Способ получения l-цистеина, l-цистина, s-сульфоцистеина или тиазолидинового производного l-цистеина, или их смеси с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae

Способ получения l-цистеина, l-цистина, s-сульфоцистеина или тиазолидинового производного l-цистеина, или их смеси с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Описание изобретения

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-цистеина, L-цистина, их производного или предшественника или их смеси с помощью бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что в указанной бактерии усилена экспрессия генов, участвующих в процессе ассимиляции серы.

Предшествующий уровень техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Остальные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой L-аминокислотой по принципу обратной связи (см., например, WO 95/16042 или патенты США 5,661,012 и 6,040,160).

Синтез L-цистеина из неорганической серы является основным механизмом, благодаря которому восстановленная сера включается в органические соединения микроорганизмов. В этом процессе неорганический сульфат, самый распространенный источник утилизируемой серы аэробной биосферы, поступает внутрь клетки и восстанавливается до сульфида, который, в свою очередь, включается в L-цистеин с использованием механизма, аналогичного фиксации аммония в глутамин или глутамат. Известно множество генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы, в том числе гены, участвующие в активации серы (cysD, cysN, cysC) и деградации (cysQ) аденозин-3'-фосфат-5'-фосфосульфата (PAPS).

Неорганический сульфат восстанавливается до сульфида за счет последовательности ферментативных реакций, осуществляемых АТФ-сульфорилазой (ЕС 2.7.7.4), аденилилсульфаткиназой (APS-киназа) (ЕС 2.7.1.25), фосфоаденилилсульфатредуктазой (PAPS-редуктаза) и сульфитредуктазой (ЕС 1.8.1.2. NADPH-зависимая или ЕС 1.8.7.1. ферредоксин-зависимая). O-Ацетил-L-серин(тиол)лиаза (ЕС 4.2.99.8) встраивает сульфид с образованием аминокислоты цистеин (Krone F.A. et al., Mol.Gen.Genet, 225(2): 314-9 (1991)).

ДНК-последовательность сульфат-активируемого локуса Е. coli K-12 установлена. Данная последовательность включает в себя структурные гены, кодирующие АТФ-сульфорилазу (cysD и cysN) и APS-киназу (cysC), которая катализирует синтез аденилилсульфата. На сегодняшний день известны только эти гены, входящие в сульфат-активируемый оперон. Консенсусные элементы промотора оперона идентифицированы, стартовые кодоны и открытые рамки считывания Cys-белков установлены. Активность АТФ-сульфорилазы стимулируется собственной ГТФазой. Сопоставление первичных последовательностей CysN и Ef-Tu показало, что многие из остатков, необходимых для формирования правильной трехмерной структуры и важных для связывания белков Ef-Tu и RAS с остатками гуанина, консервативны в CysN. Гены nodP и nodQ из Rhizobium meliloti важны для образования клубеньков у бобовых растений. Белки Cys и Nod очень похожи между собой. NodP оказался наименьшей субъединицей АТФ-сульфорилазы. NodQ кодирует гомологи и CysN, и CysC; таким образом, данные ферменты могут быть ковалентно связаны в R. meliloti. Тот факт, что ГТФ-связывающие последовательности NodQ и CysN идентичны, дает основания предполагать, что NodQ кодирует регулятор ГТФ-азы (Leyh T.S. et al., J. Biol. Chem., 267(15): 10405-10 (1992)).

Начальные этапы ассимиляции сульфата в течение биосинтеза цистеина приводят к поглощению сульфата и его активации за счет образования аденозин-5'-фосфосульфата, конверсии в 3'-фосфатаденозин-5'-фофосульфат и восстановлению до сульфита. Мутации в гене cysQ из Escherichia coli, приводящие к потребности бактерии в сульфите или цистеине, были получены in vivo путем инсерции транспозонов Tn5tac1 и Tn5supF, и in vitro инсерцией кассет с генами устойчивости. Ген cysQ расположен в позиции 95.7 min (с 4517 по 4518 т.п.н.) и транскрибируется в противоположном по сравнению с близлежащим геном cpdB направлении. Инсерция в 3'-конец гена cysQ транспозона Tn5tac1 с промотором, индуцируемым изопропил-бета-О-тиогалактопиранозидом и ориентированным в противоположном промотору cysQ направлении, приводила к ауксотрофности только когда был добавлен изопропил-бета-О-тиогалактопиранозид, этот условный фенотип обеспечивался противодействием между сходящимися РНК-полимеразами или взаимодействием между комплементарными антисмысловой и смысловой cysQ мРНК. Ауксотрофность, обусловленная полной потерей функции cysQ, была ауксотрофностью типа "leaky" в некоторых, но не во всех штаммах Е. coli, и могла быть компенсирована мутациями в несопряженных генах. Мутанты cysQ были прототрофными при анаэробном выращивании. Мутации в гене cysQ не влияли на скорость поглощения сульфата или активность АТФ-сульфорилазы и ее белковых активаторов, которые вместе катализируют синтез аденозин-5'-фосфосульфата. Некоторые мутации, компенсировавшие ноль-аллели cysQ, приводили к нарушениям транспорта сульфата. Ген cysQ идентичен гену amtA, который, как считалось, необходим для транспорта аммония. Компьютерный анализ выявил существенную гомологию аминокислотных последовательностей между продуктами генов cysQ и suhB из Е. coli и геном инозитолмонофосфатазы млекопитающих. Предыдущие исследования дали основания предполагать, что 3'-фосфоаденозид-5'-фосфосульфат становится токсичным при накоплении и что CysQ помогает контролировать пул 3'-фосфоаденозид-5'-фосфосульфата или использовать его в синтезе сульфита (Neuwald A.F. et al, J. Bacteriol, 174(2): 415-25 (1992)).

Был опубликован способ получения L-треонина путем ферментации микроорганизмов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, в котором экспрессия как минимум одного или более генов пути биосинтеза цистеина, выбранного(ых) из группы, включающей в себя гены cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysI, cysH, cysE и sbp, усилена (WO 03006666A2).

Известен способ получения L-цистеина с использованием бактерии, относящейся к роду Escherichia, в которой продуктивность L-аминокислоты вышеупомянутой бактерией увеличена за счет усиления экспрессии генов кластера cysPTWAM (US 2005124049 A1).

Но в настоящее время нет данных о последовательностях генов, участвующих в процессе ассимиляции серы бактериями семейства Enterobacteriaceae, и генов, усиление экспрессии которых необходимо для продукции L-цистеина бактерией семейства Enterobacteriaceae.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов-продуцентов и предоставление способа получения L-цистеина, L-цистина, их производных или предшественников или их смеси с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута за счет обнаружения того факта, что усиление экспрессии генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы, приводит к увеличению продукции L-цистеина.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к семейству Enterobacteriaceae, обладающую повышенной способностью к продукции L-цистеина.

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии семейства Enterobacteriaceae - продуцента L-цистеина, при этом указанная бактерия модифицирована таким образом, что в ней усилена экспрессия одного или более генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой гены, вовлеченные в процесс ассимиляции серы, включают в себя гены, участвующие в активации сульфата и деградации аденозин-3'-фосфат-5'-фосфосульфата(РАРS).

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой гены, участвующие в активации сульфата, включают один или несколько генов кластера cysDNC.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой гены, участвующие в деградации аденозин-3'-фосфат-5'-фосфосульфата (PAPS), включают ген cysQ.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая модифицирована таким образом, что в ней усилена экспрессия гена cysQ, одного или нескольких генов кластера cysDNC или обоих.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой экспрессия вышеупомянутого(ых) гена(ов) усилена за счет модификации последовательности, контролирующей экспрессию, таким образом, что экспрессия указанного(ых) гена(ов) усилена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой природный(ые) промотор(ы) указанного(ых) гена(ов) замещен(ы) более сильным(ыми) промотором(ами).

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая принадлежит к роду Pantoea.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая является бактерией Pantoea ananatis.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, которая является бактерией Escherichia coli.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения соединения, выбранного из группы, состоящей из L-цистеина, L-цистина, их производных или предшественников, который включает выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, содержащей сульфат, и выделение указанного соединения из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная бактерия имеет усиленную экспрессию генов, вовлеченных в биосинтез L-цистеина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная бактерия имеет усиленную экспрессию генов, вовлеченных в биосинтез L-метионина.

Настоящее изобретение более детально описано ниже

Подробное описание наилучшего способа осуществления изобретения

1. Бактерия

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae - продуцент L-цистеина, модифицированная таким образом, что экспрессия генов, участвующих в процессе ассимиляции серы, указанной бактерией усилена.

«Бактерия - продуцент L-цистеина» означает бактерию, способную производить и накапливать L-цистеин в среде, когда такая бактерия культивируется, в питательной среде.

Термин «бактерия - продуцент L-цистеина» также означает бактерию, способную производить и накапливать в культуральной среде L-цистеин в количествах, больших, чем штамм дикого типа, немодифицированный или родительский штаммы, например Pantoea ananatis, такие как Pantoea ananatis (Enter obacter agglomerans) штаммы AJ13355 (FERM BP-6614), AJ13356 (FERM BP-6615), AJ13601 (FERM BP-7207), SС17(патент США 7,090,998), или Escherichia coli, такие как Е. coli K-12. Штамм SC17 отобран в качестве штамма с низкой продукцией слизи из штамма AJ13355, изолированного из почвы Ивата-ши, Шицуока-кен, Япония (Iwata-shi, Shizuoka-ken, Japan) как штамм, который может расти в среде с низким рН, содержащей L-глутаминовую кислоту и источник углерода (Патент США No.6,596,517). Штамм SC17 был депонирован в Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Тсукуба Централ 6, 1-1, Хигаси 1-Чоме, Тсукуба-щи, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 4 февраля 2009 и получил инвентарный номер FERM ВР-11091. Термин «бактерия - продуцент L-цистеина» также означает, что микроорганизм способен производить и накапливать в среде L-цистеин в концентрациях не меньше чем 0,5 г/л и более предпочтительно не меньше чем 1,0 г/л.

L-цистеин, произведенный указанной бактерией, может превращаться в среде в L-цистин за счет формирования дисульфидных связей. Главным образом, как описано далее, считается, что если L-цистеин образуется в большом количестве за счет увеличения активности DsbA, то запускается формирование L-цистина из L-цистеина с участием окислительной системы DsbA-DsbB-UQ. Кроме того, S-сульфоцистеин может быть получен в реакции L-цистеина и тиосерной кислотой в среде (Szczepkowski T.W., Nature, vol.182 (1958)). Кроме того, L-цистеин, произведенный в бактериальных клетках, может быть сконденсирован с кетоном, альдегидом или, например, пировиноградной кислотой, которая присутствует в клетках, с целью продукции тиазолидинового производного через полутиокетальный интермедиат (см. патент Японии No.2992010). Такое тиазолидиновое производное и полутиокеталь могут присутствовать в виде равновесной смеси. Вследствие этого способность продуцировать L-цистеин не ограничивается способностью накапливать только L-цистеин в среде или клетках, но также включает способность накапливать L-цистин или их производные, или предшественники, или их смесь в среде.

Примеры упомянутого выше производного L-цистеина или L-цистина включают, например, S-сульфоцистеин, тиазолидиновые производные, полутиокеталь, L-метионин, S-аденозилметионин и др. L-цистеин является предшественником L-метионина. L-цистеин участвует в биосинтезе L-метионина в реакции конверсии О-сукцинил-L-гомосерина в L-цистатионин. Таким образом, повышенный уровень L-цистеина может приводить к накоплению L-метионина. В свою очередь, L-метионин является исходным соединением для синтеза S-аденозилметионина и др. Кроме того, если бактерия обладает кроме способности к продукции L-цистеина способностью к продукции L-метионина или аденозилметионина, продукция таких соединений, как L-метионин или аденозилметионин, может быть увеличена за счет усиления экспрессии генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы.

Примеры бактерий-продуцентов L-метионина и родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий-продуцентов L-метионина, включают, но не ограничиваются ими, штаммы бактерии Escherichia, такие как AJ11539 (NRRL В-12399), AJ11540 (NRRL В-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ11542 (NRRL B-12402) (патент Англии GB 2075055); штаммы 218 (VKPM В-8125) (патент Российской Федерации RU 2209248) и 73 (VKPM B-8126) (патент Российской Федерации RU 2215782), устойчивые к аналогу L-метионина норлейцину, или подобные им.

Примеры предшественников L-цистеина или L-цистина включают, например, O-ацетилсерин, который является предшественником L-цистеина. Предшественники L-цистеина или L-цистина также включают, например, N-ацетилсерин, который является предшественником O-ацетилсерина, и др.

O-ацетилсерин (OAS) является предшественником биосинтеза L-цистеина. OAS представляет собой метаболит бактерий и растений и синтезируется за счет ацетилирования L-серина в ферментативной реакции, катализируемой серинацетилтрансферазой (SAT). Далее OAS превращается в L-цистеин в клетках.

Бактерия-продуцент L-цистеина может в своей основе иметь способность к продукции L-цистеина или такая способность может быть ей придана за счет модификации микроорганизма такого, как описано далее, с использованием мутагенеза или технологии рекомбинантных ДНК. Если не оговорено специальным образом, термин L-цистеин относится восстановленному L-цистеину, L-цистину, их производному или предшественнику, как описано выше, или их смеси.

Понятие бактерии не ограничено каким-либо образом при условии, что бактерия согласно настоящему изобретению принадлежит к семейству Enterobacteriaceae и обладает способностью к продукции L-цистеина. Семейство Enterobacteriaceae включает бактерии, относящиеся к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и так далее. В особенности предпочтительны бактерии, отнесенные к семейству Enterobacteriaceae согласно классификации базы данных NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347).

Фраза «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea, соответственно системе классификации, известной специалисту в области микробиологии. Некоторые виды Enterobacter agglomerans недавно были переклассифицированы в Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или другие аналогичные, на основании нуклеотидного анализа последовательности 16S РНК, и других (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)).

Фраза «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии, однако перечень бактерий не ограничен каким-либо образом. Среди примеров бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но не ограничивающихся ими, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coli).

Примеры бактерий-продуцентов L-цистеина и родительских штаммов, которые могут быть использованы для получения бактерий-продуцентов L-цистеина, включают, но не ограничиваются ими, штаммы бактерии Escherichia, такие как Е. coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующего серинацетилтрансферазы устойчивые к обратной регуляции (патент США No.6,218,168, патентная заявка России 2003121601), Е. coli W3110, который суперэкспрессирует гены, кодирующие белки, регулирующие секрецию токсичных для клетки веществ (патент США No.5,972,663), штаммы Е. coli со сниженной сульфогидразной активностью (патентная заявка Японии 11155571 А2), Е. coli W3110 с увеличенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (WO 01/27307 А1), и др.

Термин "процесс ассимиляции серы" означает процесс, в котором сера из окружающей среды, например сульфат, превращается в органическую серу для использования в клеточном метаболизме. Двумя основными конечными продуктами этого процесса являются важнейшие аминокислоты - L-цистеин и L-метионин. Ключевым в данном процессе является увеличение уровня доступной органической серы для биосинтеза L-цистеина и L-метионина.

Примеры "одного или нескольких генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы и деградации аденозин-3'-фосфат 5'-фософосульфата (PAPS)" включают гены cysG, cysD, cysN, cysC, cysQ и их комбинации. Гены cysG, cysD, cysN, cysC, cysQ участвуют в ассимиляции серы, а ген cysQ участвует в PAPS-деградации. Примеры "одного или нескольких генов, вовлеченных в процесс ассимиляции серы и PAPS-деградации" включают гены cysD, cysN и cysC или cysQ по-отдельности, комбинацию генов cysD и cysN, комбинацию генов cysD, cysN и cysC, комбинацию генов cysD, cysN и cysQ и комбинацию генов cysD, cysN, cysC и cysQ.

Известна система сульфатной активации у Е. coli. Данная система включает в себя структурные гены, кодирующие ферменты АТФ-сульфорилазу (cysD и cysN) и APS-киназу (cysC). Начальные этапы ассимиляции сульфата в течение биосинтеза цистеина приводят к поглощению сульфата и его активации за счет образования аденозин-5'-фосфосульфата, конверсии в 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат и восстановлению до сульфита. Ген cysQ участвует в этом процессе. Ген cysG из Е. coli кодирует белок CysG, являющийся субъединицей уропорфирин-IIIC-метилтрансферазы/прекоррин-2-дегидрогенезы/сирогидрохлоринферрохелатазы. Ген cysD из Е. coli кодирует белок CysD-компонент сульфатаденилилтрансферазы. Ген cysN из Е. coli кодирует белок CysN-компонент сульфатаденилилтрансферазы. Ген cysC из Е. coli кодирует белок CysC-субъединицу аденилилсульфаткиназы. Ген cysQ из Е. coli кодирует белок CysQ, который предположительно помогает контролировать пул 3'-фосфоаденозин-5'-фофосульфата или его использование в синтезе сульфита. В бактерии Escherihica coli гены cysD, cysN и cysC формируют оперон cysDNC.

Известны и клонированы гены Р. ananatis, гомологичные генам системы утилизации серы Е. coli. Нуклеотидная последовательность гена cysG из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:1. Нуклеотидная последовательность гена cysD из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:2. Нуклеотидная последовательность гена cysN из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:3. Нуклеотидная последовательность гена cysC из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:4. Нуклеотидная последовательность гена cysQ из Р. ananatis представлена в SEQ ID NO:5.

В бактерии Pantoea ananatis гены cysG, cysD, cysN и cysC формируют оперон cysGDNC. Усиление экспрессии cysG не является необходимым. Тем не менее, экспрессия cysG может быть усилена.

В связи с тем, что последовательности ДНК могут различаться среди видов и штаммов рода Pantoea, гены cysG, cysD, cysN, cysC и cysQ не ограничиваются последовательностями, представленными в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, соответственно, и могут включать гены, гомологичные SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, соответственно.

В связи с этим гены cysG, cysD, cysN, cysC и cysQ могут быть вариантами, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, комплементраными нуклеотидным последовательностям, представленным в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5, или пробой, которая может быть приготовлена из какой-либо из этих нуклеотидных последовательностей. «Жесткие условия» представляют собой условия, при которых образуются специфические гибриды, например гибриды, имеющие гомологию не менее 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% в различных случаях, и а неспецифические гибриды, имеющие степень гомологии меньшую, чем указано выше, не образуются. Примером жестких условий могут быть однократная или многократная отмывка или, например, двукратная или трехкратная отмывка в растворе с концентрацией соли 1×SSC 0.1% SDS или 0.1×SSC 0.1% SDS при 60°C. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для гибридизации мембраны и, как правило, рекомендуется производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для N⁺ нейлоновой мембраны Hybond™ (Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут. Отмывка может быть выполнена 2-3 раза. Длина пробы может варьировать в зависимости от условий гибридизации, но обычно составляет от 100 п.н. до 1 т.п.н.

Фраза "бактерия была модифицирована таким образом, что экспрессия гена усилена" означает, что уровень экспрессии гена в модифицированной бактерии выше, чем в немодифицированном штамме, например штамме дикого типа. Примерами такой модификации могут служить увеличение числа копий экспрессируемого гена(ов) в пересчете на клетку или повышение уровня экспрессии гена(ов) и другие. Количество копий экспрессируемого гена можно измерить, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК и последующей гибридизацией по Саузерну, с использованием зонда, сконструированного на основе нуклеотидной последовательности гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и подобных методов. Уровень экспрессии генов может быть измерен с помощью различных методов, включая гибридизацию по Нозерну, количественную обратную транскрипцию - ПЦР (RT-PCR) и подобные им. В качестве контроля могут служить штаммы дикого типа, например, Pantoea ananatis PERM BP-6614.

Термин «экспрессия» означает образование белкового продукта, кодируемого геном.

Фраза «последовательность, контролирующая экспрессию» относится к нуклеотидным последовательностям, локализованным перед, внутри или после кодирующего участка, контролирующим транскрипцию и/или экспрессию кодирующего участка во взаимодействии с аппаратом белкового биосинтеза клетки. Данная фраза обычно используется для обозначения промоторов, рибосом-связывающих сайтов (RBS), операторов и/или других элементов генома, участвующих в регуляции уровня экспрессии гена.

Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто помещением фрагмента ДНК согласно настоящему изобретению под контроль более сильного, чем природный, промотора. Термин "природный промотор" означает существующую в природном организме область ДНК, расположенную перед открытой рамкой считывания (ORF - opened reading frame) гена или кластера генов и способствующую экспрессии этого гена или кластера генов. Сила промотора определяется частотой акта инициации синтеза РНК. Например, промоторы P_lac, P_trp, P_trc и промоторы P_R или P_L фага лямбда известны как сильные промоторы. Примеры способов оценки силы промотора и сильных промоторов описаны в работе Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) и др. Усиление экспрессии гена может быть достигнуто помещением сильного терминатора после фрагмента ДНК согласно настоящему изобретению.

Кроме того, вдобавок к вышеупомянутым методам экспрессия гена может быть усилена за счет увеличения числа копий гена, например, с помощью техники рекомбинантных генов (молекул). Например, рекомбинантная ДНК может быть получена с помощью лигирования фрагмента гена, содержащего целевой ген с вектором для функционирования в бактерии-хозяине, таким как многокопийный вектор, и далее введена в бактерию с целью трансформации. Примеры упомянутого вектора включают векторы, которые автономно реплицируются в клетках бактерии-хозяина.

Для того чтобы ввести такую рекомбинантную ДНК в бактерию, могут быть использованы любые известные к настоящему времени методы трансформации. Например, подходящими методами являются обработка реципиентных клеток хлоридом кальция, а также увеличение проницаемости клеток для ДНК, описанные для Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), и приготовление компетентных клеток из клеток в фазе роста с последующим введением в них ДНК, описанные для Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). К тому же подходящим способом является приготовление из ДНК-реципиентных клеток протоплатов или сферопластов, которые могут с легкостью поглощать рекомбинантную ДНК, с последующим введением рекомбинантной ДНК в указанные клетки, этот метод применим для Bacillus subtilis, актиномицетов и дрожжей (Chang, S. and Choen, S.N., Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwood, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). Кроме того, микроорганизмы могут быть трансформированы методом электропорации (выложенная патентная заявка Японии No.2-207791).

Увеличение числа копий гена может быть также достигнуто путем введения множественных копий указанного гена в геномную ДНК бактерии. Для введения множественных копий гена в геномную ДНК бактерии выполняется гомологичная рекомбинация с использованием последовательности, множественные копии которой присутствуют в геномной ДНК в качестве мишеней. В качестве последовательностей, множественные копии которых представлены в геномной ДНК, могут быть использованы повторяющаяся ДНК, инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Другой целевой ген может быть введен на расстоянии от целевого гена, присутствующего в геноме тандемно, или может быть введен вместо ненужного гена в геноме в нескольких копиях. Перенос такого гена может быть достигнут при помощи температурзависимого или интегративного вектора.

В качестве альтернативы, как описано в выложенной патентной заявке Японии No.2-109985, также возможно включить ген в состав транспозона, перемещение которого приведет к введению множественных копий в геномную ДНК. Перемещение указанного гена в геном может быть подтверждено с помощью гибридизации по Саузерну с использованием части гена в качестве пробы.

Гены, участвующие в биосинтезе L-цистеина, включают в себя различные аллели гена cysE, кодирующего серинацетилтрансферазы, устойчивые к обратной регуляции (патент США No.6,218,168, патентная заявка России 2003121601); гены, кодирующие белки, регулирующие секрецию токсичных для клетки веществ (патент США No.5,972,663), ген cysB, кодирующий позитивный транскрипционный регулятор цистеинового регулона (WO 01/27307 A1). Другой пример продукции L-цистеина - снижение активности цистеиндесульфогидразы (патентная заявка Японии 11155571 А2).

Гены, участвующие в биосинтезе L-метионина, могут включать гены метионинового регулона. Метиониновый регулон может содержать мутантные гены, кодирующие белки со сниженной активностью репрессии биосинтеза аминокислот. Примером таких генов может служить измененный тип гена metJ, кодирующий белок репрессии биосинтеза L-метионина из Е. coli, активность которого при репрессии биосинтеза метионина снижена (патентная заявка Японии JP 2000157267 A2).

Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и другие подобные методы являются обычными методами, хорошо известными для специалиста в указанной области техники. Перечисленные методы описаны в Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

2. Способ согласно настоящему изобретению

Способом согласно настоящему изобретению является способ продукции соединений, выбранных из группы, состоящей из L-цистеина, L-цистина, их производных или предшественников или их смеси, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления указанного соединения в питательной среде и выделения указанного соединения из культуральной жидкости. Примеры производного или предшественника L-цистеина включают S-сульфоцистеин, тиазолидиновое производное, полутиокеталь, соответствующий упомянутому выше тиазолидиновому производному, O-ацетилсерин, N-ацетилсерин и др.

Выращивание бактерии, выделение из культуральной жидкости и очистка указанного соединения могут быть осуществлены традиционными способами ферментации, используемыми для аминокислот, продуцируемых бактерией.

Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что она содержит источники углерода, азота, минеральные соединения и, если необходимо, питательные добавки в количестве, необходимом для роста бактерии. Источники углерода включают в себя различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от способа ассимиляции используемых бактерий, могут быть использованы спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источников азота используются аммиак, различные соли аммония, такие как сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и микробный ферментолизат. В качестве источников серы согласно настоящему изобретению используются сульфат аммония, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца и подобные им. В качестве минеральных соединений используются однозамещенный фосфат калия, хлорид натрия, хлорид кальция, соли магния, соли железа, соли марганца и подобные им. В качестве витаминов используются тиамин, дрожжевой экстракт и подобные им.

Выращивание проводят предпочтительно в аэробных условиях, таких как взбалтывание и аэрация с перемешиванием, при температуре от 20 до 40°С, предпочтительно от 30 до 38°С. Значение рН обычно находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно в пределах от 6.5 до 7.2. рН среды может быть скорректировано аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевого соединения в культуральной жидкости.

После выращивания нерастворимые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из питательной среды методом центрифугирования или фильтрации на мембране, после чего целевое соединение может быть выделено и очищено методами ионного обмена, концентрации или кристаллизации.

L-цистеин, полученный как описано выше, может быть использован для продукции производных L-цистеина. Производные цистеина включают метилцистеин, этилцистеин, карбоцистеин, сульфоцистеин, ацетилцистеин и др.

Кроме того, когда тиазолидиновое производное L-цистеина продуцируется в среде, L-цистеин может продуцироваться за счет отбора указанного тиазолидинового производного из среды с целью нарушения равновесной реакции между указанным тиазолидиновым производными и L-цистеином, что приводит к избыточной продукции L-цистеина. Кроме того, когда S-сульфоцистеин продуцируется в среде, он может превращаться в L-цистеин за счет восстановления с восстанавливающим агентом, таким как дитиотриетол.

Краткое описание рисунков

На Фигуре 1 изображены последовательности природного промотора P_nlpD (SEQ ID NO:65) и модифицированного промотора P_nlp8 (SEQ ID NO:66).

На Фигуре 2 изображено конструирование плазмиды рМ12.

На Фигуре 3 изображено конструирование плазмиды pM12-ter(thr).

На Фигуре 4 изображено конструирование интегративной кассеты intJS.

На Фигуре 5 изображено конструирование плазмиды pMIV-5JS.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Конструирование штаммов с усиленной экспрессией генов кластера cysGDNC.

1. Конструирование штамма Р. ananatis EYPSG8

ДНК-фрагмент, несущий промотор гена nlpD бактерии Е. coli, был получен с помощью ПЦР. Хромосомная ДНК штамма Е. coli MG1655 была использована в качестве матрицы, а праймерами служили олигонуклеотиды P1 (SEQ ID No:6) и Р2 (SEQ ID No:7). Штамм MG1655 (АТСС 47076) доступен из Американской Коллекции Типовых Культур (American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 55°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 0,2 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенный фрагмент обрабатывался эндонуклеазами PaeI и SalI. Полученный ДНК-фрагмент лигировался с плазмидой pMIV-5JS (конструирование плазмиды pMIV-5JS описано в Справочном примере 1), предварительно обработанной эндонуклеазами PaeI и SalI. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма Е. coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Полученные плазмиды содержали промотор гена nlpD E.coli и были названы pMIV-Pnlp0.

ДНК-фрагмент, содержащий терминатор гена rrnB бактерии E.coli, был получен с помощью ПЦР. Хромосомная ДНК штамма E.coli MG1655 была использована в качестве матрицы, в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды Р3 (SEQ ID No:8) и Р4 (SEQ ID No:9). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 59°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 0,3 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенный фрагмент обрабатывался эндонуклеазами BamHI и XbaI. Полученный ДНК-фрагмент лигировался с плазмидой pMIV-Pnlp0, предварительно обработанной эндонуклеазами BamHI и XbaI. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма E.coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий ампициллин (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Полученная плазмида содержала терминатор гена rrnB E. coli и была названа pMIV-Pnlp0-ter.

ДНК-фрагмент, содержащий ген yeaS бактерии E. coli, был получен с помощью ПЦР. Хромосомная ДНК штамма E. coli MG1655 была использована в качестве матрицы, а праймерами служили олигонуклеотиды Р5 (SEQ ID No:10) и Р6 (SEQ ID No:11). Условия ПЦР были следующими: денатурация 3 минуты при 95°С; условия для первых двух циклов: 1 минута при 95°С, 30 секунд при 50°С, 40 секунд при 72°С; условия для последующих 25 циклов: 20 секунд при 94°С, 20 секунд при 55°С, 15 секунд при 72°С; финальная стадия: 5 минут при 72°С. Амплифицированный ДНК-фрагмент имел длину около 0,7 т.п.н., его очистка осуществлялась с помощью агарозного гель-электрофореза. Затем очищенный фрагмент обрабатывался эндонуклеазами SalI и XbaI. Полученный ДНК-фрагмент лигировался с плазмидой pMIV-Pnlp0-ter, предварительно обработанной эндонуклеазами SalI и XbaI. Смесь для лигирования инкубировали в течение ночи при 4°С и затем использовали для трансформации штамма E. coli MG1655 методом электропорации. Полученные трансформанты высевались на LB-агар, содержащий ампициллин (50 мг/л), чашки инкубировались в течение ночи при 37°С до образования различимых индивидуальных колоний. Плазмиды выделялись из полученных трансформантов и анализировались с помощью рестрикционного анализа. Полученные плазмиды содержали ген yeaS E. coli и были названы pMIV-Pnlp0-yeaS3.

Затем была выполнена рандомизация района -10 промотора P_nlpD и селекция промотора P