Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus. musculus - 1e7, продуцирующий моноклональное антитело, иммунореактивное с белком гемагглютинина пандемического вируса гриппа а/iiv-moscow/01/09(h1n1)sw1

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши mus. musculus - 1e7, продуцирующий моноклональное антитело, иммунореактивное с белком гемагглютинина пандемического вируса гриппа а/iiv-moscow/01/09(h1n1)sw1

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии и касается получения нового штамма гибридных клеток Mus. Musculus (1E7) - продуцента моноклональных антител к белку гемагглютинина пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1, которые можно использовать для дифференциальной диагностики пандемического вируса от сезонных вирусов гриппа А.

Проблема гриппа - одна из актуальнейших научных проблем последнего столетия. Среди людей активно циркулировали или циркулируют вирусы с тремя подтипами гемагглютинина (НА) - H1, H2, Н3 и двумя подтипами нейраминидазы - N1, N2. Точечные мутации, особенно в генах, кодирующих поверхностные белки (антигенный дрейф), позволяют вирусу преодолевать штаммоспецифический иммунитет. Второй вид изменчивости - обмен отдельными сегментами вирусного генома при условии одновременного инфицирования двумя или более подтипами вируса (антигенный шифт), может привести к появлению вирусов, к которым у населения полностью отсутствует иммунитет. Подобный вирус обладает пандемическими потенциями. Оптимальным хозяином, где может происходить событие реассортации, являются свиньи, имеющие два типа клеточных рецепторов - как для НА вирусов гриппа животных (в первую очередь, птиц), так и для НА вирусов гриппа человека. Так называемый вирус свиного гриппа распространен среди домашних свиней в США, Мексике, Канаде, Южной Америке, Европе, Кении, материковом Китае, Тайване, Японии и других странах Азии. При этом вирус может циркулировать в среде людей, птиц и других видов животных, и этот процесс сопровождается его мутациями.

В апреле 2009 года первые вспышки заболевания гриппом, вызванные новым штаммом вируса гриппа A(H1N1)sw1, наблюдались в Мексике и США. Молекулярно-биологический анализ показал, что генетический состав новых штаммов ранее не регистрировался среди вирусов гриппа свиней и человека [1, 2]. В июне 2009 года после выявления устойчивой передачи вируса в нескольких странах мира ВОЗ объявила о пандемии "свиного" гриппа [3]. Опасения ВОЗ связаны с генетической новизной штаммов и их потенциальными способностями к дальнейшей реассортации, вследствие чего возможно возникновение более агрессивных вариантов инфекции.

По данным Минздравсоцразвития Российской Федерации, в нашей стране впервые лабораторно подтвержденный случай заболевания вирусом гриппа A(H1N1)sw1 был зафиксирован 21.05.2009 г. у россиянина, вернувшегося из США. Выделенный штамм был идентифицирован, депонирован в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации (РФ) НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (новое наименование: ФГУ "НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского" Минздравсоцразвития России) и получил название A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 [4, 5].

Секвенирование полного генома вируса A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1 выявило аминокислотные замены в вирионных белках, отличающие штаммы A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1, A/New York/3205/2009 и A/California/04/2009(H1W1). В белках M1, M2 и РВ2 аминокислотных замен при сравнении со штаммом A/California/04/2009(H1N1) не обнаружено. Из анализа первичной последовательности генов московского штамма однозначно следует его большее родство со штаммом, изолированным в Нью-Йорке, по сравнению с Калифорнийским штаммом вируса уникальной заменой только для штамма A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1 и не обнаруженной ни у одного другого опубликованного в GenBank к настоящему времени штамма можно считать значащую замену в NA-гене кодона GAC на GGC, что привело к замене Asp на Gly в позиции 451 [5].

С июня по август 2009 года сотрудниками ФГУ "НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского" Минздравсоцразвигия России было изолировано 19 штаммов, у которых были выявлены единичные аминокислотные замены по сравнению с эталонным штаммом A/California/07/2009 (H1N1)sw1, что указывает на начавшуюся эволюцию пандемического штамма [6]. Смертность от пандемического вируса гриппа в мире составила более 1%, что на порядок выше показателей смертности от сезонного гриппа [7].

Быстрая, ранняя и надежная детекция циркулирующих вирусов гриппа, вирусологический и молекулярно-генетический мониторинг циркуляции пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1, изучение эволюции, чувствительности к противовирусным препаратам, изменения вирулентности и других фундаментальных свойств возбудителя является ключевой задачей для контроля заболевания. В качестве специфических иммунных реагентов для выявления и изучения антигенной структуры вирусов гриппа используют поликлональные (сывороточные) или моноклональные антитела (МКА).

ВОЗ в дополнение к вакцинации, как основной стратегии борьбы с гриппом, рекомендовано применение этиотропных химиопрепаратов. В настоящее время для лечения гриппа известно 2 класса препаратов: препараты адамантанового ряда и ингибиторы нейраминидазы. Пандемический вирус гриппа A(H1N1)sw1 оказался чувствительным к озельтамивиру, однако в настоящее время существуют данные о появление резистентых штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1 [8]. В связи с этим необходим поиск новых препаратов для профилактики и лечения гриппа человека. Одним из подходов является пассивная иммунизация с применение специфических человеческих МКА, однако исследования показали, что человеческие гибридомы характеризуются высокой нестабильностью продукции МКА. Новым перспективным направлением в биотехнологии является создание гуманизированных антител, которые могут быть использовать для профилактики и лечения человека. На основе мышиных МКА методом генной инженерии конструируются антитела «мышь-человек», Fab-фрагменты которых содержат гипервариабельные участки специфических иммуноглобулинов мышиных МКА, обладающих вируснейтрализующей активностью, а Fc-фрагменты (константная часть) происходят из иммуноглобулинов человека. Так как гуманизированные антитела содержат минимальное количество фрагментов мышиных антител, их можно использовать для профилактики и лечения человека. Данные об использовании гуманизириванных AT в отношении пандемического вируса гриппа A(H1N1)sw1 в литературе отсутствуют. В работе B.J.Hanson et al. приведены данные по изучению гуманизированных AT, которые были получены на основе двух МКА к вирусу гриппа A/H5N1 [9]. Профилактический и терапевтический эффект гуманизированных антител исследовали в опытах на мышах: разные количества МКА вводили до или после заражения летальной дозой вируса A/H5N1. Оказалось, что оба МКА были эффективны в профилактической схеме; в лечебной схеме одно из антител было более активно и показало полную протекцию от заболевания в концентрации 1 мг/кг веса. Таким образом, пассивная иммунизация может представлять собой альтернативную стратегию как для профилактики, так и для лечения пандемических вариантов вируса гриппа А.

Известны три зарубежные коллекции мышиных МКА к пандемическому вирусу гриппа A(H1N1)sw1, продуцируемые штаммами гибридных клеток животных [10, 11, 12]. Наиболее близким аналогом может служить штамм гибридных клеток Mus. Musculus, полученный к инактивированному пандемическому вирусу гриппа штамм A/California/07/2009 (H1N1)sw1 [10].

Аналоги штаммов гибридных клеток животного Mus. Musculus - продуцентов МКА к пандемическому вирусу гриппа человека A(H1N1)sw1, циркулирующему на территории Российской Федерации, неизвестны.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в получении гибридомы, продуцирующей МКА к пандемическому вирусу гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1. Эти МКА можно использовать для изучения антигенной структуры гемагглютинина, для дифференциальной диагностики пандемического вируса гриппа А, а также для специфической профилактики и лечения с помощью гуманизированных антител, полученных на их основе.

К существенным признакам изобретения, совпадающими с признаками аналога, относятся следующие.

1. Штамм гибридных клеток 1Е7, продуцирующий моноклональные антитела к гемагглютинину вируса гриппа A(H1N1)sw1, получен методом гибридомной технологии при иммунизации мышей BALB/c.

2. Детекция гомологичного вируса с помощью МКА 1Е7 также проводилась в реакции иммунофлюоресценции.

К существенным признакам изобретения, отличающимся от признаков аналога, можно отнести следующие.

1. Иммунизацию животных проводили инактивированным препаратом пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1, выделенным на территории РФ, содержащим Gly (GAC-GGC) в 451 позиции молекулы нейраминидазы [5].

2. Отбор специфических гибридных клеток осуществляли также с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и в реакции торможения гемагглютинации (РТГА), тогда как в аналоге отбор производили только методом непрямой иммунофлюоресценции.

3. МКА 1Е7 направлены к конформационно-зависимым или прерывистым детерминантам белка НА, в аналоге МКА опознают линейные эпитопы белка НА.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма гибридных клеток 1Е7, продуцирующих МКА к пандемическому вирусу гриппа А/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)sw1, который можно использовать для диагностики, профилактики и лечения.

Указанный технический результат достигается путем гибридизации культивируемых клеток миеломы мыши Sp2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных очищенным и инактивированным препаратом пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1, который был получен в результате культивирования и очистки вируса. Заявляемый штамм гибридных клеток Mus. Musculus 1E7 получен в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России) и депонирован в Коллекции перевиваемых клеточных линий ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития под номером 8/2/4. Авторское название гибридомной клеточной линии - 1E7.

Штамм Mus. Musculus 1E7 характеризуется следующими признаками.

Родословная штамма. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus. Musculus L. (1E7) был получен в результате слияния мышиной миеломы Sp2/0 с клетками селезенки мышей линии BALB/c, иммунизированных очищенным и инактивированным препаратом пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1. В качестве сливающего агента использовали реагент ПЭГ-ДМСО (Hibri-Max, Sigma США). Гибридные клетки культивировали на селективной среде ГАТ, затем дважды клонировали методом предельных разведений, используя в качестве клеток-кормилок перитонеальные макрофаги мышей BALB/c.

Число пассажей к моменту депонирования составило 8-12.

Контаминация бактериями и грибами не обнаружена.

Морфологические признаки. Культура клеток состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с крупными ядрами.

Культуральные свойства. В качестве ростовой среды для культивирования использовали среду RPMI-1640, содержащую 20% эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС), 4,5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ЕД/мл инсулина, 50 мкг/мл гентамицина. Характер роста - стационарная суспензия, метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - 2-3 суток. Посевная доза - 200 тыс. клеток в 1 мл. Кратность рассева - 1:2-1:3.

Культивирование гибридомы в организме животного. Самкам мышей BALB/c (виварий ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России) предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл пристана (Sigma, США). Через 10-14 день животным прививают 10⁶/мл гибридных клеток в брюшную полость мышей. Через 7-10 суток формируется асцитная опухоль. От одного животного можно получить 3-5 мл асцитной жидкости, содержащей МКА. Гибридома прививается в 100% случаев.

Криоконсервирование гибридомы. За 24 часа до замораживания гибридомы пересевают 1:2. Осажденные центрифугированием (1000 об/мин, 10 мин) клетки суспендируют в криозащитной среде (90% ЭТС, 10% ДМСО) и разливают по ампулам в концентрации 3-5 млн/мл по 1-1,8 мл. Хранят 24 часа при -70С°, затем переносят в жидкий азот.

Характеристика иммуноглобулинов. Определение класса иммуноглобулинов, продуцируемых МКА 1Е7, проводили методом ИФА с помощью набора "Mouse-Hybridoma-Subtyping Kit" (Boehringer Mannheim, Германия). В лунки панели сорбировали очищенный препарат вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 в концентрации 2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и инкубировали с МКА в серийных разведениях. После отмывки добавляли конъюгаты - антимышиные антитела к различным классам (IgG, IgA, IgM) и субклассам (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) иммуноглобулинов, меченные пероксидазой хрена. В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин. Показано, что продуцируемые гибридомой 1Е7 МКА взаимодействовали только с конъюгатами против IgG и IgG2a (оптическая плотность более 1,0 для всех использованных разведений МКА), что позволило отнести их к классу IgG, субклассу IgG2a.

Методика получения заявляемого штамма.

Иммунизация. Самок мышей линии BALB/c, полученных из питомника «Пущино» (Московская обл.), иммунизировали внутрибрюшинно 3-кратно с интервалом 3 недели в дозе 100 мкг антигена/мышь. Для первой иммунизации антиген вводили в смеси с полным адъювантом Фрейнда, для трех следующих - в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. Бустерную дозу (100 мкг антигена в 0,1 мл физиологического раствора) вводили внутривенно за 3 дня до выделения селезенки. Титр иммунной сыворотки с гомологичным антигеном в РТГА составил 1:640, в ИФА - 1,8×10⁵.

Слияние. Для слияния используют клетки селезенки мыши и клетки мышиной миеломы Sp2/0 в соотношении 1:5. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 1 мл раствора ПЭГ-ДМСО, состоящего из 45% ПЭГа с молекулярной массой 1450 и 10% ДМСО, (Hybri-Max, Sigma, США). После 3 мин паузы смесь центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. Осадок дважды отмывают средой без сыворотки и осадок растворяют в ростовой среде. Клетки распределяют в 96-луночны планшеты (Costar, США) по 100 мкл в лунку. Селекцию гибридных клеток проводят в среде ГАТ (Sigma, США), состоящей из питательной среды RPMI-1640, в которую добавлены 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.

Отбор специфических гибридов осуществляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В качестве антигена (АГ) в обеих реакциях использовали гомологичный вирус A/IIV-Moscow/01/09(H1N)sw1.

Пример 1. Определение активности МКА 1Е7 при помощи твердофазного иммуноферментного анализа. 96-луночные панели (NUNC, Дания) сенсибилизировали очищенным препаратом вируса гриппа A/DV-Moscow/01/09 в концентрации 2 мкг/мл, инкубировали с асцитной жидкостью, содержащей МКА, в серийных разведениях на фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем 0,1% твин-80 (PBST). После отмывки добавляли конъюгат - антимышиные антитела, меченные пероксидазой хрена (DAKO, Дания). В качестве субстрата использовали тетраметилбензидин (Sigma, США). Было показано, что титр МКА составил 2×10⁷.

Пример 2. Определение активности МКА 1Е7 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА проводили с использованием человеческих эритроцитов I (0) группы по стандартной методике [13]. Доза вирусов гриппа человека и животных составляла 8 агглютинирующих единиц. Было установлено, что МКА 1Е7 подавляют гемагглютинацию вируса гриппа, штамм A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1, в разведении 1/20480. Полученные данные приведены в Таблице 1.

Таблица 1Активность МКА 1Е7 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА с вирусами гриппа человека
Вирусы гриппа	Активность МКА 1Е7
Пандемические вирусы гриппа А
	A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1	20480
H1N1sw1	A/Califorma/07/2009∗	40960
Сезонные вирусы гриппа А
	A/Brisbane/59/07	<20
	A/Solomon Islands/3/06	<20
H1N1	A/New Caledonia/20/99	<20
	A/Beijing/262/96∗	<20
	A/Johannesburg /82/96∗	<20
H3N2	A/Brisbane/10/07	<20
Вирусы гриппа В
B/Florida/04/06	<20
B/Brisbane/60/08	<20
Примечание: ∗ - антигены CDC (Атланта, США)

Пример 3. Специфичность МКА 1Е7 в отношении белков вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1 определяли методом иммуноблота. Белки разделяли в 10% полиакриламидном геле и переносили методом электроэлюции на нитроцеллюлозу с диаметром пор 0,45 мкм ("Bio-Rad", США). Инкубацию с МКА проводили в течение 1 часа или 18 час на качалке при комнатной температуре. Результат реакции проявляли, обрабатывая полоски нитроцеллюлозы AT к Ig мыши, меченными пероксидазой (Sigma, США). В качестве отрицательного контроля использовали Sp2/0-асцитную жидкость в разведении 1/500, в качестве положительного контроля - сыворотку мышей, используемых для получения гибридом в разведении 1/500. Данные опытов показали, что МКА 1Е7 не давали специфических полос в иммуноблоте. Слабое взаимодействие или отсутствие взаимодействия с вирусными белками в иммуноблоте указывает на то, что МКА 1Е7 направлены к конформационно-зависимым или прерывистым детерминантам белка НА.

Пример 4. Вируснейтрализующую активность МКА 1Е7 изучали микрометодом в реакции биологической нейтрализации (РН) в соответствии с рекомендациями ВОЗ [14]. МКА прогревали при 56°С в течение 30 мин на водяной бане. Серийные разведения МКА инкубировали с гомологичным вирусом (инфекционная множественность 100 ТЦД₅₀) в течение 2 ч при 37°С и вносили в клеточную культуру почки собаки (MDCK). После адсорбции вируса клетки промывали, добавляли поддерживающую культуральную среду и инкубировали 24 часа при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Затем клетки отмывали PBS, фиксировали 80% холодным ацетоном на физиологическом растворе 10 минут. Для выявления вируса добавляли МКА к белку NP вируса гриппа из набора ВОЗ, инкубировали 1 ч при 37°С, отмывали PBST 5 раз, добавляли конъюгат - антитела к Ig мыши, меченные пероксидазой хрена (DAKO, Дания). После отмывки добавляли субстрат ТМБ. Считали оптическую плотность (ОП) при длине волны 450 нм. В качестве контролей использовали неинфицированную клеточную культуру (К-), а также клетки, зараженные вирусом, но без добавления МКА (К+).

Пороговый уровень реакции (ОП cut-off) вычисляли по формуле:

ОП cut-off=[ср.ОП (К+) - ср.ОП (К-)]/2+ср.ОП (К-), где ср.ОП (К+) - средняя ОП в лунках с вирусом без добавления МКА; ср.ОП (К-) - средняя ОП в лунках без вируса и без добавления МКА (фон реакции).

МКА считали активными в реакции микронейтрализации, если они давали в каком-либо разведении ОП, меньшую, чем ОП cut-off.

Для каждого разведения МКА рассчитывали степень нейтрализации инфекционной активности вируса по формуле: [ср.ОП (К+) - ОП х]/ср.ОП (К+)×100 (%), где ср.ОП (К+) - средняя ОП в лунках с вирусом без добавления МКА; ОП х - ОП в лунках с вирусом в присутствии МКА.

За титр МКА в РН принимали наибольшее обратное разведение антител, снижающее ОП на 50%. Это соответствует разведению антител, которое нейтрализует инфекционную активность вируса на 50%. Установлена высокая нейтрализующая активность заявляемых МКА. МКА 1Е7 нейтрализовали инфекционную активность вируса гриппа, штамм A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1, в разведении 1/40960.

Пример 5. Изучение способности МКА 1Е7 выявлять инфицированные клетки в реакции непрямой иммуннофлюоресценции (нИФ). Клетки MDCK заражали вирусом A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1 с инфекционной множественностью 10-100 ТЦД₅₀.

Через 24 часа после заражения клетки фиксировали охлажденным ацетоном в течение 30 мин. На фиксированные препараты наносили МКА 1Е7 и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем промывали проточной водой и наслаивали антимышиную сыворотку, меченную ФИТЦ (DAKO, Дания). Показано, что МКА 1Е7 были способны окрашивать клетки MDCK, инфицированные гомологичным вирусом гриппа A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1. Окраска вирусного АГ была выявлена в цитоплазме инфицированных клеток.

Пример 6. Изучение способности МКА 1Е7 подавлять гемагглютинацию различных вирусов гриппа человека. Для анализа свойств МКА использовали 2 пандемических штамма вируса гриппа A(H1N1)sw1: A/IIV-Moscow/01/09 и A/California/07/2009; 5 сезонных вирусов гриппа A(H1N1): A/Brisbane/59/07, A/Solomon Islands/3/06, A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/262/96, A/Johannesburg/82/96; вирус гриппа A/(H3N2) A/Brisbane/10/07 и 2 вируса гриппа В: B/Florida/04/06, B/Brisbane/60/08. Результаты РТГА представлены в Таблице 1. Показано, что МКА 1Е7 с высокой активностью подавляют гемагглютинацию только пандемических вирусов гриппа A(H1N1)sw1. С другими изученными вирусами реакция была отрицательной.

Т.о., впервые на основе мышиной миеломы получена гибридома Mus. Musculus 1Е7 - продуцент МКА к белку гемагглютинина пандемического вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1. Указанный вирус выделен на территории РФ, в Москве в 2009 году. Штамм гибридных клеток позволяет получить мышиные иммуноглобулины класса IgG2a в количестве 3-5 мг очищенных антител из миллилитра асцитной жидкости. МКА 1Е7 специфично реагируют с вирусом гриппа A/IIV-Moscow/01/09 (H1N1)sw1 в ИФА (титр составлял не менее 2×10⁷). МКА с высокой активностью тормозят гемагглютинацию пандемических вирусов гриппа A(H1N1)sw1, циркулирующих в РФ, и эталонного штамма, полученного из CDC (Атланта, США). Это позволяет использовать их для исследования тонкой антигенной структуры и эпитопной специфичности новых изолятов пандемического вируса гриппа А, а также для дифференциальной диагностики пандемических вирусов гриппа A(H1N1)sw1 от сезонных. Активность МКА 1Е7 в реакции нИФ дает возможность применять их для выявления вируса в носоглоточных смывах, мазках и отпечатках тканей больных. Высокая нейтрализующая активность МКА 1Е7 дает возможность на их основе конструирования гуманизированных антител, используемых для профилактики и лечения пандемического гриппа у людей.

Список цитируемой литературы

1. Update: Outbreak of swine-origin influenza A(H1N1) virus infection - Mexico. March-April 2009 // Morbid. Mortal. Wkly Rep. (MMWR). - 2009. - Vol.58, N16. - p.467-470.

2. Update: Swine A(H1N1) infection in two children - southern California. March-April 2009 // Morbid. Mortal. Wkly Rep. (MMWR). - 2009. - Vol.58, N17. - P.400-402.

3. Frazer C., Donnelly C.A, Cauchemez S. et al. Pandemic potential of strain of influenza A(H1N1): early finding // Science. - 2009. - Vol.324. - P.1557-1561.

4. Львов Д.К., Бурцева Е.И., Прилипов А.Г. и др. Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ №2452 от 24.05.2009) первого штамма A/IIV-Moscow/01/2009 больного в Москве // Вопр. Вирусол. - 2009. - №5. - С.10-14.

5. Заявка на выдачу патента РФ на изобретение №2009129374/10 "Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009(H1N1)sw1 для разработки средств и методов биологической защиты", дата подачи 30.07.2009. Решение о выдаче патента на изобретение от 15 сентября 2010 г.

6. Д.К.Львов, Е.И.Бурцева, М.Ю.Щелканов и др. Распространение нового пандемического вируса гриппа A(H1N1)v в России // Вопр. Вирусол. - 2010. - Т.55, №3. - С.4-9.

7. http://www.ecdc.europe.eu/en/helthttopics/Documents/

8. Koudstaal W., Koldijk M.H., Brakenhoff J.P. et al. Pre- and postexposure use of human monoclonal antibody against H5N1 and H1N1 influenza virus in mice: viable alternative to oseltamivir // J. Infect. Dis. - 2009. - Vol.200 (12). - P.1870-1873.

9. Hanson B.J., Boon A.C.M., Lim A.P.C. et al. Passive immunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific for influenza A H5 hemagglutinin in mice // Respiratory Research. - 2006. - V.7. - N1. - P.126-136.

10. Higgins A.D., Shaw C.J., Johnson J.G. et al. Monoclonal antibody kit for identification of the novel 2009 H1N1 influenza A virus // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol.48(8). - P.2677-2682.

11. Yuan Q, Cheng XD, Yang ВС et al. Differentiate diagnosis of pandemic (H1N1) 2009 infection by detecting hemagglutinin using an enzyme-linked immunoassay // Clin. Microbiol. Infect. - 2010. - Nov 4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2010.03413.x. [Epub ahead of print].

12. Kim YK, Uh Y, Chun JK et al. Evaluation of new hemagglutinin-based rapid antigen test for influenza A pandemic (H1N1) 2009 // J. Clin. Virol. - 2010. - V.49. - P.69-72.

13. Дерябин П.Г., Бутенко A.M., Бурцева Е.И. Реакция гемагглютинации и реакция торможения гемагглютинации // В руководстве "Медицинская вирусология" под ред. Академика РАМН Д.К. Львова. Москва. МИФ - 2008. - С.312-318.

14. Scholtissek С. Molecular evolution of influenza viruses // Virus. Genes. - 1996. - Vol.11. - P.209-215.

Штамм гибридных культивируемых клеток мыши Mus. Musculus - 1Е7, депонированный в Коллекцию перевиваемых клеточных культур при ФГУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского" Минздравсоцразвития России под номером 8/2/4, продуцирующий моноклональное антитело, иммунореактивное с белком гемагглютинина пандемического штамма вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/09(H1N1)sw1, относящийся к субклассу IgG2a.