Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1-ингибитора по альтернативному пути

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности с1-ингибитора по альтернативному пути

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

С1 ингибитор системы комплемента в качестве ингибитора сериновых протеиназ участвует в регуляции многих ферментов плазмы крови, таких как C1r, C1s - компонентов классического пути комплемента, калликреина калликреин-кининовой системы, а также факторов свертывающей и противосвертывающей систем - XIa, ХIIа, XIIf и плазмина (фибринолизина) [1]. Была также обнаружена его способность ингибировать сериновые протеиназы лектинового пути комплемента [2]. Однако недавно была открыта новая функция С1 ингибитора - его способность регулировать альтернативный путь комплемента путем взаимодействия с компонентом С3b комплемента и ингибирования связывания фактора В комплемента с С3b [3]. Эта функция химически отлична от уже известной, так как при ее осуществлении С1 ингибитор не блокирует ковалентно активный центр сериновых протеиназ, как это было во всех описанных выше случаях, а связывается нековалентно с компонентом С3b, ингибируя образование или дестабилизируя комплекс последнего с фактором В [3].

Дефицит этого ингибитора в крови больного приводит к периодическим отекам, затрагивающим главным образом конечности, лицо, гортань и слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта.

Наследственный дефицит С1 ингибитора бывает двух типов. Тип I обусловлен низкими концентрациями С1 ингибитора. При типе II продуцируется С1 ингибитор с пониженной или отсутствующей функциональной активностью, но в нормальной или повышенной концентрации [4]. Поскольку тип II обусловлен мутациями гена С1 ингибитора, в настоящее время не известно, одинаково ли сказываются такие мутации на обеих функциональных активностях С1 ингибитора: ингибировании классического пути и регуляции альтернативного пути комплемента. Иммуноферментые методы определения активности С1 ингибитора, регулирующей альтернативный путь комплемента, не известны.

Задачей заявленного изобретения является создание способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по альтернативному пути.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности С1 ингибитора, который предусматривает связывание в лунках микропанели компонента С3b, инкубацию в лунках образцов проб, содержащих определяемый функционально активный С1 ингибитор человека, и определение связавшегося С1 ингибитора с помощью конъюгата антител против С1 ингибитора комплемента человека с ферментом и субстратом для этого фермента. Для фиксации в лунках микропанели С3b проводят сорбцию аптечного препарата КИП (комплексный иммуноглобулиновый препарат, состоящий из иммуноглобулинов G, А и М человека). Было показано (см. табл.1), что в образцах коммерческого препарата КИП содержится компонент С3 комплемента человека в следовых количествах, которые оказались достаточными для специфического связывания С1 ингибитора.

Таблица 1
Содержание компонента С3 в различных сериях коммерческого препарата комплексного иммуноглобулинового препарата
Образец	Белок, мг/мл	С3, мкг/мг белка
1	56,6	3,83
2	63,4	2,52
3	35,1	2,27
4	54,3	0,09
5	26,0	6,10
6	61,6	3,89

Набор содержит плоскодонную микропанель со связанным препаратом КИП, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт для активного С1 ингибитора.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для определения функциональной активности С1 ингибитора комплемента человека по альтернативному пути комплемента с использованием в качестве источника компонента С3b комплемента аптечного препарата КИП.

Пример 1. Определение функциональной активности С1 ингибитора по альтернативному пути. Растворяют фармакопейный препарат КИП в концентрации 40 мкг/мл в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 M NaCl и 50 мМ ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят анализируемые пробы, содержащие С1 ингибитор с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С1 ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность компонента С1 ингибитора рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности С1 ингибитора по альтернативному пути. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом КИП, конъюгат пероксидазы с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью С1 ингибитора человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного С1 ингибитора с коэффициентом корреляции R²=0,999, что позволяет достоверно определять функциональную активность С1 ингибитора в альтернативном пути в концентрациях от 1 нг/мл описанным способом с использованием описанного набора.

Кроме того, было проведено определение функциональной активности С1 ингибитора в сыворотке крови больного с наследственным ангионевротическим отеком II типа, т.е. с функциональным дефицитом этого белка. Методами, разработанными ранее [4, 5], было установлено, что содержание С1 ингибитора в сыворотке крови этого больного составляло 204 мкг/мл, а активность по классическому пути ингибирования соответствовала 93 мкг/мл активного. Определение функциональной активности С1 ингибитора по альтернативному пути в крови этого больного дало значение 95 мкг/мл активного. Из этого следует, что предложенный метод отражает активность С1 ингибитора, а не его количественное содержание как белка, и что активность, проявляемая С1 ингибитором в альтернативном пути комплемента, в данном конкретном случае соответствует его активности в классическом пути.

ЛИТЕРАТУРА

1. Davis А.Е. 3rd. CI inhibitor and hereditary angioneurotic edema. Ann. Rev. Immunol. 1988. V.66. P.595-628.

2. Matsushita M., Thiel S., Jensenius J.C., Terai L, Fujita T. Proteolytic activities of two types of mannosebinding lectin-associated serine protease. J. Immunol. 2000. V.165. P.2637-2642.

3. Jiang H., Wagner E., Zhang H., Frank M.M. Complement 1 inhibitor is a regulator of the alternative complement pathway. J Exp Med. 2001. V.194. P.1609-1616.

4. Андина C.C., Козлов Л.В., Дьяков В.Л. Определение функциональной активности, количества С1 ингибитора и аутоантител к нему как инструмент дифференциальной диагностики отеков. Биомедицинская химия. 2004. Т.50. №1. С.86-91.

5. Козлов Л.В., Андина С.С., Гузова В.А., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н. Способ определения функциональной активности С1-ингибитора комплемента человека. Патент РФ №2195662. Бюл. №36. 27.12.2002.

1. Способ определения функциональной активности С1-ингибитора комплемента человека по альтернативному пути, характеризующийся тем, что в лунках микропанели для иммуноферментного анализа сорбируют аптечный препарат КИП, затем в лунки микропанели вносят раствор анализируемой пробы, содержащий С1-ингибитор комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1-ингибитора и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет содержания активного С1-ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для определения функциональной активности С1-ингибитора по альтернативному пути, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом КИП, конъюгат фермента с антителами к С1-ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт для активного С1-ингибитора.