Бактериальный экстракт против расстройств пищеварительного или мочевого тракта и способ его получения

Бактериальный экстракт против расстройств пищеварительного или мочевого тракта и способ его получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание изобретения

Настоящая заявка заявляет приоритет временной заявки на патент США № 60/904787, зарегистрированной 5 марта 2007 года, которая включается сюда в качестве ссылки во всей ее полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к экстрактам бактериальных штаммов, пригодным для использования при лечении таких показаний, как расстройства пищеварительного или мочевого тракта, к композициям, содержащим эти экстракты, и к способам получения экстрактов с использованием сред, которые не вызывают риска появления прионного заболевания.

Уровень техники и сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим бактериальные экстракты, пригодным для использования при лечении таких показаний, как расстройства мочевого или пищеварительного тракта. Экстракты могут содержать бактериальные лизаты из культур, выбранных из одного или более штаммов Escherichia coli. В некоторых вариантах осуществления экстракты могут содержать один или более видов, выбранных из следующих штаммов E.coli: NCTC: 8603, 8621, 8622, 8623, 9026, 9111, 9119, 9707 и 9708 и I: 081, 082, 083, 084, 085, 086, 087, 088 и 089. Эти штаммы хранятся в соответствии с Будапештским договором. Штаммы, показанные в списке с номером, содержащим I, индексируются Collection Nationale de Culture des Microorganismes, Institute Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris, France. Все другие штаммы индексируются National Collection of Type Cultures in London.

В некоторых вариантах осуществления экстракт приготавливают из всех этих штаммов. В других вариантах осуществления выбирают только некоторые из штаммов. В некоторых вариантах осуществления, например, один или более штаммов выбирают из группы "I" и один или более штаммов выбирают из группы "NCTC".

В некоторых вариантах осуществления один или более конкретных штаммов, перечисленных выше, могут отсутствовать или заменяться другим штаммом E.coli или других видов бактерий.

Экстракты могут быть получены способом щелочного лизирования после того, как клетки выращивают до получения соответствующей оптической плотности в культурной среде. В некоторых вариантах осуществления каждую из бактерий выращивают на среде, которая не вызывает риска появления заболевания, родственного прионному, или риска других заболеваний, которые могут передаваться через потребление продуктов, полученных из среды на животной основе. Например, в некоторых вариантах осуществления для выращивания клеток используется среда на растительной основе, такая как среда на основе сои. В некоторых вариантах осуществления для роста клеток может использоваться синтетическая среда или среда, содержащая биологические экстракты, такие как экстракт дрожжей и лошадиная сыворотка, которые также не дают рисков появления таких заболеваний.

Лизаты могут также фильтроваться для удаления нуклеиновых кислот и клеточных остатков больших размеров. Вследствие фильтрации в некоторых вариантах осуществления количество нуклеиновой кислоты, присутствующей в экстрактах, менее чем 100 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления несолюбилизированные соединения, такие как остатки оболочек клеток, и недостаточно деградированные липополисахариды (LPS) также удаляют фильтрацией. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления полученный экстракт содержит растворимые молекулярные компоненты и не содержит значительных количеств нерастворимого материала или материала в виде частиц.

Сахаридные компоненты, включая липополисахаридные (LPS) компоненты, могут консервироваться в экстрактах. В течение процесса лизирования сахариды могут химически модифицироваться, например, расщепляться на более мелкие структуры или замещаться другими функциональными группами.

Рацемизация аминокислот в течение процесса лизирования также создает D-аминокислоты из существующих в природе L-аминокислот, находящихся в природных белках. D-аминокислоты могут быть полезны при увеличении времени эффективности экстрактов, поскольку они не перевариваются эффективно в кишечнике у млекопитающих. Таким образом, антигенные молекулы в экстрактах, которые химически модифицируются во время лизирования, чтобы они содержали D-аминокислоты, остаются в организме пациента в течение продолжительного времени, делая потенциально возможным более сильное иммуностимулирующее действие.

Хотя бактериальные экстракты используются в предшествующем уровне техники для стимулирования иммунной системы против заболеваний пищеварительного и мочевого тракта, имеется необходимость в лучшей стандартизации и контроле этих экстрактов, чтобы сделать их более безопасными, более эффективными и более долгодействующими. Например, ранее считалось, что сахаридные компоненты, включая потенциально токсичные липополисахаридные (LPS) компоненты, должны удаляться из бактериальных экстрактов по причинам безопасности. (См., например, патент США № 5424287.) Однако настоящее изобретение предусматривает способ, который приводит в результате к химической модификации компонентов LPS, достаточной для того, чтобы сахариды безопасно удерживались. Удерживание этих компонентов может улучшить эффективность, а также обеспечить дополнительные антигены.

Например, авторы обнаружили, что мониторинг pH и времени лизирования делает возможным достаточное разложение потенциально аллергенных или токсичных компонентов клеточных оболочек. Известные ранее условия лизирования при более низких pH или более коротком времени, в противоположность этому, дают экстракты, в которых компоненты клеточных оболочек и LPS недостаточно модифицируются химически. (См., например, патент Великобритании GB 2054374 A). Полученные экстракты являются слишком аллергенными, чтобы безопасно вводиться пациентам. В целом, авторы обнаружили, что продукты, лизируемые при слишком низких pH и/или при слишком коротком времени, имеют более высокую токсичность, более низкую экстракцию белка и более низкую фильтруемость.

В дополнение к этому, согласно настоящему изобретению выращивают бактериальные штаммы в культурных средах, которые не дают рисков появления заболеваний, таких как прионные заболевания.

Способ фильтрации может также влиять в некоторых случаях на свойства полученного экстракта, поскольку размер пор фильтра и, иногда, химические свойства поверхности фильтра изменяют тип материалов, которые удаляются и удерживаются. Например, настоящее изобретение использует способ фильтрации, который удерживает определенные сахариды, но удаляет другие молекулярные компоненты, такие как нуклеиновые кислоты.

Таким образом, настоящее изобретение предусматривает параметры, которые стандартизируют бактериальные экстракты, чтобы помочь поддерживать соответствующую безопасность и эффективность.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: Блок-схема системы проточной фильтрации вдоль потока (TFF) для получения бактериальных экстрактов после лизирования бактерий. Блок-схема показывает две различные конфигурации для фильтров: параллельный режим, где все фильтры работают одновременно, и серпентинный режим, где фильтры конфигурируются в последовательном режиме.

Фиг.2: Активность экстрактов в исследовании мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) при исходной концентрации биомассы для лизирования 12,5 г/л (часть A) и 25 г/л (часть B). (См. пример 5A относительно дополнительных подробностей).

Фиг.3: Активность экстрактов в исследовании PBMC при исходной концентрации биомассы для лизирования 25 г/л (часть A) и 100 г/л (часть B).

Фиг.4: Активность экстрактов в исследовании мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) при времени лизирования 24 часа (часть A) и 72 часа (часть B).

Фиг.5: Влияние концентрации NaOH во время лизирования на активность макрофагов по отношению к закиси азота (NO).

Фиг.6: Средние общие значения для колониеобразующих единиц (CFU) в ткани мочевого пузыря (часть A) и почки (часть B) для различных экспериментальных групп.

Фиг.7: Регистрация гибели в экспериментальных группах в течение периода в 21 день после инфицирования 10⁴ CFU Salmonella typhimurium.

Подробное описание изобретения

Определения

Экстракт: Экстракт, как здесь определено, обозначает материал, полученный после лизирования одного или более бактериальных штаммов. В некоторых случаях экстракт получают только из одного штамма, в то время как в других экстракт представляет собой смесь экстрактов из нескольких различных штаммов.

Щелочное лизирование: Это способ лизирования бактериальных клеток при основных условиях, таких как использование органических или неорганических оснований.

Лизат: Экстракт бактерий, полученный от процедуры лизирования клеток.

Фильтрация: Способ фильтрации, как здесь описано, обозначает прохождение экстракта или смеси экстрактов через один или более фильтров, таких как микрофильтры (то есть микрофильтрацию) или ультрафильтры (то есть ультрафильтрацию). Такая фильтрация может не удалять обязательно 100% компонентов, предназначенных для удаления. В некоторых случаях фильтрацию повторяют за несколько проходов или циклов.

Начальный pH: Этот термин обозначает pH, измеренный при начале процедуры, такой как бактериальное лизирование или фильтрация.

Сахариды: Сахарид, как здесь определено, включает моносахариды, дисахариды, а также сахариды больших размеров, такие как линейные и разветвленные полисахариды. Сахариды также включают замещенные или химически модифицированные сахариды, такие как липополисахариды (LPS) и их химически модифицированные варианты.

D-аминокислоты: Этот термин относится к аминокислотам, которые существуют в правовращательных изомерных формах, в противоположность биосинтетически полученным L-аминокислотам, которые существуют в левовращательных изомерных формах.

Рацемизация: Это термин показывает, по меньшей мере, частичную химическую модификацию L-аминокислот до D-аминокислот.

Среда, которая исключает риск появления заболеваний на прионной основе, обозначает культурную среду, используемую на любой стадии получения экстрактов, которая не содержит материалов, таких как сыворотка или мясные экстракты, взятые от животных, таких как коровы или овцы, или от любого другого животного, которое может передавать заболевания на прионной основе. Примеры таких сред включают среды на растительной основе или синтетические химически определенные среды, а также среды с использованием лошадиной сыворотки или среды, содержащие материалы, взятые от видов животных, которые не передают прионные заболевания. Примеры заболеваний на прионной основе включают, например, заболевание коровьим бешенством, почесуху и заболевание Крейцфельда-Якоба.

Неживотная среда представляет собой среду, которая не содержит компонентов, полученных от животных. Примеры включают среды на растительной основе (т.е. растительные среды), такие как соевая среда, и синтетические среды.

Лечение, как здесь используется, обозначает, например, как лечение текущих инфекций, так и других состояний, а также предотвращение или защиту, например, от развития новых инфекций.

Субъект, как здесь используется, обозначает любой животный субъект, включая субъектов млекопитающих, таких как люди и домашние млекопитающие.

Понятно, что конкретные бактериальные штаммы, идентифицируемые здесь и используемые в настоящем изобретении, могут включать штамм, полученный от исходного депозита, упоминаемого здесь, или от его генетического клона, включая штаммы, которые повторно депонированы в более позднее время с различными кодовыми наименованиями депонентов, но которые считаются генетически таким же штаммом, как и исходная депонированная версия.

Все числа, используемые здесь, являются приблизительными, принимая во внимание ошибки, неизбежные при их измерениях, округление и значимые цифры.

Получение экстрактов

Бактериальные экстракты по настоящему изобретению могут быть получены посредством ферментации с последующим тепловым дезактивированием, концентрирования и сбора биомассы, щелочного лизирования отдельной бактериальной биомассы или щелочного лизирования смесей бактериальной биомассы при определенных условиях. Щелочные лизаты при различных условиях могут смешиваться перед очисткой посредством фильтрации. Полученный фильтрат может дополнительно очищаться, например, с удалением материала в виде частиц, а может также лиофилизироваться и/или перерабатываться.

Для каждого штамма, для получения достаточного количества материала, ферментационные культуры могут начинаться с рабочей маточной серии с последующей инокуляцией в ферментационных контейнерах больших размеров.

Используемые среды могут быть одинаковыми для каждого вида. Однако вспомогательные факторы роста могут вводиться для усиления роста некоторых видов. В некоторых вариантах осуществления среду, которая исключает риск появления заболевания на прионной основе, используют для выращивания, по меньшей мере, некоторых, или для всех штаммов. Примеры включают неживотные среды, такие как среды на растительной основе и синтетические среды. Другие примеры включают среду, которая включает лошадиную сыворотку или другой животный экстракт, который отбирают от видов животных, которые не вызывают опасности появления прионного заболевания, в противоположность штаммам, выращенным в присутствии бычьей сыворотки или мясных экстрактов, которые могут давать такие риски.

В некоторых вариантах осуществления ферментация может начинаться с малых культур, таких как от 0,1 до 1,0 литра, инкубируемых в течение от приблизительно 3 до 6 часов при 30-40°C, например, при 37°C, для получения оптической плотности (OD) на 700 нм от 3,0 до 5,0. После стадии мелкомасштабной культуры дополнительное культивирование в одном или в нескольких ферментерах больших размеров может осуществляться при 30°C-40°C в течение времени от 3 часов до 20 часов, например, в течение 3-10 часов или 8 часов.

После ферментации биомасса от каждого штамма или от множества штаммов может дезактивироваться с помощью тепловой обработки, концентрирования и замораживания. После оттаивания замороженной биомассы бактериальная суспензия может затем разбавляться и подщелачиваться для лизирования бактериальных клеток концентрированным раствором ионов гидроксида, таких как NaOH. В некоторых вариантах осуществления лизируется от приблизительно 10 до приблизительно 120 г/л бактериальной сухой массы от одного штамма или их смеси, например, от приблизительно 15 до приблизительно 80 г/л, или от приблизительно 15 до приблизительно 35 г/л, например, 15, 20, 25, 30 или 35 г/л. В некоторых вариантах осуществления лизируется от приблизительно 40 до приблизительно 80 г/л, например, 40, 50, 60, 70 или 80 г/л. (Концентрацию бактериальной сухой массы определяют по количеству сухой биомассы на литр лизирования). (Концентрацию сухой массы измеряют посредством сушки 5 мл материала в малой фарфоровой чашке при 105°C до тех пор, пока она не достигнет постоянной массы, а затем регистрации массы в граммах на литр). В некоторых вариантах осуществления используется концентрация сильного основания от 0,01 н. до 1,2 н., например, от 0,10 н. до 1,1 н. или от 0,10 н. до 0,65 н., или от 0,10 н. до 0,4 н., или в диапазоне с крайними точками от 0,1, 0,2, 0,3 или 0,4 н., или от 0,6 н. до 1,1 н., или в диапазоне с крайними точками от 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 или 1,1 н., или используется такая концентрация основания, чтобы достигнуть начального pH 12 или выше или pH больше чем 12, pH больше чем 12 и меньше чем 13,5, например, больше чем 12,5, больше чем 12,6, больше чем 12,8 или от pH 12,6 до pH 13,4. pH во время лизирования при экстракции солюбилизированного соединения может понижаться. Таким образом, pH может устанавливаться во время процедуры. Температура лизирования может составлять от 30 до 60°C, например, от 35 до 40°C, например, 37°C. Время лизирования может изменяться от 20 часов до нескольких дней, например, составлять 5, 6, 7, 8, 9 или 10 дней, или от 30 до 120 часов, или от 30 до 50 часов, например, 30, 35, 40, 45 или 50 часов, или от 60 до 120 часов, например, 60, 72, 84, 96, 108 или 120 часов. Затем экстракты могут доводиться обратно до более низких pH, совместно смешиваться по желанию и фильтроваться.

После лизирования солюбилизированная сухая масса может составлять от 20 до 180 мг/мл. (Солюбилизированную сухую массу определяют таким же способом, как бактериальную сухую массу, описанную выше, и она может альтернативно выражаться в единицах мг/г, предполагая, что плотность растворимого лизата составляет 1 г/мл). Оставшуюся концентрацию белка измеряют способом Lowry, она может составлять от 8 до 75 мг/мл, например, от 10 до 70 мг/мл, от 20 до 60 мг/мл, или находиться в диапазоне с крайними точками от 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70 мг/мл. Концентрация сахаридов, измеренная с помощью антронного способа для восстанавливающих сахаров в целом, после лизирования смеси штаммов может составлять от 0,8 до 4 мг/мл, например, от 1 до 3,5 мг/мл, от 1,2 до 3 мг/мл, или находиться в диапазоне с крайними точками от 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4 мг/мл.

Может осуществляться лизирование за один раз только одного штамма или смеси всех желаемых штаммов. Например, смешанный экстракт может быть получен посредством смешивания, например, двух или более бактериальных лизатов. Каждый такой лизат может содержать от 10 г/л сухой массы биомассы до 90 г/л, например, 15-85 г/л, или 20-80 г/л, или 25-75 г/л, или 30-70 г/л, или 35-65 г/л, или 40-60 г/л, или 15-35 г/л, или 40-80 г/л. Каждый такой лизат может содержать, например, от приблизительно 20% до 80% экстракта в целом по объему. Объемные пропорции смешивания двух лизатов могут составлять, например, 25%-75% или 75%-25%, 70%-30%, или 30%-70%, или 60%-40%, или 40%-60%, или 50-50%.

Затем лизаты могут очищаться с помощью центрифугирования и/или фильтрации. Например, лизаты могут центрифугироваться при 9000×g, затем могут использоваться один или несколько заходов фильтрации на 0,2-микронном фильтре для очистки экстракта. В некоторых случаях могут использоваться последовательные заходы фильтрации на фильтрах с большими размерами пор с последующей фильтрацией на 0,2-микронном фильтре. Способы ультрафильтрации также могут использоваться, чтобы помочь экстрагировать растворимые материалы из экстракта, например, рециркулируя пермеат от ультрафильтрации для дополнительной микрофильтрации.

В некоторых вариантах осуществления способ проточной фильтрации вдоль потока (TFF) может использоваться для фильтрования экстрактов и для экстрагирования солюбилизированных молекул из клеточных остатков больших размеров. (См. фиг.1). (См., например, Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, Wayne P. Olson, Editor. Interpharm. Press, Inc., Buffalo Grove, IL, U.S.A., p.126 to 135 - ISBN:0-935184-72-4). В начале такого способа TFF, разбавленный бактериальный лизат может храниться в первом резервуаре. Начинается работа петли микрофильтрации (MF), и продукт прокачивают и полученный ретентат от MF рециклируют, в то время как пермеат от MF переносят во второй резервуар.

После достижения соответствующего уровня концентрации начинается работа петли ультрафильтрации (UF). Пермеат от UF можно рециркулировать обратно в первый резервуар для непрерывной экстракции солюбилизированных соединений из лизата, в то время как ретентат от UF может храниться во втором резервуаре. В течение непрерывной экстракции объемы в резервуарах 1 и 2 могут устанавливаться с помощью регулирования скоростей потока пермеатов от микрофильтрации и ультрафильтрации.

Несколько таких циклов экстракции могут осуществляться с помощью либо TFF, либо других способов фильтрации. В вариантах осуществления, которые используют TFF, в конце последнего цикла, петля ультрафильтрации может отключаться и петля микрофильтрации может работать одна, и пермеат от MF переносится в резервуар 2.

Петля микрофильтрации может соединяться с фильтрами с размерами пор от 1,2 микрон до 0,1 микрон, такими как фильтры с размерами пор от 0,65 до 0,2 микрон или 0,45 микрон. Поперечный поток может находиться в пределах между 1000 л/ч·м² (LHM) и 3000 LHM, например, между 1500 и 2500 LHM, или 2000 LHM при перепаде давления на мембране (TMP) от 0,6 до 2 бар, например, в пределах между 0,8 и 1,5 бар, или 1,0 бар. Петля ультрафильтрации может соединяться с фильтрами с размерами пор от 10 КДа до 1000 КДа, например, от 10 КДа до 100 КДа или от 10 КДа до 30 КДа, или от 30 КДа до 100 КДа. Поперечный поток может находиться в пределах между 30 LHM и 1000 LHM, например, между 20 и 500 LHM с TMP от 0,2 до 1,5 бар, например, в пределах между 0,4 и 1,2 бар, или 0,5 бар.

5-20 объемов диафильтрации можно использовать для экстрагирования солюбилизированных соединений из бактериальных клеточных оболочек. В некоторых вариантах осуществления используют 8-15 объемов. Следовательно, например, в некоторых вариантах осуществления может использоваться 5-15 циклов фильтрации, в некоторых случаях 8-15 циклов, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 циклов.

После фильтрации экстракты могут дополнительно концентрироваться или центрифугироваться, если это желательно. Например, может осуществляться дополнительная микрофильтрация с использованием фильтра с более мелкими порами, такого как 0,2-микронный фильтр. После фильтрации выход солюбилизированных белков, измеренный согласно Lowry, может составлять 50-90% или более чем 60%. После фильтрации экстракт может лиофилизироваться перед приготовлением его для использования.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения выбор условий лизирования может осуществляться так, чтобы получить "сильное" или "умеренное" лизирование. Например, в некоторых вариантах осуществления сильное лизирование может достигаться с помощью лизирования от приблизительно 15 до приблизительно 35 г/л бактериальной сухой массы, например, 15, 20, 25, 30 и 35 г/л, или меньших диапазонов, ограниченных этими концентрациями (например, 15-20, 20-25, 20-30, и т.п.), с помощью 0,6-1,1 н. растворов ионов гидроксида, например, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 или 1,1 н., или меньших диапазонов, ограниченных 60-120 часами, например, 60, 70, 80, 90, 100, 110 и 120 часов, при 30-40°C, например, при 35-40°C, 30-35°C или 37°C. Таким образом, как здесь используется, "сильное" лизирование включает использование концентрации бактериальной сухой массы, концентрации ионов гидроксида, времени и температуры, попадающих в каждый из самых широких диапазонов, приведенных выше. В других вариантах осуществления умеренное лизирование может достигаться с помощью лизирования от приблизительно 40 до приблизительно 80 г/л бактериальной сухой массы (например, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80) с помощью 0,1-0,4 н. растворов ионов гидроксида (то есть 0,1, 0,2, 0,3 или 0,4) в течение 30-50 часов (например, 30, 35, 40, 45 или 50 часов) при 30-40°C, например, 35-40°C, 30-35°C или 37°C. Следовательно, как здесь используется, "умеренное" лизирование включает использование концентрации бактериальной сухой массы, концентрации ионов гидроксида, времени и температуры, попадающих в каждый из самых широких диапазонов, приведенных выше. В некоторых вариантах осуществления могут быть получены смеси двух бактериальных лизатов, таких как сильный и умеренный лизат, как описано выше, такие как 10%-90% смесь, смесь 20/80, 25/75, 35/65, 50/50 по объему. (См., например, примеры 8 и 9 ниже.) В некоторых вариантах осуществления все штаммы, которые должны использоваться в экстрактах, могут подвергаться как сильному, так и умеренному лизированию, с последующим совместным смешиванием полученных лизатов. Или альтернативно, некоторые штаммы могут подвергаться сильному лизированию, в то время как другие подвергаются умеренному лизированию. Фильтрация этих лизатов может осуществляться до или после смешивания, например, с помощью способа TFF через петлю MF с 0,65-0,2-микронным фильтром, например, 0,6-, 0,55-, 0,5-, 0,45-, 0,4-, 0,35-, 0,3- или 0,25-микронным фильтром, и петлю UF с 10- или 30-КДа фильтром, в течение, в целом, от 8 до 15 циклов, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 циклов. После приготовления экстракты по настоящему изобретению могут очищаться для удаления материала в виде частиц.

Химические свойства бактериальных экстрактов

Некоторые варианты осуществления в соответствии с настоящим изобретением могут содержать, например, 5-75 мг/мл белков или 10-65 мг/мл, или 20-45 мг/мл, или 5-40 мг/мл, или 5-20 мг/мл, белков или находиться в диапазоне с крайними точками от 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 или 75 мг/мл; 1,5-2,5 мг/мл свободных аминокислот (A.A.) или 1,5-2 мг/мл, или 2-2,5 мг/мл свободных A.A., или находиться в диапазоне с крайними точками от 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 или 2,5 мг/мл свободных A.A., вычисленных по отношению к глутаминовой кислоте (147,1 г/моль); и 0,3-4,5 мг/мл полисахаридов и моносахаридов или 0,3-4 мг/мл, или 0,4-4 мг/мл, или 0,5-3,5 мг/мл, или 0,6-3 мг/мл или 0,3-1 мг/мл, или находиться в диапазоне с крайними точками от 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 или 4,5 мг/мл полисахаридов и моносахаридов. Например, некоторые варианты осуществления содержат приблизительно 5-9 мг/мл белков, 2 мг/мл свободных аминокислот (A.A.), вычисленных по отношению к глутаминовой кислоте (147,1 г/моль), и/или приблизительно 0,3-0,6 мг/мл полисахаридов и моносахаридов.

В некоторых вариантах осуществления концентрация эквивалентов LPS на основе хромогенного исследования с использованием лизата амебоцитов Limulus (LAL) меньше чем 5000 нг/мл, или меньше чем 2000 нг/мл, или меньше чем 1000 нг/мл, или меньше чем 750 нг/мл, или меньше чем 500 нг/мл, или меньше чем 200 нг/мл, или меньше чем 100 нг/мл.

Лизирование бактерий в соответствии с настоящим изобретением может приводить к частичному гидролизу амфифильных соединений, таких как липополисахариды и липопептиды. Лизирование бактерий в соответствии с настоящим изобретением может также приводить к частичному гидролизу белков, а также к деаминированию, деамидированию и к частичной рацемизации аминокислот из L в D. В одном из аналитических исследований экстракта в соответствии с настоящим изобретением после полного гидролиза экстракта с помощью HCl и дериватизации аминокислот, наблюдают газохроматографические пики, представляющие, каждый, D-аспарагиновую кислоту и D-аспарагин, D-глутаминовую кислоту и D-глутамин, D-серин, D-метионин, D-гистидин, D-аланин, D-аргинин, D-фенилаланин, D-тирозин, D-лейцин, D-лизин, D-валин, D-треонин. Процент D-аминокислот этих видов в этом исследовании находится в пределах от 3% до 80%. Следовательно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения делают возможной рацемизацию одного или нескольких соединений из серина, метионина, аспарагиновой кислоты и аспарагина, треонина, гистидина, аланина, аргинина, тирозина, фенилаланина, лейцина и лизина, таких как все упоминаемые выше аминокислоты, или любой выбранной из более чем одной, но менее чем все упоминаемые выше аминокислоты, такие, как, например, серин, аспарагиновая кислота, аспарагин, аланин, фенилаланин, тирозин и лизин, или выбора из этих аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, 10% одной или более из упомянутых выше аминокислот может рацемизироваться из L в D. В других вариантах осуществления может рацемизироваться, по меньшей мере, 30% одной или более из упомянутых выше аминокислот.

Биологические активности бактериальных экстрактов

Экстракты в соответствии с настоящим изобретением могут быть эффективными для лечения пациентов, страдающих от расстройств мочевого или пищеварительного тракта, таких как инфекции пищеварительного и мочевого тракта, или имеющих риск их развития. Экстракты в соответствии с настоящим изобретением могут быть эффективными при предотвращении возвратной инфекции мочевого тракта. Примеры расстройств, которые могут лечиться с помощью экстрактов по настоящему изобретению, включают E.coli и другие бактериальные инфекции, уретрит, тубулоинтерстициальный нефрит, обструктивный пиелонефрит, инфекции мочевого тракта, вызванные обструктивной и рефлюкс-уропатией, цистит, включая хронический цистит, простатит, включая хронический простатит, простатоцистит, воспалительные заболевания тазовых органов у женщин, болезнь Крона и синдром раздраженной толстой кишки.

Биологическая активность экстрактов может определяться с помощью нескольких анализов. Например, анализ мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) исследует продуцирование цитокинов IL-6 из PBMC и может осуществлять скрининг способности экстракта к стимулированию иммунной системы. Например, в некоторых вариантах осуществления концентрация IL-6 in vitro, измеренная в супернатантах PBMC, стимулируемых экстрактами по настоящему изобретению, находится в пределах от 2000 пг/мл до 70000 пг/мл, от 2000 пг/мл до 50000 пг/мл, от 2000 пг/мл до 30000 пг/мл, от 2000 пг/мл до 20000 пг/мл, от 2000 пг/мл до 10000 пг/мл, или от 5000 пг/мл до 70000 пг/мл, от 5000 пг/мл до 50000 пг/мл, от 5000 пг/мл до 30000 пг/мл, от 5000 пг/мл до 25000 пг/мл, или от 5000 пг/мл до 10000 пг/мл, или от 15000 пг/мл до 25000 пг/мл. Когда LPS используют как контрольный агонист (при 0,01 мкг/мл), полученные значения находятся в пределах, в зависимости от доноров, от 5000 пг/мл до 70000 пг/мл.

Исследования оксида азота (NO) у грызунов измеряют продуцирование NO макрофагами грызунов, что также указывает на иммунное стимулирование. Например, макрофаги продуцируют NO, чтобы убивать вторгающиеся бактерии. В некоторых вариантах осуществления активность закиси азота (NO) in vitro для вариантов осуществления настоящего изобретения, исследуемая при концентрациях, находящихся в пределах от 0,001 мг/мл до 10 мг/мл растворимой сухой массы, обеспечивает максимальную реакцию в пределах от 3 мкМ до 100 мкМ оксида азота или от 3 мкМ до 90 мкМ, от 3 мкМ до 80 мкМ, от 3 мкМ до 70 мкМ, от 3 мкМ до 60 мкМ, от 3 мкМ до 50 мкМ, от 3 мкМ до 40 мкМ, от 3 мкМ до 30 мкМ, от 3 мкМ до 20 мкМ, от 3 мкМ до 10 мкМ, или от 5 мкМ до 80 мкМ, от 5 мкМ до 60 мкМ, от 5 мкМ до 40 мкМ, от 5 мкМ до 20 мкМ, или от 10 мкМ до 80 мкМ, от 10 мкМ до 70 мкМ, от 10 мкМ до 50 мкМ, от 10 до 30 мкМ, или от 10 мкМ до 15 мкМ, или она находится в диапазоне с крайними точками от 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мкМ.

Активности, наблюдаемые на мононуклеарных клетках периферической крови человека и макрофагах грызунов in vitro, могут зависеть от таких переменных, как количество бактериальной сухой массы, которая должна лизироваться, то есть от "исходного материала" для лизирования, от продолжительности щелочного лизирования и начального процента NaOH или начального pH, используемого при лизировании.

Сочетание активности при исследованиях in vitro, таких как исследования с помощью PBMC и NO, с определением концентрации LPS, например, с помощью LAL, также может обеспечить получение информации относительно баланса активности как функции риска появления токсичности для данного бактериального экстракта.

Активности, наблюдаемые in vivo на животных в моделях инфекции, показывают, что некоторые варианты осуществления настоящего изобретения имеют защитные воздействия. См., например, пример 9, показывающий повторное лечение животных иллюстративными экстрактами в соответствии с настоящим изобретением. На модели in vivo инфекции E.coli мочевого тракта (пример 8), животные, получающие профилактические повторные пероральные введения иллюстративных экстрактов в соответствии с настоящим изобретением, показывают более низкое количество бактерий в мочевом тракте (мочевой пузырь и почки).

Например, частота выживания за 13 дней после провоцирования, по меньшей мере, 8 невосприимчивых к LPS мышей уропатогенным штаммом E.coli 1677 составляет, по меньшей мере, 60%, когда этих мышей впервые лечат в течение 10 дней эффективным количеством соединений согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения. Доза уропатогенной E.coli для провоцирования может выбираться таким образом, что нелеченые мыши или мыши, которых лечат водой или пустым контрольным препаратом, содержащим наполнители, но не экстракт, имеют частоту выживания 60% или меньше, например, 50% или меньше. В некоторых случаях частота выживания мышей, которых лечат соединениями согласно вариантам осуществления настоящего изобретения, в такой модели составляет, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95%.

В качестве другого примера, частота выживания за 13 дней после провоцирования, по меньшей мере, 8 мышей, имеющих восприимчивость к LPS дикого типа, Salmonella thyphimurium, составляет, по меньшей мере, 60%, когда этих мышей впервые лечат в течение 10 дней эффективным количеством соединения согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения. Доза Salmonella thyphimurium для провоцирования может выбираться так, что нелеченые мыши или мыши, которых лечат водой или пустым контрольным препаратом, содержащим наполнители, но не экстракт, имеют частоту выживания 60% или меньше, например, 50% или меньше. В некоторых случаях частота выживания для мышей, которых лечат экстрактом, составляет, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95%.

Композиции, содержащие бактериальные экстракты

Экстракт в соответствии с настоящим изобретением может приготавливаться с помощью ряда различных путей для возможного введения. Например, могут быть получены пероральные таблетки, капсулы и пилюли, а также жидкие препараты или аэрозоли. Препараты для вливания или инъекция может также могут быть получены.

Варианты осуществления настоящего изобретения могут приготавливаться, например, как твердые дозированные формы или жидкие дозированные формы. Примеры твердых дозированных форм могут включать, например, таблетки, например, таблетки с покрытием, жевательные таблетки, шипучие таблетки, сублингвальные таблетки, гранулы, порошки или капсулы), содержащие экстракт и, необязательно, одну или более пищевых и/или диетических добавок. Твердые дозированные формы могут также содержать разбавители, наполнители и/или другие эксципиенты. Могут добавляться другие компоненты наполнителей, такие как консерванты, красители, ароматизирующие вещества и подсластители. Является также возможным приготовление порошков или препаратов в форме гранул. Жидкие дозированные формы, такие как растворы, сиропы, суспензии или капли, также могут использоваться для перорального способа введения.

Рабочие примеры

Пример 1. Получение культуры штаммов E.coli

Среду для E.coli I-081 (E81), E.coli I-082 (E82), E.coli I-083 (E83), E.coli I-084 (E84), E.coli I-085 (E85), E.coli I-086 (E86), E.coli I-087 (E87), E.coli I-088 (E88), E.coli I-089 (E89), E.coli NCTC 8603 (E8603), E.coli NCTC 8621 (E8621), E.coli NCTC 8622 (E8622), E.coli NCTC 8623 (E8623), E.coli NCTC 9026 (E9026), E.coli NCTC 9111 (E9111), E.coli NCTC 9119 (E9119), E.coli NCTC 9707 (E9707) и E.coli NCTC 9708 (E9708) получают посредством растворения следующих компонентов в очищенной воде: хлорид натрия, 3,75 г/л; моногидрофосфат натрия, 2,5 г/л; ацетат натрия, 0,625 г/л; растительный пептон (папаиновый гидролизат сои), 50 г/л; инозин, 0,125 г/л; хлорид кальция, 0,025 г/л; хлорид калия, 0,125 г/л; гидрокарбонат натрия, 0,75 г/л; аргинин, 1 г/л; пируват натрия, 0,35 г/л; глюкоза, 3 г/л; и "раствор концентрированных элементов" 0,625 мл/л (который содержит сульфат меди, 3 мг/л; хлорид железа, 830 мг/л; сульфат цинка, 860 мг/л; и серную кислоту, 1,1 мл/л.).

0,1 л среды инокулируют 1,5 мл замороженных бактерий и инкубируют в 300-мл колбе Эрленмейера при 37°C в течение 4 часов при перемешивании. Затем 1,0 л среды в 3000-мл колбе Эрленмейера инокулируют 30 мл из предыдущей 300-мл культуры и инкубируют опять при 37°C в течение 4 часов при перемешивании.

Таблица 1.1 Оптическая плотность для последовательных стадий культивирования
		OD ERLEN при 700 нм
	Стадия	100 мл1	100 мл2	1000 мл	1000 мл
E8603	Продолжительность [часы]	4	4	4	4
	Культура 1	2,84	2,67	2,41	2,29
E89	Продолжительность [часы]	4	4	4	4
	Культура 2	2,46	2,45	2,39	2,42
E9111	Продолжительность [часы]	5	5	4,25	4,25
	Культура 3	3,13	2,92	2,45	2,50

Такие же среды, как выше, приготавливают для ферментера для предварительной ферментации, но с добавлением 0,08 мл/л полипропиленгликоля. Один литр культуры от предыдущей стадии инкубирования переносят в ферментер для предварительной ферментации. Температуру инкубирования поддерживают при 30°C, и ферментер для предварительной ферментации перемешивают. pH не поддерживают. Скорость потока стерильного воздуха доводят до 3,3 л/мин. Через 6 часов два ферментера для предварительной ферментации по 25 литров переносят в ферментер больших размеров.

Таблица 1.2 Оптическая плотность для культур из ферментера для предв