Частицы с расщепленным ядром, предназначенные для презентации чужеродных молекул, прежде всего для применения в вакцинах, и способ их получения

Частицы с расщепленным ядром, предназначенные для презентации чужеродных молекул, прежде всего для применения в вакцинах, и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым носителям для вакцин, а также для других молекул, созданным на основе ядерного антигена вируса гепатита В. В ядерный антиген вируса гепатита встраивают чужеродные аминокислотные последовательности, которые могут быть выведены из возбудителей болезни (патогенов). Вакцина предназначена для того, чтобы обеспечивать возможность продуцирования антител к указанным белковым последовательностям, при этом предпочтение отдается обладающим защитным действием или нейтрализующим антителам. Частицы, предлагаемые в изобретении, могут также стимулировать клеточный иммунный ответ (Т-клетки). Ядерный белок вируса гепатита В характеризуется тем, что большое количество его копий обладают способностью образовывать капсидоподобные частицы. Эти капсидоподобные частицы (CLP) наиболее пригодны для создания вакцин, поскольку они стимулируют иммунную систему и тем самым усиливают производство антител. Понятие «вакцина» в контексте настоящего описания предпочтительно обозначает систему-носитель, которая может вызывать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ.

Капсиды вирусов гепатита В представляют собой обладающие икосаэдральной симметрией наночастицы (диаметром примерно 30 нм), которые состоят из 180 или 240 копий вирусного ядерного белка. Ядерный белок обозначают как HBcAg. Капсиды могут служить в качестве представляющих собой частицы носителей для чужеродных молекул и их предпочтительно применяют в качестве усиливающих иммунную реакцию носителей антигена для вакцин. С помощью соответствующих модификаций ядерного белка можно презентовать чужеродные молекулы на поверхности частиц (а также при необходимости внутри них). Для презентации на внешней поверхности оптимальным является сцепление чужеродной молекулы с аминокислотными (ак) остатками, расположенными в центральной области аминокислотной последовательности ядерного белка (область примерно от ак 73 до ак 94), которые включают иммунодоминантный В-клеточный эпитоп «с/е1» и которые в наибольшей степени «выставлены» на поверхности 3-мерной структуры (3D-структуры) частицы (ак обозначает аминокислоту).

В WO 01/77158 описаны слитые белки ядерного антигена вируса гепатита В, в которых гетерологичные эпитопы встроены предпочтительно в область между положениями 61 и 90. В US 2003/0198649 описаны частицы ядерного антигена вируса гепатита В, в которых иммуногены соединены посредством лигандных структур с ядерным белком вируса гепатита В (HBV). У Kratz и др., PNAS, 1999, cc.1915-1920 описана презентация GFP (зеленый флуоресцентный белок) на поверхности ядерного белка HBV. В данном случае аминокислоты 79 и 80 ядерного белка были заменены на состоящую из 238 аминокислот последовательность GFP.

У Nassal и др., Eur. J. Immunol., 2005, cc.655-665 описан продукт слияния полноразмерного белка OspA Borrelia burgdorferi и капсидного белка вируса гепатита В. И в этом случае также аминокислоты 79 и 80 были заменены аминокислотами с 18 по 273 белка OspA, однако при этом между ядерным белком и OspA были встроены линкерные последовательности. У Skamel и др. (Journal of Biological Chemistry, 2006, cc.17474-17481) описана презентация полноразмерного белка OspC Borrelia burgdorferi с помощью капсидоподобных частиц вируса гепатита В. Однако было установлено, что известные из существующего уровня техники модифицированные ядерные белки, предлагавшиеся для решения проблемы, не сохраняют тенденцию к образованию капсидоподобных частиц (CLP) требуемым образом и, следовательно, не обладают удовлетворительной способностью стимулировать иммунный ответ.

Это означает, что при генетическом встраивании чужеродных молекул на основе пептидов или белков в ядерный белок, чужеродную последовательность связывают с ядерным белком как на ее N-конце, так и на ее С-конце. При создании настоящего изобретения было установлено, что двухсторонняя связь резко ограничивает тип и набор пригодных чужеродных последовательностей.

Представленная в настоящем описании система с расщепленным ядром устраняет указанные ограничения за счет того, что ядерный белок создают в виде двух раздельных частей, которые, как неожиданно было установлено при создании изобретения, спонтанно взаимодействуют и образуют капсидные частицы подобно тому, как это происходит в случае непрерывной белковой цепи. Чужеродные молекулы можно сливать либо с N-концевым фрагментом («coreN»), либо с С-концевым фрагментом («coreC») и в результате этого они оказываются сцепленными с белком-носителем только через один конец. За счет этого в значительной степени устраняются обусловленные двухсторонней связью структурные ограничения на встраивание чужеродных последовательностей в непрерывную пептидную цепь ядерного белка.

Таким образом, система с расщепленным ядром, предлагаемая в изобретении, позволяет осуществлять:

(I) презентацию чужеродных молекул, которые вследствие своего размера и/или структуры могут презентоваться в контексте обычного непрерывного ядерного белка лишь в ограниченной степени или не могут презентоваться вообще;

(II) презентацию гетеродимерных чужеродных белков;

(III) презентацию обладающих способностью к взаимодействию чужеродных молекул в гибкой хорошо доступной форме, что существенно облегчает взаимодействие с требуемыми молекулами-партнерами;

(IV) презентацию дополнительных чужеродных молекул через посредство других «выставленных наружу» N- и С-концов, которые присутствуют в системе с расщепленным ядром, но не присутствуют в обычной системе с непрерывным ядром.

Вирусы гепатита В (HBV) представляют собой оболочечные вирусы. Внутренний нуклеокапсид называется также коровой (ядерной) частицей («ядром») и серологически его определяют как ядерный антиген вируса гепатита В (HBcAg). Ядра состоят из 180 или 240 копий ядерного белка длиной 183-185 ак (в зависимости от подтипа HBV). Ядерный белок может экспрессироваться гетерологично (в бактериях, дрожжах, эукариотических клетках); при этом спонтанно образуются «капсидоподобные частицы» (т.е. CLP). Эти частицы являются неинфекционными, поскольку они не содержат ни вирусный геном, ни внешнюю оболочку. Такие CLP можно получать также из HBV более близкородственных млекопитающих (например, сурка; суслика и др.) и из HBV находящихся в более дальнем родстве птиц (например, утки; цапли и др.). В принципе, согласно изобретению можно применять любые HBV-последовательности, однако предпочтительными являются последовательности HBV, которые способны заражать человека.

Аминокислотная последовательность, соответственно нуклеотидная последовательность ядерного белка HBV являются известными (см. Galibert и др., Nature, 1979, cc.646-650; Nassal, Gene, 1988, cc.279-294 или WO 01/77158; указанные публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). Предпочтительно применяют последовательность ядерного белка подтипа ayw, но можно применять также варианты, модификации HBV-последовательности, а также последовательность HBV других млекопитающих или HBV птиц. Последовательности хранятся в доступных для научной общественности банках генов.

Помимо патогенного для человека вируса гепатита В (HBV в узком смысле) существует целый ряд родственных специфических в отношении конкретного вида животных вирусов гепатита В, например, HBV североамериканского лесного сурка (английское название: лесной сурок; зоологическое название: Marmota monax; вирус гепатита В сурка, т.е. WHV), калифорнийская земляная белка (английское название: калифорнийская земляная белка, зоологическое название: Spermophilus beecheyi, вирус гепатита В земляной белки, т.е. GSHV) и др.

Эти вирусы обладают генетической структурой, сходной со структурой человеческого HBV, но имеют выраженные отличия в своей нуклеотидной последовательности и, как следствие, в аминокислотной последовательности своих белков.

Применение ядра человеческого HBV в качестве носителя для вакцины имеет два возможных ограничения.

1. Часть индивидуумов, страдающих хронической HBV-инфекцией, обладает толерантностью к антигенам HBV (это отсутствие иммунного ответа обусловливает, в частности, персистентность инфекции). Ядро действует также в качестве зависимого от Т-клетки антигена (Т-зависимый антиген). Поэтому Т-клеточные эпитопы в последовательности ядерного белка вносят вклад в сильную иммуногенность вакцин на основе CLP ядерных HBV. Это, по-видимому, не оказывает воздействия на индивидуумов, хронически инфицированных HBV, поскольку их Т-клетки толерантны к ядру HBV. Однако не имеется такой толерантности к ядру WHV и HBV других животных (см. Billaud J.N. и др., Advantages to the use of rodent hepadnavirus core proteins as vaccine platforms. Vaccine, 25(9), 19 февраля 2007 г., cc.1593-606). Для этого специфического круга индивидуумов, которые потенциально могут быть подвергнуты вакцинации, применение ядерного белка HBV животных в качестве носителя может иметь преимущество.

2. Благодаря своей очень сильной иммуногенности ядро вызывает сильный В-клеточный ответ к ядру (антитела к HBcAg) у всех индивидуумов, остро или хронически инфицированных HBV; кроме того, характерным является то, что в организме излеченных индивидуумов образуются антитела к оболочечным белкам HBV (антитела к HBsAg). Применяемые в настоящее время профилактические вакцины против HBV-инфекции основаны исключительно на оболочечных белках HBV (HBsAg). Таким образом, успешная вакцинация приводит, также как и перенесенная инфекция, к образованию антител к HBsAg. В определенных случаях с точки зрения диагностики представляет интерес выяснение того, приобрел ли индивидуум антитело к HBsAg в результате инфекции или после HbsAg-вакцинации, это можно определить путем обнаружения антитела к HbcAg, которое образуется только после инфекции.

Вакцина на основе ядра HBV человека может вызывать помимо требуемого ответа на внедрившийся чужеродный белок также определенный ответ к ядру (антитело к HBcAg). В том случае, когда одновременно присутствует антитело к HbsAg, это может затруднять выявление различия между результатами HBV-инфекции и HbsAg-вакцинации.

В случае системы с расщепленным ядром производство антитела к HBcAg уже является минимальным, поскольку основной эпитоп, а именно с/е1, физически разделен, и поэтому не может более распознаваться большинством антител к HBcAg. Однако сохраняется остаточный ответ в виде антитела к HBcAg на другие области последовательности ядерного белка. Этот ответ можно предупреждать или дополнительно снижать путем применения ядерного белка нечеловеческого HBV, предпочтительно ядерного белка WHV, в качестве основы носителя.

Наиболее важными компонентами системы-носителя с расщепленным ядром, предлагаемой в изобретении, являются, во-первых, ядерный белок вируса гепатита В и, во-вторых, чужеродная молекула, к которой требуется вызвать иммунный ответ.

В наиболее широком варианте осуществления изобретения ядерный белок получают из любого вируса гепатита В. Известны различные типы вируса гепатита В. Согласно изобретению предпочтительно применяют те последовательности, которые выведены из вирусов гепатита В, выделенных из млекопитающих и обладающих специфичностью к ним. Наиболее предпочтительно применяют HBV человека. Однако наряду с этим можно применять также такие вирусы гепатита В, которые имеют последовательность ядерного белка, происходящую из других животных, например, птиц, таких как утки или цапли.

Другой компонент, а именно, чужеродная молекула, к которой требуется вызвать иммунный ответ, в принципе может представлять собой любую молекулу. В данном случае предпочтительными являются белковые последовательности и наиболее предпочтительно те белковые последовательности, которые присутствуют на поверхности патогенов и которые вступают в контакт с иммунной системой. Если иммунная система способна продуцировать антитела к таким поверхностным структурам патогенов, то последние инактивируются после контакта с отдельными компонентами иммунной системы вакцинированного пациента, при этом проникнувший патоген, как правило, разрушается.

На основе сравнения имеющихся в базах данных последовательностей вируса гепатита В сурка (WHV) с аминокислотной последовательностью ядерного белка HBV (подтипа ayw) было установлено, что они идентичны друг другу примерно на 60%. Наибольшие различия в последовательностях выявлены в области, находящейся между аминокислотными положениями 66 и 94, причем эта последовательность включает эпитоп с/е1 и в системе с расщепленным ядром HBV, предлагаемой в изобретении, сайт рестрикции между N-концевой областью и С-концевой областью ядерного белка. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения этот сайт рестрикции расположен между аминокислотами 79 и 81.

Для создания систем носителей с расщепленным ядром WHV, предлагаемых в изобретении, последовательности ядерного белка WHV расщепляли на уровне нуклеиновой кислоты между положением 79 (кодирует аминокислоту Glu) и положением 80 (кодирует аминокислоту глутамин). На нуклеотидном уровне последовательность, кодирующую сайт расщепления BamHI, добавляли на карбокси-конец N-концевого сегмента ядерного белка WHV (сокращенно обозначен как WcoreN). За ним вплотную расположен второй рибосомальный сайт связывания, а также сайт, расщепляемый эндонуклеазой Nde1, который, в свою очередь, перекрывается стартовым кодоном сегмента coreC WHV (WcoreC). Это расположение идентично предпочтительному расположению в соответствующих конструкциях с расщепленным ядром HBV. Это позволяет осуществлять перенос вставок непосредственно из одной системы в другую с помощью расщепления в BamHI-Nde1-сайтах. В представленном в данном описании случае WcoreN содержит благодаря встроенному сайту рестрикции BamHI консервативную замену, а именно, E79D, и, кроме того, Р в качестве C-концевой аминокислоты. Это не оказывает вредного воздействия на способность образовывать частицы, и C-концевой пролин, благодаря его устойчивости к действию протеазы, повышает стабильность расщепленного белка. Аналогично расщепляемому ядру HBV WcoreC содержит дополнительный стартовый кодон метионина, в данном случае расположенные перед Q80 (перед S81 в случае HBV). Эта конструкция с расщепленным ядром WHV так же эффективно образует частицы, как и соответствующая конструкция с расщепленным ядром HBV.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения С-концевая область и N-концевая область ядерного белка могут происходить из различных вирусов гепатита В. В этом случае гибридная система-носитель с расщепленным ядром, предлагаемая в изобретении, имеет три главных компонента, а именно, N-концевую область ядерного белка из вируса гепатита В, например, вируса гепатита В человека, чужеродную молекулу, к которой иммунная система может вырабатывать ответ, и С-концевую область ядерного белка, происходящую из другого вируса гепатита В, например, из WHV. Такая гибридная конструкция с расщепленным ядром также без каких-либо проблем образует частицы. Поскольку аминокислотные последовательности ядерных белков из различных вирусов гепатита В отличаются друг от друга, то В- и Т-клеточные эпитопы также являются различными. Следовательно, с помощью гибридной системы с расщепленным ядром можно оказывать специфическое воздействие на иммунный ответ на конкретный носитель.

Для создания предпочтительных гибридных систем-носителей с расщепленным ядром, предлагаемых в изобретении, последовательность ядерного белка WHV расщепляли на уровне нуклеиновой кислоты между положением 79 (кодирует аминокислоту Glu) и положением 80 (кодирует аминокислоту глутамин). На нуклеотидном уровне последовательность, кодирующую сайт рестрикции BamH1, добавляли на карбокси-конец N-концевого сегмента ядерного белка WHV (сокращенно обозначен как WcoreN). За ним расположен вплотную второй рибосомальный сайт связывания, а также сайт, расщепляемый эндонуклеазой Nde1, который, в свою очередь, перекрывается стартовым кодоном сегмента coreC WHV (WcoreC). Это расположение идентично предпочтительному расположению в соответствующих конструкциях с расщепленным ядром HBV. Это позволяет осуществлять перенос вставок непосредственно из одной системы в другую с помощью расщепления в BamH1-Nde1-сайтах. В представленном в данном описании случае WcoreN содержит благодаря встроенному сайту рестрикции BamH1 консервативную замену, а именно, E79D, и, кроме того, Р в качестве C-концевой аминокислоты. Это не оказывает вредного воздействия на способность образовывать частицы, и C-концевой пролин, благодаря его устойчивости к действию протеазы, повышает стабильность расщепленного белка. Аналогично расщепленному ядру HBV WcoreC содержит дополнительный стартовый кодон метионина, в данном случае перед Q80 (перед S81 в случае HBV). Оказалось, что эта конструкция может без проблем образовывать частицы.

CLP встречающегося в естественных условиях HbcAg, а также рекомбинантного HBV, обладают высокой иммуногенностью (независимый от Т-клетки и зависимый от Т-клетки антиген). Существенное значение для этого имеет симметричная мультимерная состоящая из частиц структура ядерной частицы. Эту структуру можно выявлять с помощью обычной электронной микроскопии с «негативным окрашиванием», а также с помощью электронной криомикроскопии. Структуру, состоящую из отдельных частиц, можно выявлять биохимическим методом с помощью седиментации в градиентах плотности сахарозы (коэффициент седиментации в зависимости от варианта составляет 60-80 S; для сравнения: коэффициент седиментации растворимых мономерных белков: примерно 1-5 S; эукариотических рибосомальных субъединиц: 40 S + 60 S). Кроме того, частицы отличаются специфическими миграционными характеристиками при нативном гель-электрофорезе в агарозных гелях, которые отличны от миграционных характеристик форм, не состоящих из частиц. Это позволяет определять, могут ли образовываться CLP или присутствуют белки, не образующие CLP-структуру.

Ядерный белок HBV содержит 183 или 185 аминокислот (ядерный белок WHV содержит 187 аминокислот) и состоит из двух доменов: первые примерно 140 ак необходимы и достаточны для сборки CLP (домен сборки); C-концевая область богата основными ак и связывается с нуклеиновыми кислотами. Укороченный на С-конце вариант ядерного белка (ак 1-149) экспрессировался в исходных экспрессионных системах Е.coli существенно более эффективно, чем полноразмерный белок. Поэтому CLP ядерного белка 1-149, т.е. без домена, связывающего нуклеиновую кислоту, использовали для исследований структур с помощью электронной микроскопии (ЭМ) умеренного и высокого разрешения. Это позволило определить кристаллическую структуру CLP и белка. Как и было предсказано на основе биохимических данных, ядерный белок образует очень стабильные симметричные димеры, которые собираются в ансамбль с образованием CLP, состоящих из 90 или 120 димеров.

Ядерные частицы имеют выраженные «шипы»; каждый димер образует «шип», структура которого представляет собой состоящий из 4 спиралей пучок, в котором каждый мономер имеет две длинные α-спирали, расположенные в центре аминокислотной последовательности. Кончики «шипов» содержат аминокислоты (ак), соответствующие области с ак 74 по ак 85. Эта область несет также иммунодоминантный B-клеточный эпитоп HBcAg (эпитоп с/е1), и ее очень высокая иммуногенность может объясняться тем, что указанные остатки «выставлены» на поверхность.

На фиг.1 схематично изображена структура ядерного белка. Первичная последовательность ядерного белка HBV изображена в левой части фиг.1. Полноразмерный белок состоит из 183 ак (некоторые подтипы HBV имеют 185 ак); для образования CLP необходимы только примерно 140 N-концевых ак (домен сборки); предпочтительно C-концевая ак находится в положении 149; His-метку можно сливать с этим положением и с любым другим последующим положением по ходу транскрипции вплоть до ак 183, не нарушая CLP. Эпитоп с/е1 расположен в области ак 78-83 и образует часть петли между центральными α-спиралями (внизу слева). Спирали сами по себе могут быть укороченными, по-видимому, минимально необходимыми являются аминокислотные остатки вплоть до положения Gly73 в coreN и ак-остатки, начиная с Gly94 в coreC. В правой части фиг.1 представлено схематическое изображение димера ядерного белка. Показаны только две центральные спирали мономера. Эпитоп с/е1 расположен на поверхности частицы.

Для успешного образования частиц аминокислотная последовательность ядра должна включать область ак по меньшей мере вплоть до положения 140, предпочтительно по меньшей мере до положения 149, но она может простираться дальше вплоть до C-концевой ак 183 или ак 185, в зависимости от подтипа HBV. Часть аминокислотной последовательности, расположенная по ходу транскрипции за положением 140, а лучше за положением 149, можно заменять чужеродной последовательностью, которая после этого, как правило, попадает внутрь CLP. Такие чужеродные аминокислоты не приводят к образованию основных антител, однако они могут выполнять другие функции.

Благодаря чрезвычайно высокой иммуногенности HbcAg рекомбинантные CLP HBV представляют интерес с точки зрения применения в качестве повышающего иммуногенность носителя чужеродных антигенов.

Альтернативным путем решения является химическое сочетание чужеродных молекул с заранее сформированными CLP. В настоящем изобретении предложено генетическое слияние чужеродных аминокислотных последовательностей с ядерным белком. На основе эмпирических данных даже до определения кристаллографической структуры с помощью рентгеновских лучей было установлено, что область эпитопа с/е1 наилучшим образом приспособлена для индуцирования сильных B-клеточных ответов. В настоящее время, принимая во внимание указанную структуру, стало очевидным, что такие слияния представляют собой вставки в область петли, находящуюся между центральными спиралями. Поскольку указанная петля сама по себе не несет никакой структурной функции, то 3D-структура ядерного белка может, по крайней мере в принципе, сохраняться после инсерции чужеродных последовательностей. В зависимости от встроенной чужеродной последовательности некоторые из слитых белков могут сохранять способность образовывать регулярные CLP, хотя это не всегда гарантировано, поскольку чужеродная аминокислотная последовательность может оказывать негативное влияние на формирование структуры слитого белка. С другой стороны, состоящая из отдельных частиц структура является важной для обеспечения высокой иммуногенности.

Ранее уже встраивали многочисленные чужеродные последовательности в ядерный белок и в некоторых случаях экспериментально было выявлено повышение иммуногенности (Ulrich и др., Adv. Virus Res., 1998, cc.141-182). Однако, поскольку многие попытки встраивания относительно длинных чужеродных последовательностей, состоящих более чем из примерно 40 ак, оказались неудачными (частицы переставали образовываться), то было сделано предположение о том, что существует обусловленная естественными факторами ограниченная способность к включению чужеродных последовательностей, т.е. их длина может составлять вплоть до 40 ак или в особом случае вплоть до 120 ак.

Было установлено, что чужеродные аминокислотные последовательности, слитые на С-конце и на N-конце с ядерным белком, образуют частицы только в том случае, когда они удовлетворяют по меньшей мере двум необходимым критериям:

(I) 3D-структура чужеродного белка должна быть устроена таким образом, чтобы его N-конец и С-конец соответствовали пространственному положению сайтов связывания в ядерном белке (С-концу N-концевого ядерного фрагмента, т.е. ядерным ак от примерно 1 до примерно 78 [coreN]; N-концу C-концевого ядерного фрагмента, т.е. ядерным ак от примерно 80 до 149 или 183 [coreC]);

(II) если чужеродный белок сам по себе способен к гомомерным взаимодействиям (с образованием димеров, тримеров и т.д.), то структура указанных гомоолигомеров, по-видимому, должна также соответствовать структуре обоих фрагментов ядерного белка.

Таким образом, чужеродные белки, N- и С-концы которых расположены близко друг к другу в нативной 3D-структуре, хорошо приспособлены для презентации в описанных ранее слитых белках. GFP удовлетворяет обоим этим требованиям, но многие другие белки не удовлетворяют им; одним из примеров таких белков является белок А наружной оболочки (поверхностный белок А, OspA) возбудителя болезни Лайма, т.е. Borrelia burgdorferi, N- и С-концы которого расположены на противоположных сторонах длинной 3D-структуры.

Встраивание OspA или других белков, имеющих аналогичную неблагоприятную структуру, приводит к возникновению напряжений в слитом белке. Могут иметь место следующие ситуации: либо чужеродный белок сохраняет правильную укладку и препятствует сближению двух фрагментов ядерного белка друг с другом, препятствуя тем самым их укладке и последующей димеризации и образованию частиц; либо укладка фрагмента ядерного белка мешает укладке чужеродного белка, так что она либо более не является нативной (т.е. изменяется антигенность), либо, если укладка в значительной степени отсутствует, то происходит агрегация.

В случае OspA эту проблему оказалось возможным преодолеть лишь частично за счет применения очень длинных линкерных последовательностей. Эти линкерные последовательности, прежде всего при их применении в вакцинах, могут вызывать проблему, заключающуюся в том, что они сами могут обладать нежелательной антигенностью, которая может приводить к вредным перекрестным реакциям, например, с эндогенными антигенами. Кроме того, соответствующие белковые препараты обладали лишь очень ограниченной способностью к образованию регулярных CLP.

Вследствие димерной структуры ядерного белка-носителя и геометрически ограниченной поверхности частиц-носителей в случае очень больших чужеродных белков или чужеродных белков, имеющих структуру, сильно отличающуюся от сферической, может дополнительно возникать проблема, обусловленная общей стерической помехой (пространство, доступное на «сферической поверхности» CLP, ограничено). Максимальный размер чужеродного белка зависит от нескольких факторов. С помощью способа, предлагаемого в изобретении, уже удалось презентовать чужеродный белок, состоящий примерно из 320 ак (CSP).

Таким образом, объектом настоящего изобретения является вакцина с расщепленным ядром, которая содержит в виде отдельных полипептидов coreN-домен и coreC-домен ядерного белка вируса гепатита В и по меньшей мере одну чужеродную аминокислотную последовательность, к которой требуется вызвать гуморальный и при необходимости клеточный иммунный ответ, где указанная чужеродная аминокислотная последовательность слита с С-концом coreN-домена или с N-концом coreC-домена и ядерный белок обладает способностью образовывать капсидоподобные частицы. Предпочтительно система-носитель обладает способностью вызывать ответ в виде нейтрализующих антител.

Очень важно, чтобы ядерный белок в вакцине на основе расщепленного ядра, предлагаемой в изобретении, был расщеплен, т.е. разделен в области эпитопа с/е1, т.е. примерно между аминокислотами 73 и 94. Затем чужеродную аминокислотную последовательность можно сшивать с С-концом coreN-области. В этом случае N-конец coreC-фрагмента начинается с аминокислоты, на которой был расщеплен coreN-белок. Можно также изымать путем делеции часть эпитопа с/е1, т.е. удалять одну или несколько аминокислот из области между аминокислотами 73 и 94. В альтернативном варианте можно чужеродную аминокислотную последовательность, к которой требуется вырабатывать антитела, сливать с N-концом coreC-области. В этом случае C-концевая область coreN-фрагмента оканчивается аминокислотой, в которой был расщеплен ядерный белок. Основное свойство, которое должна сохранить вакцина на основе расщепленного ядра, заключается в том, что частицы вакцины на основе расщепленного ядра, несущие слитые с ними чужеродные аминокислотные последовательности, все еще должны обладать способностью образовывать ядерные капсидоподобные частицы. Это проверяют либо с использованием градиента сахарозы, либо с помощью нативного электрофореза в агарозном геле. Можно применять также анализ с использованием электронного микроскопа.

Чужеродная аминокислотная последовательность, к которой требуется вырабатывать антитела, предпочтительно представляет собой последовательность, происходящую из поверхностных структур микроорганизмов. Такие микроорганизмы, как правило, вызывают заболевание у человека. Если могут образовываться нейтрализующие антитела к таким структурам, то это приводит к тому, что иммунная защита может очень быстро удалять проникшие микроорганизмы. Примером бактерии, разработка вакцины против которой продвинулась уже довольно далеко, является Borrelia burgdorferi, возбудитель болезни Лайма. Чужеродные аминокислотные последовательности, которые предпочтительно применяют согласно изобретению, представляют собой последовательности поверхностных белков OspA и OspC Borrelia burgdorferi. Однако чужеродные аминокислотные последовательности могут представлять собой также другие последовательности, происходящие из патогенных организмов. Их примером может служить возбудитель малярии Plasmodium falciparum.

Другими чужеродными аминокислотными последовательностями, к которым могут вырабатываться антитела, являются последовательности, происходящие из вирусов. Предпочтительно применяют аминокислотные последовательности, происходящие из белков вирусов, которые вступают в контакт с иммунной системой организма-хозяина. Такими белками являются, прежде всего, поверхностные белки, поскольку, как правило, они первыми вступают в контакт с иммунной системой организма-хозяина. Однако они могут представлять собой также белки, которые высвобождаются в процессе жизненного цикла вируса. В зависимости от типа вируса они могут представлять собой, например, вирусные ядерные белки или нуклеокапсидные белки.

Однако предлагаемую в настоящем изобретении вакцину с расщепленным ядром можно применять для создания не только антител к экзогенным аминокислотным последовательностям, но также и антител к нежелательным эндогенным структурам, таким, например, как маркеры опухоли. Опухолевые клетки часто экспрессируют поверхностные маркеры, отличные от маркеров, экспрессируемых здоровыми клетками. Таким образом, если в вакцине на основе расщепленного ядра презентуются эндогенные аминокислотные последовательности, то вызывается иммунный ответ, заставляющий организм вырабатывать в увеличенном количестве антитела к указанным опухолевым клеткам. С помощью таких антител иммунная защита может легко распознавать и в конце концов уничтожать опухолевые клетки. Однако система-носитель, предлагаемая в изобретении, может индуцировать также клеточный иммунный ответ, что может повышать эффективность борьбы.

Настоящее изобретение относится также к способу получения вакцины против гетерологичной белковой последовательности. Вакцина с расщепленным ядром содержит две части ядерного антигена вируса гепатита В, причем либо гетерологичная белковая последовательность слита с coreN-областью белка, либо coreC-область слита с С-концом гетерологичной белковой последовательности. Положение в аминокислотной цепи, в котором два домена отделяют друг от друга, находится между положением 73 и положением 94. Индивидуальные аминокислоты могут быть удалены из этой области, представляющей собой эпитоп с/е1.

Способ, предлагаемый в изобретении можно осуществлять в принципе двумя различными путями. Если две части антигена с расщепленным ядром экспрессируются в виде только одной полипептидной цепи, то последовательность, распознаваемую протеазой, встраивают в требуемое положение согласно изобретению. Это позволяет расщеплять полипептид протеазой на две определенные части. В этом варианте осуществления изобретения можно также осуществлять коэкспрессию протеазы, которая расщепляет последовательность в определенном сайте. Последовательность гена, кодирующая ее, может располагаться либо на том же самом векторе, либо на отдельном векторе.

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения два указанных выше полипептида экспрессируют с использованием специального вектора. Предпочтительно применяют «бицистронный» вектор. Это означает, что одну часть вакцины с расщепленным ядром экспрессируют в виде полипептидной цепи и что стоп-кодон расположен на С-конце. Однако вскоре после этого можно снова применять рибосомы и осуществлять экспрессию второго полипептида. Это гарантирует то, что обе части вакцины с расщепленным ядром продуцируются примерно в равных количествах и не требуется принимать меры для того, чтобы организм-хозяин не потерял один из векторов, что может привести к тому, что будет присутствовать только одна часть вакцины с расщепленным ядром.

Понятие «слитый белок» или «слитый с» означает, что два различных белка или полипептида связаны друг с другом с помощью пептидной связи. Такие слитые белки образуются в результате экспрессии кодирующих их нуклеотидных последовательностей, которые присоединяют друг за другом.

При создании настоящего изобретения было установлено, что основная связанная с химией белка проблема с точки зрения широкой применимости системы-носителя HBV-CLP (конкретно в качестве носителя вакцины, как правило, для презентации чужеродных молекул) возникает при двухстороннем сцеплении встроенного чужеродного белка на его N- и С-концах. Количество и тип чужеродных белков, которые можно встраивать, резко возрастает в том случае, если оказывается возможным освободить любую одну из двух ковалентных связей (на N- или С-конце вставки) и, если, тем не менее, при этом происходит образование частиц, поскольку разделенные фрагменты ядерного белка («расщепленного ядра») обнаруживают друг друга и правильно укладываются. Это является важным объектом настоящего изобретения.

На фиг.2 схематично показано, что встраивание чужеродного белка, имеющего неблагоприятную 3D-структуру (например, OspA), может препятствовать формированию компетентной в отношении образования частиц структуры ядерного белка-носителя (верхняя часть схемы); в другом варианте образование правильной 3D-структуры носителя ядерного белка может препятствовать образованию нативной 3D-структуры чужеродного белка (нижняя часть схемы). Это может оказывать негативное воздействие на связывание требуемых антител. Эту стерическую проблему можно устранять, если освободить (обозначено стрелкой) одну из двух ковалентных связей между вставкой, представляющей собой чужеродный белок, и носителем (на С-конце или на N-конце вставки). Одним из возможных путей достижения этого является последующее расщепление непрерывного слитого белка, для чего необходимо дополнительно встраивать сайт, расщепляемый специфической протеазой. Поэтому предпочтительно с самого начала осуществлять экспрессию двух фрагментов в виде отдельных единиц.

Решение, предлагаемое в изобретении, открывает также и другие возможности:

(I) поскольку эпитоп с/е1 расположен на поверхности частицы, то на этой поверхности образуются новые N- и С-концы, которые можно дополнительно дериватизировать. Например, чужеродную молекулу Х можно сливать с coreN-фрагментом и чужеродную молекулу Y можно сливать с coreC-фрагментом. Возможным применением является презентация гетеродимерных чужеродных молекул. Однако следует иметь ввиду, что в этом случае не должно быть стерической помехи для обеих частей, присоединяемых путем слияния.

(II) специфические подобласти встроенной чужеродной последовательности, например, особенно важный эпитоп, могут быть ориентированы по направлению к поверхности частицы или от нее, в зависимости от сцепления через N-конец или С-конец. Одним из примеров является так называемый «LA2-эпитоп» OspA В. burgdorferi, который, как было установлено, находится в C-концевой области. Антитела, которые распознают этот эпитоп, обладают нейтрализующим действием.

Это важно также для встраивания чужеродных последовательностей, которые, в свою очередь, презентуют дополнительные поверхности для взаимодействия (для присоединения третьих молекул, см. примеры). Поскольку обладающая способностью к взаимодействию чужеродная последовательность сцеплена только на одной стороне, то ее не ограничивает никакая 3D-структура; напротив, в зависимости от типа, она может обладать гибкостью или может без помех образовывать правильную 3D-структуру. Это существенно облегчает взаимодействия с партнером по взаимодействию.

Настоящее изобретение относится так