой необходимой из регуляторных молекул) в клетке в течение периода, равного, по меньшей мере, одной неделе, одному, двум, трем, четырем, пяти, шести, восьми месяцам или одному году или более лет. Таким образом, полинуклеотид может быть функционально связан с регулируемым промотором. Примеры регулируемых промоторов включают промоторы, упомянутые в следующих статьях: Rivera et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(15), 8657-62 (контроль при помощи рапамицина - биологически доступного лекарства, принимающегося перорально, применение двух различных аденовирусных или аденоассоциированных (AAV) вирусных векторов, один из которых кодирует ген-мишень индуцибельного человеческого гормона роста (hGH), а другой кодирует состоящий из двух частей регулируемый рапамицином фактор транскрипции); Magari et al. (1997) J Clin Invest 100(11), 2865-72 (контроль при помощи рапамицина); Bueler (1999) Biol Chem 380(6), 613-22 (обзор аденоассоциированных вирусных векторов); Bohl et al. (1998) Blood 92(5), 1512-7 (контроль доксициклином в аденоассоциированном вирусном векторе); Abruzzese et al. (1996) J Mol Med 74(7), 379-92 (обзор факторов индукции, например гормонов, факторов роста, цитокинов, цитостатических средств, радиации, теплового шока и ассоциированных чувствительных элементов).

В предпочтительном воплощении молекула антитела является антителом, индуцированным против окисленного эпитопа ЛПНП, такого, например, как эпитопы, перечисленные в Таблице 1 и патенте WO 02/080954. Как подробно описано в патенте WO 02/080954, пептиды могут быть окислены при контакте с множеством агентов, таких как железо, кислород, медь, миелопероксидаза, фосфолипаза, хлорноватистая кислота, или при модификации малоновым диальдегидом (МДА) для имитирования различных модификаций аминокислотных остатков, которые могут происходить во время окисления ЛПНП. В качестве альтернативных для окисления эпитопов ЛПНП могут быть использованы другие способы, известные в этой области техники.

Выработка человеческих антител, реагирующих с пептидами, полученными из АроВ-100 и модифицированными МДА, была описана в патенте WO 02/090854 и в работе Schiopu et al., 2004). Как более подробно обсуждается ниже, человеческие или похожие на человеческие антитела также могут быть получены при применении других технологий, хорошо известных в этой области техники, включая иммунизацию мышей, трансгенных по локусу человеческого иммуноглобулина, или посредством гуманизации, например, мышиных антител с нужной специфичностью.

Под антителом, которое «селективно связывается с окисленным эпитопом ЛПНП», мы имеем в виду то, что молекула антитела связывается с окисленным эпитопом ЛПНП с бóльшим сродством, чем с неокисленным ЛПНП. Предпочтительно, антитело связывается с окисленным эпитопом ЛПНП, по меньшей мере, в 1,5, или, по меньшей мере, в 2, или, по меньшей мере, в 5, или, по меньшей мере, в 10, или, по меньшей мере, в 50 раз с большим сродством, чем с неокисленным ЛПНП.

Более предпочтительно, чтобы молекула антитела связывала окисленный эпитоп ЛПНП со средством, по меньшей мере, в 100, или, по меньшей мере, в 1000, или, по меньшей мере, в 10000 раз выше, чем неокисленный ЛПНП. Такое связывание можно измерить с использованием методов, хорошо известных в данной области, таких как система Biacore®. Предпочтительно, чтобы молекула антитела селективно связывала окисленный эпитоп ЛПНП и не связывала неокисленный ЛПНП.

Предпочтительно, если антитела имеют сродство к эпитопу-мишени, по меньшей мере, 10^-8 М, хотя антитела с большим сродством могут оказаться даже более предпочтительными.

Известно, что защитные эффекты человеческого иммунитета опосредуются семейством молекул со структурным родством, которые называются антителами. Антитела проявляют свою биологическую активность при связывании с антигенами. Связывание антител с антигенами обычно является специфичным для одного антигена, и связывание обычно происходит с высоким сродством. Антитела вырабатываются В-лимфоцитами. В крови содержится много различных антител, каждое из которых производится клоном В-клеток и каждое обладает отличающейся структурой и специфичностью по отношению к антигену. Антитела присутствуют на поверхности В-лимфоцитов, в плазме крови, в тканевой жидкости тканей и в секреторных жидкостях, таких как слюна и слизь на слизистых поверхностях. Все встречающиеся в природе антитела имеют похожую общую структуру, которая отвечает за определенную схожесть физико-химических свойств, таких как заряд и растворимость. Все антитела обладают общей центральной структурой из двух идентичных легких цепей с массой каждой цепи около 24 килодальтон и двумя идентичными тяжелыми цепями с молекулярной массой каждой цепи приблизительно равной 55-70 килодальтон. Одна легкая цепь прикреплена к каждой тяжелой цепи, и две тяжелые цепи соединены вместе. И легкая, и тяжелая цепи содержат серию повторяющихся гомологичных единиц, каждая примерно в 110 аминокислотных остатков длиной, которые независимо сворачиваются в общий глобулярный мотив, называемый иммуноглобулиновым (Ig) доменом. Участок антитела, сформированный при соединении двух тяжелых цепей, гидрофобен. Известно, что антитела, и особенно моноклональные антитела, когда подвергаются воздействию неблагоприятных физических или химических условий, расщепляются в участке, где легкие цепи присоединяются к тяжелым цепям. Поскольку антитела содержат множество остатков цистеина, они могут образовывать цистеин-цистеиновые дисульфидные связи. Все Ig домены содержат два слоя бета-складок с тремя или четырьмя тяжами антипараллельных полипептидных цепочек.

Несмотря на общее сходство молекулы антител могут быть разделены на небольшое число различных классов и подклассов на основании физико-химических свойств, таких как размер, заряд и растворимость, и по их поведению при связывании с антигенами. У людей присутствуют следующие классы молекул антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, про членов каждого класса говорят, что они принадлежат к одному изотипу. Изотипы IgA и IgG далее подразделяются на подклассы, называемые IgA1, IgA2 и IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Тяжелые цепи всех антител одного изотипа имеют обширные регионы с идентичной аминокислотной последовательностью, но отличаются от тяжелых цепей антител, принадлежащих к другим изотипам или подклассам. IgG, IgE и IgD циркулируют в виде мономеров, в то время как секретированные формы IgA и IgM являются димерами или пентамерами соответственно, которые стабилизируются J-цепью. Некоторые молекулы IgA существуют в виде мономеров или тримеров.

В понятие «антитело» или «молекулы антитела» мы включаем не только целые молекулы иммуноглобулина, которые описаны выше, но также фрагменты молекул, такие как Fab, F(ab')₂, Fv и другие фрагменты молекул иммуноглобулинов, которые сохраняют антигенсвязывающий участок. Аналогично, термин «антитело» включает производные антител, полученные при помощи генной инженерии, такие как молекулы с одной цепью Fv (scFv) и доменные антитела (dAbs). Данный термин также включает антителоподобные молекулы, которые могут быть получены с применением технологии фаговых дисплеев или других технологий случайного отбора для молекул, которые связываются с окисленными ЛПНП или с их специфичными участками. Поэтому термин «антитело» включает все молекулы, которые содержат структуру, желательно пептидную структуру, которая является частью сайта узнавания природного антитела (то есть часть антитела, которая связывается или объединяется с эпитопом или антигеном).

В распознавании антигена участвуют вариабельные домены тяжелых (V_H) и легких (V_L) цепей антитела, этот факт был впервые признан в ранних экспериментах по расщеплению протеазами. Дальнейшее подтверждение было обнаружено при «гуманизации» антител грызунов. Вариабельные домены антител грызунов могут быть слиты с константными доменами антител человека так, что полученное в результате антитело сохраняет антигенную специфичность родительского антитела грызуна (Morrison et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81, 6851-6855). Из экспериментов по экспрессии в бактериях фрагментов антител, содержащих один или более вариабельных доменов, известно, что антигенная специфичность определяется вариабельными доменами и не зависит от константных доменов. Данные молекулы включают Fab-подобные молекулы (Better et al. (1988) Science 240, 1041); молекулы Fv (Scerra et al. (1988) Science 240, 1038); одноцепочечные молекулы Fv (scFv), где домены-партнеры V_H и V_L соединены гибким олигопептидом (Bird et al. (1988) Science 242, 423; Huston et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85, 5879), и антитела с одним доменом (dAbs), включающие изолированные V-домены (Ward et al. (1989) Nature 341, 544). Общий обзор методов, применяемых для синтеза фрагментов антител, которые включают их специфические участки связывания, можно найти в работе Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Под термином «ScFv-молекулы» мы подразумеваем молекулы, в которых домены-партнеры V_H и V_L соединены гибким олигопептидом. Сконструированные антитела, такие как ScFv-антитела, могут быть созданы при помощи технологий и подходов, описанных в работе J. Huston et al. (1988) "Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in anti-digoxin single chain Fv analogue produced in E.coli", Proc Nati Acad Sci USA, 85, p.5879-5883, и в A. Pluckthun (1991) "Antibody engineering; Advances from use of E.coli expression systems", Biothecnology 9(6): 545-51, включено в данный документ путем ссылки.

Преимущества использования фрагментов антител по сравнению с использованием целых антител выше в несколько раз. Меньший размер фрагментов может приводить к улучшенным фармакологическим свойствам, таким как лучшее проникновение к месту-мишени. Устраняются эффекторные функции антител, такие как связывание комплемента. Фрагменты Fab, Fv, scFv и dAb могут быть экспрессированы E.coli и секретируются бактериями, что дает возможность легко производить большие количества данных фрагментов.

Целые антитела и фрагменты F(ab')₂ «бивалентны». Под определением «бивалентный» мы имеем в виду то, что антитела и фрагменты F(ab')₂ имеют два сайта объединения с антигеном. Напротив, фрагменты Fab, Fv, scFv и dAb моновалентны, они имеют только один участок объединения с антигеном.

Предпочтительно, чтобы антитело являлось моноклональным антителом. При некоторых обстоятельствах, особенно если антитело планируется вводить человеку-пациенту многократно, предпочтительно, чтобы антитело являлось человеческим моноклональным антителом или гуманизированным моноклональным антителом.

Подходящие моноклональные антитела, которые реагируют так, как описано в данном документе, могут быть приготовлены при помощи известных технологий, например, раскрытых в "Monoclonal Antibodies; A manual of techniques", H. Zola (CRC Press, 1988) или в "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Application", SGR Hurrell (CRC Press, 1982).

Антителам можно придавать желаемые свойства, касающиеся, например, специфичности и перекрестной реактивности, изотипа, сродства и времени полужизни в плазме крови. Возможность разработки антител с заданными свойствами стала очевидной уже при создании технологии получения моноклональных антител (Milstein and Köhler, 1975, Nature, 256: 495-7). В данной технологии используются мышиные клетки гибридомы, продуцирующие большие количества идентичных, но мышиных антител. В действительности огромное количество доклинических, а также клинических испытаний было начато с применением мышиных моноклональных антител для терапии, например, злокачественных новообразований. Однако вследствие того, что антитела были не человеческого происхождения, иммунная система пациентов распознавала их как чужеродные и вырабатывала к ним антитела. Вследствие этого эффективность и время полужизни в плазме крови мышиных антител снижались и часто побочные эффекты от аллергических реакций, вызванных чужеродным антителом, препятствовали успешному лечению.

Для разрешения этих проблем, для уменьшения мышиного компонента специфичных и потенциально терапевтических антител были предприняты несколько подходов. Первый подход