Способ количественного определения антиоксиданта коэнзима q10 в субстанции методом циклической вольтамперометрии

Способ количественного определения антиоксиданта коэнзима q10 в субстанции методом циклической вольтамперометрии

Реферат

Изобретение относится к области фармацевтической химии и касается способов количественного определения биологически активных веществ, в частности коэнзима Q₁₀ - вещества с выраженными антиоксидантными свойствами.

Существует ряд способов определения коэнзима Q₁₀ как в лекарственных формах, так и в биологических объектах. Но большинство из них содержат сочетания различных методов. Примером определения коэнзима Q₁₀ с электрохимическим детектированием является работа (Y.Yamamoto, S.Yamashita. Plasma ratio of ubiquinol and ubiquinone as a marker of oxidative stress. 1997, V.18, №81, P.79-84).

Исследовано соотношение между убихинолом и убихиноном в качестве маркера интенсивности окислительного стресса в организме человека и предложена методика одновременного определения убихинола-10 и убихинона-10 в плазме крови человека. Плазму, содержащую гепарин, смешивали с 5 объемами метанола и 10 объемами гексана, энергично встряхивали и центрифугировали. Центрифугат (гексановую фазу) немедленно инжектировали в режиме online в систему обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с колонкой для восстановления и электрохимическим детектором для предотвращения окисления убихинола до убихинона.

Данный способ очень трудоемок, обладает плохой воспроизводимостью, имеет большую ошибку определения.

Для идентификации коэнзима Q₁₀ в лекарственных формах используются методы жидкостной хроматографии и спектроскопии [И.С.Иванов. Связь структуры и токсичности в ряду производных изоборнилфенола // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии: Матер. конф. / Под ред. В.В.Жданова. - Томск: Изд-во Том. ун-та, 2007, 106 с.). Эти методы имеют ряд недостатков: оборудование и растворители для высокоэффективной жидкостной хроматографии имеют высокую стоимость, а спектрофотометрия в некоторых случаях не обладает необходимой селективностью и чувствительностью.

Наиболее близким к предлагаемому решению прототипом является высокочувствительная методика определения коэнзима Q₁₀ в этанол-гексановых экстрактах сыворотки крови человека, основанная на ВЭЖХ с 8 кулонометрическими детекторами, настроенными на различные фиксированные значения потенциалов (P.H.Gamache, I.N.Acworth. Simultaneous analysis of fat soluble carotenoids, retinoids, tocopherols, vitamin K and coenzyme Q₁₀ in plasma // Northeast Regional Chromatography Discussion Group. 1998, Book of Abstr. - P.6). Нижняя граница определяемых содержаний <20 пг, а диапазон линейной зависимости составляет 3 порядка.

Недостатком способа является высокая себестоимость и уникальность оборудования, что затрудняет его использование в рутинных анализах, мешающее влияние ряда компонентов сыворотки крови.

Перспективно использование вольтамперометрии для количественного определения биологически активных веществ - простого, чувствительного и экспрессного метода.

Новая техническая задача - увеличение чувствительности и экспрессности, а также уменьшение себестоимости способа определения коэнзима Q₁₀ в субстанции биологически активных добавок методом циклической вольтамперометрии.

Съемка вольтамперных кривых проводится при скорости развертки потенциала W 0.04 В/с в диапазоне потенциалов (Е) от -0.5 до +0.5 В. Фоновым электролитом служит 0.025 М фосфатный буфер pH 6.86. Для устранения мешающего влияния кислород из раствора удаляется продувкой фонового раствора азотом, подаваемым в ячейку под давлением.

Регистрация вольтамперных кривых проводится в постоянно-токовом режиме развертки потенциала. В качестве индикаторного электрода используется стеклоуглеродный электрод (СУЭ), электродом сравнения и вспомогательным служили хлорид-серебряные электроды. В качестве оборудования для проведения анализа использовали вольтамперометрический анализатор «ТА-2» (производство «ООО Томьаналит», г.Томск).

В результате проведенных исследований были получены пики окисления-восстановления коэнзима Q₁₀ при потенциалах Е_а +0.23 В,

Е_к-0.06 В (фиг.).

Фиг. Циклическая вольтамперограмма коэнзима Q₁₀ в фосфатном буфере pH 6.86 на СУЭ при скорости развертки 40 мВ/с: 0.1×10^-5 моль/л (2), 0.2×10^-5 моль/л (3), 0.3×10^-5 моль/л (4), (1) - фоновая линия

Аналитическим сигналом служит анодный ток окисления коэнзима Q₁₀.

Градуировочная зависимость тока окисления коэнзима Q₁₀ от его концентрации в фоновом растворе носит линейный характер в диапазоне концентраций 10^-5-10^-6 моль/л. Данный диапазон концентраций достаточен для определения коэнзима Q₁₀ в биологически активных добавках.

Новым в способе является использование в качестве аналитического сигнала тока окисления коэнзима Q₁₀ на стеклоуглеродном электроде при потенциале Е +0.23 В относительно хлорид-серебряного электрода сравнения в фосфатном буферном растворе с pH 6.86.

Пример 1. Определение коэнзима Q₁₀ в субстанции методом циклической вольтамперометрии.

В кварцевый стаканчик вместимостью 20 мл вносят 10,0 мл раствора фонового электролита 0.025 моль/л фосфатного буфера pH 6.86 в водном растворе и помещают в электрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора. Опускают в раствор электроды: индикаторный - стеклоуглеродный, вспомогательный и электрод сравнения - насыщенные хлорид-серебряные. Перемешивают 10 с, успокаивают 20 с, затем фиксируют циклическую вольтамперограмму фонового раствора в диапазоне потенциалов от -0.5 до +0.5 В при скорости развертки потенциала 0.04 В/с. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем в стаканчик с фоновым раствором вносят аликвоту 1% раствора коэнзима Q₁₀ в воде объемом 0.5 мл. Перемешивают раствор 10 с, успокаивают 20 с и вновь снимают вольтамперограмму в тех же условиях. Анодный пик регистрируют при потенциале +0.23 В. Концентрацию коэнзима Q₁₀ по высоте анодного пика определяют методом градуировочного графика, построенного по стандартным растворам коэнзима Q₁₀ с точно известными концентрациями.

Предложенный способ количественного определения коэнзима Q₁₀ отличается простотой, не требует больших трудозатрат, значительного количества реактивов и отличается высокой селективностью, экспрессностью и чувствительностью.

Предложенный способ может быть использован для количественного определения коэнзима Q₁₀ в порошке, его лекарственных формах, биологически активных добавках.

Метрологические характеристики данного способа: предел обнаружения составляет 1·10^-7 моль/л. Относительная ошибка определения: 5%, область определяемых содержаний коэнзима Q₁₀ от 1·10^-7 моль/л до 1·10^-5 моль/л.

Способ количественного определения антиоксиданта коэнзима Q₁₀ в субстанции, включающий перевод вещества из пробы в раствор и вольтамперометрическое определение коэнзима Q₁₀, отличающийся тем, что проводят вольтамперометрическое определение с использованием индикаторного стеклоуглеродного электрода относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода на фоне 0,025 моль/л фосфатного буфера pH 6,86 с последующей регистрацией анодных пиков при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 0,04 В/с, концентрацию коэнзима Q₁₀ в субстанции определяют по высоте анодного пика при потенциале +0,23 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода, область определяемых содержаний коэнзима Q₁₀ от 1·10^-7 моль/л до 1·10^-5 моль/л.