Способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты)

Способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к получению соединений инсулина, включая их аналоги или производные из соответствующих предшествующих форм с помощью одностадийной ферментативной реакции, включающей комбинаторное и параллельное использование оптимальных количеств трипсина и карбоксипептидазы В, которые действуют, синергично направляя реакцию управляемым способом, для того чтобы избежать продукции случайных нежелательных побочных продуктов. В частности, ферментативные конверсионные реакции настоящего изобретения предлагают улучшения, заключающиеся в сокращении количества операционных стадий, более высоком выходе и чистоте желательных конечных продуктов.

Уровень техники

Способы генной инженерии делают все более доступной экспрессию предшественников инсулина в микроорганизмах (ЕР-А-347781, ЕР-А-367163). Препропоследовательности обычно расщепляются химически и/или ферментативно (DE-P-3440988, ЕР-А-0264250). Известные ферментативные конверсионные способы основаны на расщеплении трипсином и карбоксипептидазой В (Kemmler W. et. al. J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791; ЕР-А-195 691; ЕР-В-89007). В стандартном способе конверсии молекулы предшественника инсулина в соответствующую молекулу инсулина удаляют линкерный пептид между цепями А и В. Ферментативные реакции с трипсином представляют собой ферментативную и комплексную реакцию, которая расщепляет не только те пептидные связи, расщепление которых дает человеческий инсулин или желательные конечные продукты но также и, в конкурирующей реакции, дает расщепление на других восприимчивых участках, которое приводит к образованию множества нежелательных побочных продуктов.

Предшествующие способы из уровня техники включают использование трипсина и второго фермента - карбоксипептидазы таким образом, что второй фермент карбоксипептидаза добавляется, когда необходимый интермедиат сформируют в реакции. Недостаток указанных способов - формирование большого количества побочных продуктов примесей, которые только с трудом могут быть удалены из реакционного раствора. В частном случае конверсия человеческого предшественника в человеческий инсулин (человеческий инсулин, ЧИ) представляет собой формирование большого количества де-Thr(B30)-человеческого инсулина (де-Thr(B30)-ЧИ).

Из вышеупомянутого очевидно, что было бы выгодно следовать более простому способу ферментативной реакции для расщепления соединений-предшественников инсулина, их аналогов и производных до инсулина посредством намного более простой реакции, которая удаляет возможные формирования полимерных примесей настолько полно, насколько это возможно и, в то же самое время, увеличивает концентрацию желательного конечного продукта инсулина в максимально возможной степени. Дополнительное условие - необходимость гарантировать высокий выход повсюду, увеличивая простоту действий, качества так же как и количества желательного конечного продукта.

Недостатки известных способов были исправлены с помощью ферментативных реакций, выполненных согласно настоящему изобретению, и оказалось, что увеличение выработки без нежелательных побочных продуктов связано с оптимальной концентрацией трипсина и карбоксипептидазы, используемых в способствующих реакции условиях. Авторы настоящего изобретения попытались разработать улучшенный способ одностадийной ферментативной реакции, включающий комбинаторное и параллельное использование оптимальных количеств трипсина и карбоксипептидазы B, которые работают синергично, для того чтобы обеспечить желательные конечные продукты, увеличением легкости выполнения действий, чистоты и выхода конечных продуктов.

Раскрытие изобретения

Главная цель настоящего изобретения состоит в разработке способа получения соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников с минимальным формированием нежелательных побочных продуктов, который осуществляется одностадийной ферментативной реакцией, включающей комбинаторное и параллельное использование оптимальных количеств трипсина и карбоксипептидазы B, работающих синергично для того, чтобы получить желательные конечные продукты.

Другая основная цель настоящего изобретения состоит в получении предшественника аналога инсулина соответствующего последовательностям SEQ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, который может использоваться в качестве исходного материала указанных предшественников, который может быть как в жидкой, так и в кристаллической форме.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в обеспечении вектора экспрессии для экспрессии проинсулина или его аналогов или производных, который включает указанную соответствующую последовательность ДНК, которая кодирует молекулы предшественника.

Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить подходящий микроорганизм/хозяин, который трансформируется указанным вектором экспрессии и впоследствии обеспечивает способ для получения соответствующих соединений инсулина, который включает культивирование указанных трансформированных микроорганизмов в подходящей ферментационной среде и ферментацонных условиях для производства предшественников инсулина.

Еще одна другая цель настоящего изобретения включает способ преобразования соединений-предшественников инсулина в их соответствующие активные формы посредством одностадийной ферментативной реакции, в которой трипсин и карбоксипептидаза добавляются вместе в оптимальных количествах, которые обеспечивают синергичную и контролируемую реакцию, минимизирующую продукцию нежелательных конечных продуктов.

Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ получения инсулина или его аналогов или производных из соответствующих эквивалентов-предшественников, включающий последовательное выполнение действий в определенном порядке. Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы получить молекулу инсулина.

Еще одна другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы получить молекулу инсулина, выбранную из группы, включающей инсулин, лизпро, аспарт, глюлизин или IN-105.

Соответственно, настоящее изобретение имеет отношение к способу получения соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, который включает обработку указанного предшественника трипсином и карбоксипептидазой, используемых комбинаторно и одновременно при условии, что соотношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе представляет собой от приблизительно 5:1 до приблизительно 50:1; способ получения инсулина или его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, включающий последовательное выполнение следующих действий в следующем последовательном порядке: (a) растворение оптимального количества предшественника инсулина или производного инсулина в буферном растворе; (b) получение различных аликвот раствора предшественника в диапазонах pH приблизительно от 7,0 до 9,0; (c) добавление ферментов трипсина и карбоксипептидазы одновременно к различным аликвотам, полученным, как на стадии (b), и инкубирование смеси в течение приблизительно 4-10 часов; (d) преципитация желательного продукта инсулина добавлением буфера лимонной кислоты и ZnCl2; получение молекулы инсулина и молекула инсулина, выбранная из группы, включающей инсулин, лизпро, аспарт, глулизин или IN-105.

Краткое описание сопутствующих списков последовательности

SEQ ID 1: Последовательность аминокислот молекулы предшественника аспарта.

SEQ ID 2: Последовательность аминокислот молекулы предшественника аспарта.

SEQ ID 3: Последовательность аминокислот молекулы предшественника аспарта.

SEQ ID 4: Последовательность аминокислот молекулы предшественника лизпро.

SEQ ID 5: Последовательность аминокислот молекулы предшественника лизпро.

SEQ ID 6: Последовательность аминокислот молекулы предшественника лизпро.

SEQ ID 7: Последовательность аминокислот молекулы предшественника глулизина.

SEQ ID 8: Последовательность аминокислот молекулы предшественника глулизина.

SEQ ID 9: Последовательность аминокислот молекулы предшественника глулизина.

Настоящее изобретение имеет отношение к способу получения соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, соответствующих формуле:

где

R представляет собой водород, или способный к химическому или ферментативному отщеплению аминокислотный остаток, или способный к химическому или ферментативному расщеплению пептид, включающий по крайней мере два аминокислотных остатка,

R₁ представляет собой OH или аминокислотный остаток, или Y₁-Y₂, в котором Y представляет собой аминокислотный остаток,

остатки с A1 до A21 соответствуют A цепи инсулина и остатки с B1 до B27 соответствуют B цепи инсулина, включая их аминокислотные замены, делеции и/или инсерции,

R₂ представляет собой Z₁-Z₂, где Z₁ выбран из Pro, Lys, Asp и Z₂ выбран из Lys, или Pro, или Glu, или Z₁-Z₂-Z₃, где Z₁ отобран из Pro, Lys, Asp и Z₂ отобран из Pro, или Lys, или Glu, и Z₃ представляет собой треонин или пептидный остаток, состоящий из по крайней мере трех аминокислотных остатков при условии, что аминокислота, соответствующая B30, является треонином,

X представляет полипептид, который соединяет цепь A с цепью B, который может быть расщеплен ферментативно, без разрыва цепи A или цепи B, содержащий по крайней мере два аминокислотных остатка, в котором первой и последней аминокислотой является Лизин или Аргинин,

который включает обработку указанного предшественника трипсином и карбоксипептидазой, используемых комбинаторно и одновременно при условии, что соотношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе составляет от приблизительно 5:1 к приблизительно 50:1.

В другом воплощении настоящего изобретения соответствующая молекула предшественника включает последовательность аминокислот, которая является по крайней мере на 85% гомологичной последовательности аминокислот, как показано в последовательностях SEQ ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9.

В другом воплощении настоящего изобретения относительное количество трипсина к предшественнику инсулина составляет от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:500.

В еще одном воплощении настоящего изобретения относительное количество трипсина к предшественнику инсулина составляет около 1:100.

В еще одном воплощении настоящего изобретения относительное количество карбоксипептидазы к предшественнику инсулина составляет около 1:500.

В еще одном воплощении настоящего изобретения соотношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе составляет от приблизительно 5:1 до приблизительно 50:1.

В другом воплощении настоящего изобретения отношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе составляет 5:1.

В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация трипсина, используемого для конверсионной реакции, составляет по крайней мере 0,01 мг/мл.

В другом воплощении настоящего изобретения концентрация карбоксипептидазы, используемой для конверсионной реакции, составляет по крайней мере 0,001 мг/мл.

В еще одном воплощении настоящего изобретения предшественник находится в жидкой или кристаллической форме.

В другом воплощении настоящего изобретения конверсионная реакция проводится при pH от 6,5 до 10.

В еще одном воплощении настоящего изобретения конверсионная реакция проводится при pH от 7 до 9.

В другом воплощении настоящего изобретения конверсионная реакция проводится при температуре в пределах от приблизительно 2°C до 40°C.

В еще одном воплощении настоящего изобретения продолжительность ферментативной конверсионной реакции составляет приблизительно от 2 до 24 часов.

В еще одном воплощении настоящего изобретения реакционная среда содержит по крайней мере 30%-ный водный или водорастворимый растворитель.

В другом воплощении настоящего изобретения водорастворимый растворитель выбран из группы, включающей метанол, этанол, ацетон или N,N-диметилформамид.

В еще одном воплощении настоящего изобретения реакционная среда дополнительно включает соль, действующую в качестве буферного средства.

В еще одном воплощении настоящего изобретения соль выбрана из группы, включающей ТРИС, этилендиамин, триэтаноламин, глицин, HEPES (N-2-гидрокси-этилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота).

В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация соли, используемой в реакционной среде, составляет приблизительно от 10 ммоль до 1 моль.

В еще одном воплощении настоящего изобретения концентрация соли, используемой в реакционной среде, составляет около 0,6 моль.

Настоящее изобретение относится к способу получения инсулина или его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, включающему последовательное выполнение следующих действий в следующем последовательном порядке:

(a) растворение оптимального количества предшественника инсулина или производного инсулина в буферном растворе.

(b) получение различных аликвот раствора предшественника в диапазонах pH приблизительно от 7,0 до 9,0.

(c) Добавление ферментов трипсина и карбоксипептидазы одновременно к различным аликвотам, полученным как на стадии (b), и инкубирование смеси в течение приблизительно 4-10 часов.

(d) Преципитация желательного продукта инсулина добавлением буфера лимонной кислоты и ZnCl2.

Настоящее изобретение относится к молекуле инсулина, полученной согласно любому из предыдущих пунктов.

Настоящее изобретение относится к молекуле инсулина, полученной согласно любому из предыдущих пунктов, выбранной из группы, включающей инсулин, лизпро, аспарт, глулизин или IN-105.

Далее будут описаны более подробно предпочтительные воплощения изобретения, которые, вместе со следующими примерами, служат для того, чтобы объяснить принципы изобретения.

В описании и формуле настоящего изобретения следующая терминология будет использоваться в соответствии с определениями, изложенными далее.

Если иначе не определено в описании, у научно-технических терминов, использованных в соответствии с настоящим изобретением, должны быть значения, которые обычно понимаются под таковыми для специалиста в уровне техники. Дополнительно, если иначе не требуется контекстом, термины в единственном числе должны включать множественное, и множественное число должно включать единственное. Способы и методики настоящего изобретения в целом выполнены согласно обычным способам, известным в уровне техники. В целом, номенклатура, используемая в описании, и способы, описанные здесь, являются известными и обычно используемыми в уровне техники. Способы и методики настоящего изобретения в целом выполнены согласно обычным способам, известным в уровне техники.

Как используется здесь, "аминокислота" относится к пептидной или белковой последовательностям или их частям. Термины "белок", "пептид" и "полипептид" использованы взаимозаменяемо.

Здесь, термин "инсулин" охватывает инсулины от любых видов, таких как свиной инсулин, бычий инсулин и человеческий инсулин и их комплексы, такие как цинковые комплексы, включая их димеры и олигомеры, например гексамеры. Дополнительно, термин "инсулин" здесь охватывает так называемые "аналоги инсулина". Аналог инсулина - молекула инсулина, имеющая одну или более мутаций, замен, делеций и/или инсерций в A и/или B аминокислотных цепях, относительно нативной человеческой молекулы инсулина. Более конкретно, один или больше аминокислотных остатков может быть заменен другим аминокислотным остатком, и/или один или более аминокислотных остатков могут быть удалены, и/или один или два аминокислотных остатков могут быть вставлены, с условием, что указанный аналог инсулина обладает достаточной активностью инсулина. Аналоги инсулина являются предпочтительно такими, в которых один или более естественных аминокислотных остатков, предпочтительно один, два, или три из них, замещены другим кодирующим аминокислотным остатком. Примеры аналогов инсулина описаны в следующих патентах и эквивалентах: US 5,618,913, ЕР 254,516, EP 280,534, US 5,750,497 и US 6,011,007. Примеры конкретных аналогов инсулина представляют собой инсулин аспарт (то есть инсулин человека AspB28) и инсулин лизпро (то есть инсулин человека LysB28, РгоВ29) и "инсулин глулизин" (Lys B (3), Glu B (29) человеческий инсулин).

Один аспект изобретения имеет отношение к соединениям-предшественникам инсулина, представленным следующей формулой:

где

R представляет собой водород, или способный к химическому или ферментативному отщеплению аминокислотный остаток, или способный к химическому или ферментативному расщеплению пептид, включающий по крайней мере два аминокислотных остатка.

R₁ представляет собой ОН, или аминокислотный остаток, или Y₁-Y₂, в котором Y представляет собой аминокислотный остаток.

Остатки с А₁ до А₂₁ соответствуют A цепи инсулина и остатки с В₁ до В₂₇, соответствуют B цепи инсулина, включая их аминокислотные замены, делеции и/или инсерции.

R₂ представляет собой Z₁-Z₂, где Z₁ выбран из Pro, Lys, Asp и Z₂ выбран из Lys, или Pro, или Glu, или Z₁-Z₂-Z₃, где Z₁ отобран из Pro, Lys, Asp и Z₂ отобран из Pro, или Lys, или Glu, и Z₃ представляет собой треонин или пептидный остаток, состоящий из по крайней мере трех аминокислотных остатков при условии, что аминокислота, соответствующая B30, является треонином.

X представляет полипептид, который соединяет цепь A с цепью B, который может быть расщеплен ферментативно, без разрыва цепи A или цепи B, содержащий по крайней мере два аминокислотных остатка, в котором первой и последней аминокислотой является Лизин или Аргинин.

Один из аспектов настоящего изобретения специфично относится к молекуле IN-105. IN-105 представляет собой молекулу инсулина конъюгированную по эпсилон аминокислоте Лизину в положении В29 B-цепи инсулина с амфифильным олигомером структурной формулы CH3O-(C4H2O)3-CH2-СН2-COOH. Данная молекула может быть моноконъюгирована в положениях A1, B1 и B29, ди-конъюгирована в различных комбинациях А1, В1 и В29, или триконъюгирована в различных комбинациях А1, В1 и В29.

В одном аспекте, изолированная молекула предшественника инсулина, которая включает последовательность аминокислот, имеющую по крайней мере приблизительно 80%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 81%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 82%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 83%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 84%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 85%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 86%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 87%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 88%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 89%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 90%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 91%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 92%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 93%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 94%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 95%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 96%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 97%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, альтернативно по крайней мере приблизительно 98%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты и альтернативно по крайней мере приблизительно 99%-ную идентичность последовательности нуклеиновой кислоты молекулы полипептида, представленного SEQ ID 1, 2, 3, 4, 5 и 6.

Трипсин представляет собой типичную сериновую протеазу и гидролизует белок или пептид с карбокситерминального конца по аминокислотному остатку аргинина или лизина (Enzymes, pp.261-262(1979), ed. Dixon, M. & Webb, E.C., Longman Group Ltd., London). В частности, поверхностный гидролиз происходит на двухосновном участке, где находятся два последовательных остатка аргинина или лизина, и известно, что гидролиз происходит более легко там, где двухосновный участок расположен в или рядом с β-складчатой структурой (Rholam, M., et al., FEBS Lett., 207, 1-6 (1986). The Enzyme Vol.II, 3rd Edition, Editor Boyer, Acad. Press NY. pp.249-275). В частности, трипсин расщепляет пептидные связи в С-терминальных остатках аргинина (Arg) или лизина (Lys). Трипсинолиз молекул предшественника инсулина может происходить на различных участках расщепления одновременно. Поскольку в молекуле предшественника инсулина присутствует много сайтов для расщепления, в процессе трипсинолиза может образовываться много нежелательных побочных продуктов.

Рекомбинантный свиной панкреатический трипсин обладает молекулярной массой приблизительно 23000 дальтон и ферментативным оптимумом активности при pH 8,0. Трипсин используется в производственном процессе производства аналогов инсулина и инсулина. Продукция этих биомолекул описана в литературе, и было выбрано несколько подходов. Карбоксипептидаза B избирательно гидролизует основные аминокислоты: лизин, аргинин и орнитин в C-терминальном положении полипептидов. Карбоксипептидаза B является экзопептидазой, катализирующей гидролитическое отщепление C-терминальных основных аминокислотных остатков аргинина и лизина от пептидов и белков.

Термин "C-пептид" или "линкерный пептид" как использующийся здесь включает все формы C-пептида инсулина, включая нативные или синтетические пептиды. Такие C-пептиды инсулина могут быть человеческими пептидами, или могут быть из другого вида животных и родов, предпочтительно млекопитающих. Таким образом варианты и модификации естественного C-пептида инсулина включены в данный термин, пока они сохраняют активность C-пептида инсулина. В уровне техники известны модификации последовательности белков или пептидов, с сохранением их полезной активности, и они могут быть осуществлены с использованием методик, которые являются стандартными в уровне техники и широко описаны в литературе, например, случайный или сайт-специфичный мутагенез, расщепление и лигирование нуклеиновых кислот и т.д. Таким образом, функционально эквивалентные варианты или производные нативных последовательностей C-пептида инсулина могут легко быть получены согласно методикам, известным в уровне техники, и включают последовательности пептидов, имеющих функциональную, например биологическую, активность врожденного C-пептида инсулина. Все такие аналоги, варианты, производные или фрагменты C-пептида инсулина главным образом включены в охват настоящего изобретения, и подпадают под термин "С-пептид инсулина".

Основные требования к C-пептидам - чтобы они имели достаточную длину для образования дисульфидной связи между A и B-цепями, и они должны быть способны к расщеплению из предшественника инсулина, приводящему к формированию инсулина. Типичный дипептид, используемый в качестве C-пептида, представляет собой

-Arg-Arg-. C-пептиды могут иметь любую длину, которые начинаются с Arg или Lys и заканчиваются Arg или lys.

Настоящее изобретение обеспечивает векторы, включающие ДНК, кодирующую любой из описанных здесь генов. Клетка-хозяин, включающая любые такие векторы, также входит в охват настоящего изобретения. В качестве примера, клетки-хозяева могут быть бактериальными, грибковыми или из млекопитающих.

В изобретении используются рекомбинантные клетки-хозяева, в которых продуцируется по крайней мере часть последовательности нуклеиновой кислоты, экспрессирующей предшественник соединения инсулина. Рекомбинантная система экспрессии выбрана из прокариотических и эукариотических организмов. Эукариотические организмы включают дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris), клетки млекопитающих или клетки растений. Бактериальные и эукариотические клетки доступны из многих различных источников, включая коммерческие источники, известные квалифицированным в области техники специалистам, например Американская Коллекция Типовых Культур (ATCC; Rockville, Md.). Коммерческие источники клеток, используемых для рекомбинантной белковой экспрессии, также поставляют инструкции для использования клеток. Выбор системы экспрессии зависит от особенностей, желательных для экспрессируемого полипептида.

Наиболее предпочтительно в отношении к аспектам настоящего изобретения, наиболее предпочтительные клетки-хозяева представляют собой метилотрофные дрожжи. Штаммы метилотрофных дрожжей, которые могут быть модифицированы с использованием настоящего изобретения, включают, но не ограничены, штаммами дрожжей, способных к росту на метаноле, такие как дрожжи родов Pichia, Candida, Hansenula или Torulopsis. Предпочтительные метилотрофные дрожжи представляют собой дрожжи из рода Pichia. Метилотрофные штаммы дрожжей, которые могут быть модифицированы с использованием способов по настоящему изобретению, также включают те метилотрофные штаммы дрожжей, которые были сконструированны для того, чтобы экспрессировать один или более интересующих ксеногенных белков. Самая предпочтительная клетка-хозяин согласно аспекту настоящего изобретения - Pichia pastoris, GS115.

Клетка-хозяин или организм могут быть спроектированы для экспрессии рекомбинантного белка или пептида с использованием стандартных методики. Например, рекомбинантный белок может экспрессироваться из вектора или экзогенного гена, введенного в геном организма.

Векторы, которые могут использоваться для экспрессии экзогенных белков, известны в уровне техники и описаны ниже. Предпочтительные векторы настоящего изобретения, несущие гены молекулы предшественника инсулина, включают, но не ограничены, pPlC9K.

Самый значительный аспект настоящего изобретения относится к способу конвертации соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, представленных формулой

где

R представляет собой водород, или способный к химическому или ферментативному отщеплению аминокислотный остаток, или способный к химическому или ферментативному расщеплению пептид, включающий по крайней мере два аминокислотных остатка,

R₁ представляет собой ОН или аминокислотный остаток, или Y₁-Y₂, в котором Y представляет собой аминокислотный остаток,

остатки с А₁ до А₂₁ соответствуют A цепи инсулина и остатки с В₁ до В₂₇ соответствуют B цепи инсулина, включая их аминокислотные замены, делеции и/или инсерции,

R₂ представляет собой Z₁-Z₂, где Z₁ выбран из Pro, Lys, Asp и Z₂ выбран из Lys, или Pro, или Glu, или Z₁-Z₂-Z₃, где Z₁ отобран из Pro, Lys, Asp и Z₂ отобран из Pro, или Lys, или Glu, и Z₃ представляет собой треонин или пептидный остаток, состоящий из по крайней мере трех аминокислотных остатков при условии, что аминокислота, соответствующая В30, является треонином,

X представляет полипептид, который соединяет цепь A с цепью B, который может быть расщеплен ферментативно, без разрыва цепи A или цепи B, содержащий по крайней мере два аминокислотных остатка, в котором первой и последней аминокислотой является Лизин или Аргинин,

который включает обработку указанного предшественника трипсином и карбоксипептидазой, используемых комбинаторно и одновременно при условии, что отношение концентрации трипсина к карбоксипептидазе составляет от приблизительно 5:1 к приблизительно 50:1.

Молекула предшественника может быть в жидкой или кристаллической форме.

Способ преобразования молекулы предшественника инсулина в их соответствующую молекулу инсулина проводится в водной среде, включающей по крайней мере приблизительно 40% воды; это, однако, не препятствует наличию по крайней мере приблизительно 30%, или приблизительно 50%, или приблизительно 60%, или приблизительно 70%, или приблизительно 80% воды, а также наличию водорастворимых растворителей, таких как метанол, этанол, ацетон, N,N-диметилформамид и т.п.

Реакционная среда может дополнительно включать любую соль с буферными свойствами. Предпочтительно, реакционная среда включает Трис (трис-(гидроксиметил)-аминометан) в качестве соли при концентрации в пределах от 10 ммоль до 1 моль. Наиболее предпочтительно концентрация Трис, используемого в реакционной среде, составляет 0,6 моль.

Конверсия проводится при любой температуре в широких пределах, в основном от приблизительно 0°C до 40°C. Предпочтительно реакция проводится при температуре от приблизительно 10°C до приблизительно 30°C и наиболее предпочтительно от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C.

pH реакционной смеси может быть в любом диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 12. Однако лучшие результаты получаются тщательным контролем pH таким образом, чтобы реакция проводилась в диапазоне pH приблизительно от 6,5 до 10. Предпочтительно реакция осуществляется в диапазоне pH от 7 до 9,5, предпочтительно от приблизительно 8 до 9, и в случае точного контроля при pH 8,5.

Контроль pH осуществляют при помощи буферного средства. Любой из подходящих используемых буферов в широком диапазоне включает ТРИС, этилендиамин, триэтаноламин, глицин, HEPES (-2-гидрокси-этилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота), и т.п.

Количество трипсина и карбоксипептидазы B, которые в основном используются, связано как с количеством каждого используемого фермента, так и с количеством молекул предшественника инсулина. Ферменты могут быть добавлены в реакционные смеси или в раствор или с использованием признанных методик, например иммобилизация на подходящей подложке, и таким образом доступные в реакционной среде.

Основываясь на массовом соотношении, трипсин в основном будет присутствовать в количестве относительно предшественника инсулина в пределах от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:500, предпочтительно от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:200, наиболее предпочтительно от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100 или 1:10 до приблизительно 1:50 или от 1:10 до приблизительно 1:25. Самая предпочтительная концентрация трипсина относительно концентрации используемого инсулина представляет собой 1:100. Концентрация трипсина, используемого для конверсионной реакции, составляет по крайней мере 0,01 мг/мл.

Основываясь на массовом соотношении, карбоксипептидаза В в основном будет присутствовать в количестве относительно предшественника инсулина в пределах от приблизительно 1:500 до 3:500. Самая предпочтительная концентрация карбоксипептидазы относительно концентрации используемого инсулина 1:500. Концентрация карбоксипептидазы, используемой для конверсионной реакции, составляет по крайней мере 0,001 мг/мл.

Согласно другому аспекту существенным параметром настоящего изобретения является отношение трипсина к карбоксипептидазе B в реакционной смеси. В основном, на основе массы, отношение трипсина к карбоксипептидазе В находится в диапазоне от 5:1 до 50:1. Предпочтительно, на основе массы, отношение трипсина к карбоксипептидазе В составляет от 50:3 до приблизительно 5:3. Самое предпочтительное отношение трипсина к карбоксипептидазе B составляет около 5:1.

Продолжительность реакции может составлять приблизительно от 2 до 48 часов, предпочтительно продолжительность реакции составляет приблизительно от 2 до 24 часов.

Соответственно, настоящее изобретение имеет отношение к способу получения соединений инсулина и его аналогов или производных из их соответствующих предшественников, включающему последовательное выполнение следующих действий в следующем последовательном порядке:

(a) растворение оптимального количества предшественника инсулина или производного инсулина в буферном растворе;

(b) получение различных аликвот раствора предшественника в диапазонах pH приблизительно от 7,0 до 9,0;

(c) добавление ферментов трипсина и карбоксипептидазы одновременно к различным аликвотам, полученным, как на стадии (b), и инкубирование смеси в течение приблизительно 4-10 часов;

(d) преципитация желательного продукта инсулина добавлением буфера лимонной кислоты и ZnCl2.

Предпочтительное воплощение изобретения описано ниже на Рисунках и в Описании Предпочтительных Воплощений. В то время как эти описания непосредственно описывают вышеупомянутые воплощения, подразумевается, что квалифицированные в области техники специалисты могут задумать модификации и/или изменения к определенным воплощениям, показанным и описанным здесь. Любые такие модификации или изменения, которые попадают в область этого описания, также входят в объем настоящего изобретения. Если специально не отмечено, подразумевается, что слова и фразы в описании и формуле изобретения даны обычные и значения соответствуют таковым из обычного уровня техники. Описание предпочтительного воплощения и лучший способ изобретения, известные заявителю при регистрации заявки, были представлены и предназначены только в целях иллюстрации и описания. Они не предназначены, чтобы быть исчерпывающими или ограничить изобретение раскрытой точной формой, в свете вышеупомянутого раскрытия возможны много модификаций и изменений. Воплощение было выбрано и описано, чтобы лучше всего объяснить принципы изобретения и его практическое применение и позволить другим, квалифицированным в уровне техники специалистам, чтобы лучше всего использовать изобретение в различных воплощениях и с различными модификациями, которые подходят для специфического рассмотренного применения.

Изобретение дополнительно уточняется с помощью следующих примеров. Однако эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие охват изобретения.

Осуществление изобретения

Пример 1А: Предшественник аспарта (Seq ID 1, 2 и 3)

Предшественник аспарта формулы X-[аспарт B цепь (В1-В30)]-Y-[аспарт, A цепь (А1-А21)], где X представляет собой последовательность лидерного пептида, B цепь является последовательностью В цепи аспарта В1-В30, Y является последовательностью пептида линкера между цепью B и цепью A, A цепь представляет собой A-цепь аспарта. Последовательность может быть лишена лидера или другого лидерного пептида (например, EEAEAEAEPR или GAVR). Пептид линкер Y может быть любым из примера R и RDADDR.

Последовательность предшественника представлена последовательностями SEQ ID 1 и 2. Предшественник может быть продуцирован любой подходящей системой экспрессии, такой как Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, CHO клетки и т.д.

Предшественник аспарта клонировался в рамку с Mat-alfa сигнальным пептидом в вектор экспрессии Pichia, pPlC9K. Pichia pastoris штамм, GS115 был трансформирован рекомбинантной плазмидой для того, чтобы получить клон, экспрессирующий предшественник аспарта.

Предшественник аспарта секретировался Pichia pastoris в питательную среду. Бульон центрифугировался, и клетки отделялись от супернатанта. Существует множество способов, подходящих для захвата предшественника, включая ионообменную хроматографию и гидрофобную хроматографию. Для настоящего изобретения катион-обменная хроматография и ГИФ использовались, чтобы захватить определенный предшественник.

Пример 1В: Предшественник лизпро (Seq ID 4, 5 и 6)

Предшественник лизпро формулы Х-[лизпро В цепь (B1-B30)]-Y-[лизпро А цепь (А1-А21)], где Х последовательность лидерного пептида, В цепь являе