Композиции фрагментов ткани для лечения недержания

Композиции фрагментов ткани для лечения недержания

Реферат

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Это изобретение относится к композициям для лечения недержания. Более конкретно, это изобретение относится к композициям, содержащим фрагменты жизнеспособной мышечной ткани и носитель, для лечения недержания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Повреждения мягкой ткани, например, сосудистой, кожной или костно-мышечной, являются вполне обычными. Многие из этих нарушений встречаются в отсутствие системного заболевания и являются последствием хронической повторяющейся травмы слабой степени и чрезмерного применения.

Одним примером довольно обычного повреждения мягкой ткани является недержание. Недержание является жалобой на любое непроизвольное подтекание мочи или фекалий. Оно может вызывать затруднения и приводить к социальной изоляции, депрессии, потери нормального качества жизни и является главной причиной помещения в специальное лечебное учреждение популяции пожилого возраста. Имеются несколько типов недержаний, включающих императивное (приступообразное) недержание мочи (подтекание мочи при сильном желании мочиться), стрессовое недержание мочи (при напряжении), непроизвольное мочеиспускание при перерастяжении мочевого пузыря (парадоксальную ишурию) и смешанное недержание, или смешанное недержание мочи. Смешанным недержанием или смешанным недержанием мочи называют случай, когда пациент страдает от более, чем одной формы недержания мочи, например, стрессового недержания мочи и императивного (приступообразного) недержания мочи.

Медицинская потребность в эффективных фармакологических способах лечения, особенно для смешанного недержания и стрессового недержания мочи (SUI), является очень высокой.

Эта высокая медицинская потребность является результатом отсутствия эффективной фармакологической терапии в сочетании с высокими количествами пациентов. Недавние оценки показали количество 18 миллионов людей, страдающих от SUI в США, причем преимущественно женщин.

Стрессовое недержание мочи может подтверждаться наблюдением потери мочи, совпадающей с увеличением брюшного давления, в отсутствие сокращения мочевого пузыря или наличия перерастяженного мочевого пузыря. Это состояние стрессового недержания может быть классифицировано либо как уретральная гипермобильность, либо как врожденная недостаточность сфинктера. При уретральной гипермобильности, шейка мочевого пузыря и уретра (мочеиспускательный канал) опускаются во время кашля или напряжения и уретра открывается с видимым подтеканием мочи (давление точки подтекания находится между 60 и 120 см Н₂О). При врожденной недостаточности сфинктера, шейка мочевого пузыря открывается во время наполнения мочевого пузыря без сокращения мочевого пузыря. Видимое подтекание наблюдается при минимальном напряжении (стрессе) или в отсутствие напряжения (стресса). Имеется вариабельное опускание шейки мочевого пузыря и уретры, часто вообще отсутствие опускания, и давление точки подтекания является низким (<60 см H₂O) (J. G. Blaivas, 1985, Urol. Clin. N. Amer., 12:215-224; D. R. Staskin et al., 1985, Urol. Clin. N. Amer., 12:271-278).

Императивное (приступообразное) недержание мочи определяется как непроизвольная потеря мочи, ассоциированная с внезапным и сильным желанием мочиться. Хотя непроизвольные сокращения мочевого пузыря могут быть ассоциированы с неврологическими нарушениями, они могут также встречаться у индивидуумов, которые, по-видимому, являются неврологически нормальными (P. Abrams et al., 1987, Neurol. & Urodynam., 7:403-427).

Обычными неврологическими нарушениями, ассоциированными с императивным (приступообразным) недержанием мочи, являются инсульт, диабет и рассеянный склероз (E. J. McGuire et al., 1981, J. Urol, 126:205-209). Императивное недержание мочи вызывается непроизвольными сокращениями мышцы-сжимателя, которые могут быть также обусловлены воспалением мочевого пузыря и нарушенной сократимостью мышцы-сжимателя, при которой мочевой пузырь не опустошается полностью.

Непроизвольное мочеиспускание при переполнении мочевого пузыря (парадоксальная ишурия) характеризуется потерей мочи, связанной с перерастяжением мочевого пузыря. Недержание мочи вследствие переполнения мочевого пузыря может быть вызвано нарушенной сократимостью мочевого пузыря или непроходимостью мочевого пузыря, приводящей к перерастяжению и обильному выделению мочи. Мочевой пузырь может быть неполностью активным вторично относительно неврологических состояний, таких как диабет и повреждение спинного мозга, или после радикальной хирургии органов тазовой полости.

Другой обычной и серьезной причиной недержания мочи (императивного недержания мочи и недержания мочи вследствие перерастяжения мочевого пузыря) является нарушенная сократимость мочевого пузыря. Это является все более обычным состоянием в гериатрической популяции у людей пожилого и старческого возраста) и у пациентов с неврологическими заболеваниями, в частности с сахарным диабетом (N. M. Resnick et al., 1989, New Engl. J. Med., 320: 1-7; M.B. Chancellor and J.G. Blaivas, 1996, Atlas of Urodynamics, Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.). Мочевой пузырь с недостаточной сократимостью не может опорожнять его содержимое от мочи; это вызывает не только недержание, но также инфицирование мочевых путей и почечную недостаточность. В настоящее время клиницисты являются очень ограниченными в их способности лечения нарушенной сократимости мышцы-сжимателя. Не существует эффективных лекарственных средств для улучшения сократимости мышцы-сжимателя. Хотя урехолин может слегка увеличивать внутрипузырное давление, в контролируемых исследованиях не было показано, что он способствует эффективному опорожнению мочевого пузыря (A. Wein et al., 1980, J. Urol, 123:302). Наиболее обычным лечением является обход этой проблемы посредством периодической или постоянной катетеризации.

Имеются ряд способов лечения стрессового недержания мочи. Наиболее часто практикуемые существующие способы в случае стрессового недержания мочи включают следующее: абсорбирующие продукты; постоянную катетеризацию; пессарий, т.е. вагинальное кольцо, помещаемое для поддержания шейки мочевого пузыря; и лекарственное лечение (Agency for Health Care Policy and Research. Public Health Service: Urinary Incontinence Guideline Panel. Urinary Incontinence in Adults: Clinical Practice Guideline. AHCPR Pub. No. 92-0038. Rockville, Md. U.S. Department of Health and Human Services, March 1992; M.B. Chancellor, Evaluation and Outcome. В: The Health of Women With Physical Disabilities: Setting a Research Agenda for the 90's. Eds. Krotoski D.M., Nosek, M., Turk, M., Brooks Publishing Company, Baltimore, Md., Chapter 24, 309-332, 1996). Физические упражнения являются другим способом лечения для стрессового недержания мочи. Например, обычным и популярным способом лечения стрессового недержания мочи являются упражнения Кегеля. Эти упражения могут помочь половине людей, которые выполняют их четыре раза в день в течение 3-6 месяцев. Хотя 50% пациентов сообщают некоторое улучшение с упражнениями Кегеля, коэффициент излечения в отношении недержания после упражнений Кегеля равен только 5 процентам. Кроме того, большинство пациентов прекращают эти упражнения и выпадают из протокола вследствие необходимости очень продолжительного времени и ежедневной дисциплины.

Другим способом лечения для недержания мочи является уретральный тампон. Он представляет собой одноразовый пробкообразный тампон для женщин со стрессовым недержанием мочи. К сожалению, этот тампон ассоциирован с более 20% инфекции мочевых путей и, к сожалению, не излечивает недержание.

Биологическую обратную связь и функциональную электрическую стимуляцию с применением вагинального зонда также использовали для лечения императивного (приступообразного) недержания и стрессового недержания мочи. Однако эти способы являются длительными и дорогостоящими, а результаты являются лишь умеренно превосходящими упражнения Кегеля. Хирургические операции, такие как лапароскопические операции или открытые абдоминальные подвешивания шейки мочевого пузыря; абдоминальные подвешивания шейки мочевого пузыря с трансвагинальным доступом; искусственный мочевой сфинктер (дорогостоящая сложная хирургическая процедура с 40% коэффициентом возврата к прежнему состоянию), также используют для лечения стрессового недержания мочи).

Другие способы лечения включают процедуры интрауретральных инъекций с экзогенными инъецируемыми материалами, такими как силикон (кремнийсодержащее соединение), покрытые углем частицы, Тефлон, коллаген и аутологичный жир. Каждый из этих инъецируемых веществ имеет свои недостатки. Патенты США №№5007940; 5158573 и 5116387, выданные Berg, сообщают о биосовместимых композициях, содержащих дискретные, полимерные и состоящие из силиконового (кремнийсодержащего) каучука тельца, инъецируемые в уретральную ткань с целью лечения недержания мочи посредством придания объемности ткани. Далее, патент США №5451406, выданный Lawin, сообщает о биосовместимых композициях, содержащих субстраты их покрытых углем частиц, которые могут быть инъецированы в ткань, такую как ткань уретры и ткань, которая покрывает уретру и шейку мочевого пузыря, с целью лечения недержания мочи посредством увеличения объема ткани. Одним недостатком или неблагоприятным результатом, ассоциированным с методологиями или терапиями придания объемности ткани является миграция твердых частиц в агентах-наполнителях из исходного участка помещения в участки депонирования в различных органах тела и последующая хроническая воспалительная реакция ткани на частицы, которые являются слишком малыми. Эти неблагоприятные эффекты сообщаются в литературе по урологии, в частности, в Malizia A.A. et al., "Migration and Granulomatous Reaction After Periurethral Injection of Polytef (Teflon)", JAMA, 251:3277-3281 (1984) и в in Claes H., Stroobants D. et al., "Pulmonary Migration Following Periurethral Polytetrafluoroethylene Injection For Urinary Incontinence", J. Urol., 142:821-822 (1989). Одним важным фактором в гарантии отсутствия миграции является введение частиц правильного размера. Если частицы являются слишком маленькими, они могут поглощаться лейкоцитами тела (фагоцитами) и переноситься к отдаленным органам или переноситься из сосудистой системы и перемещаться, пока они не достигнут участка большего сужения. Органы-мишени для депонирования частиц включают легкие, печень, селезенку, головной мозг, почку и лимфатические узлы. Применение сферических частиц малого диаметра и удлиненных фибрилл в водной среде, имеющей биосовместимый смазывающий агент, было раскрыто Wallace et al., патент США №4803075. Хотя эти материалы показали положительные, кратковременные результаты стимуляции, этот результат был краткосрочным, так как этот материал имеет тенденцию мигрировать и/или абсорбироваться тканью хозяина.

Инъекции коллагена обычно используют бычий коллаген, который абсорбируется в течение 4-6 месяцев, что приводит к необходимости повторяемых инъекций. Дополнительным недостатком коллагена является то, что приблизительно 5% пациентов имеют аллергию в отношении коллагена бычьего источника и вырабатывают антитела.

Трансплантация аутологичного жира в качестве инъецируемого придающего объем агента имеет существенный недостаток, заключающийся в том, что наибольшая часть инъецированного жира резорбируется. Кроме того, степень и продолжительность выживания трансплантата аутологичного жира остается дискуссионной. В месте имплантата обычно имеет место воспалительная реакция. Осложнения от трансплантации жира включают резорбцию жира, узелки и асимметрию ткани.

Недавние подходы с инъекционной терапией мышечных клеток, использующие полученные генной инженерией мышечные клетки, могут предоставлять альтернативную терапию для лечения недержания, в частности стрессового недержания мочи, и усиления континенции (удерживания) мочи. Предпочтительно, инъекция полученных из мышц клеток может быть аутологичной, так что аллергические реакции будут минимальными или отсутствующими. Миобласты, предшественники мышечных волокон, являются одноядерными мышечными клетками, которые отличаются по многим признакам от других типов клеток. Миобласты природно сливаются с образованием постмитотических многоядерных мышечных трубочек и, следовательно, могут быть использованы для долгосрочной экспрессии и доставки биоактивных белков (T.A. Partridge and K.E. Davies, 1995, Brit. Med. Bulletin, 51: 123-137; J. Dhawan et al., 1992, Science, 254: 1509-1512; A.D. Grinnell, 1994, In: Myology. Ed 2, Ed. Engel AG and Armstrong CF, McGraw-Hill, Inc, 303-304; S. Jiao and J.A. Wolff, 1992, Brain Research, 575: 143-147; H. Vandenburgh, 1996, Human Gene Therapy, 7:2195-2200).

Применение миобластов для лечения мышечной дегенерации, для рапарации повреждения ткани или лечения заболевания описано в патентах США №№5130141 и 5538722. Трансплантацию миобластов использовали также для репарации миокардиальной дисфункции (S.W. Robinson et al., 1995, Cell Transplantation, 5:77-91; C.E. Murry et al., 1996, J. Clin. Invest., 98:2512-2523; S. Gojo et al., 1996, Cell Transplantation, 5:581-584; A. Zibaitis et al., 1994, Transplantation Proceedings, 26:3294). Использование миобластов для лечения недержания мочи описано в Патенте США №6866842, а также в Transplantation. 2003 Oct 15;76(7): 1053-60; J Urol. 2001 Jan; 165(l):271 и Yokoyama T.J., Urology, 165:271-276, 2001. Заявка WO 2004055174 описывает состав культуральной среды, способ культивирования и полученные миобласты и их применения. Стимуляция мягкой ткани и кости и придание объмности с использованием полученных из мышц клеток-предшественников, композиции и способы лечения описаны в WO 0178754. Миобластная терапия для заболеваний человека описана в US 9909451.

Хотя клеточная терапия предоставляет преимущества над другими инъекциями, она имеет большие недостатки. Одним из самых больших недостатков, ассоциированных с применением миобластов для лечения стрессового недержания мочи, является то, что миобласты требуют экстенсивного культивирования в течение 3-4 недель для достижения количеств клеток, требуемых для инъекции, что делает эту терапию очень дорогой и недоступной для многих пациентов.

Ввиду вышеупомянутых недостатков и осложнений лечения недержания мочи и сократимости мочевого пузыря, в данной области требуются новые и эффективные альтернативные способы.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Этим изобретением является композиция для лечения недержания, содержащая фрагменты жизнеспособной мышечной ткани и носитель. Эта композиция содержит по меньшей мере один фрагмент мышечной ткани, имеющий по меньшей мере одну жизнеспособную клетку, которая может мигрировать из этого фрагмента ткани и на сайт трансплантации для образования новой ткани. Эти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани могут быть получены из аутологичной, аллогенной или ксеногенной ткани. Носитель включает, но не ограничивается ими, физиологический буферный раствор, инъекционный раствор геля, солевой раствор и воду. Эти композиции применимы в лечении недержания инъецированием этой композиции в мочеполовую ткань, такую как уретра, уретральный сфинктер и мочевой пузырь, в случае недержания мочи, и в колоректальную ткань, такую как ободочная кишка, прямая кишка и колоректальный сфинктер, в случае фекального недержания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Жизнеспособные фрагменты мышечной ткани могут быть получены из аутологичной, аллогенной или ксеногенной ткани. В одном варианте осуществления, эти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани получают из аутологичной ткани. Эту мышечную ткань получают при асептических условиях. Эта жизнеспособная мышечная ткань может быть получена с использованием любого из различных общепринятых способов, включающих биопсию или другие хирургические способы удаления тканей. После получения жизнеспособной мышечной ткани эту ткань затем фрагментируют при стерильных условиях. Кроме того, эта ткань может быть фрагментирована в любой стандартной среде для культуры клеток, известной специалистам с обычной квалификацией в данной области, либо в присутствии, либо в отсутствие сыворотки. Размер фрагмента жизнеспособной мышечной ткани может находиться в диапазоне приблизительно 0,1 - приблизительно 3 мм³, но предпочтительно фрагменты жизнеспособной мышечной ткани имеют размер приблизительно 0,1 - приблизительно 1 мм³.

Композиция данного изобретения включает также носитель. Этот носитель является биосовместимым и имеет достаточные физические свойства для обеспечения легкости инъекции. Этот носитель включает, но не ограничивается ими, физиологический буферный раствор, инъекционный раствор геля, солевой раствор и воду. Физиологический буферный раствор включает, но не ограничивается ими, забуференный солевой раствор, раствор фосфатного буфера, сбалансированный солевой раствор Хенкса, забуференный Трисом солевой раствор и забуференный HEPES солевой раствор. В одном варианте осуществления, этим буфером является сбалансированный солевой раствор Хенкса. Инъекционный раствор геля может быть в форме геля перед инъекцией или может желатинироваться и оставаться в месте введения.

Инъекционный раствор геля состоит из воды, солевого раствора или физиологического буферного раствора и желатинирующего материала. Желатинирующие материалы включают, но не ограничиваются ими, белки, такие как коллаген, эластин, тромбин, фибронектин, желатин, фибрин, тропоэластин, полипептиды, ламинин, протеогликаны, фибриновый клей, фибриновый сгусток, сгусток богатой тромбоцитами плазмы (PRP), сгусток бедной тромбоцитами плазмы (РРР), самособирающиеся пептидные гидрогели и ателоколлаген; полисахариды, такие как пектин, целлюлоза, окисленная целлюлоза, хитин, хитозан, агароза, гиалуроновая кислота; полинуклеотиды, такие как рибонуклеиновые кислоты, дезоксирибонуклеиновые кислоты, и другие, такие как альгинат, сшитый альгинат, поли(N-изопропилакриламид), поли(оксиалкилен), сополимеры поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксида), поли(виниловый спирт), полиакрилат, сополимеры моностеароилглицеринсукцината и полиэтиленгликоля (MGSA/PEG) и их комбинации.

В одном варианте осуществления, эта композиция дополнительно содержит микрочастицы. Квалифицированные в этой области специалисты называют микрочастицы также микрогранулами или микросферами. Эти микрочастицы обеспечивают как временный объемный эффект, так и субстрат, на котором могут прикрепляться и расти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани. Эти микрочастицы должны быть достаточно большими, чтобы препятствовать локальной или отдаленной миграции после инъекции иглой для подкожных инъекций. Таким образом, микрочастицы имеют по существу круглую форму со средним поперечным размером в диапазоне приблизительно 100 - приблизительно 1000 микрон, предпочтительно в диапазоне приблизительно 200 - приблизительно 500 микрон. Эти микрочастицы предпочтительно образованы из биосовместимого полимера. Биосовместимые полимеры могут быть синтетическими полимерами, природными полимерами или их комбинациями. В данном контексте термин "синтетический полимер" относится к полимерам, которые не обнаружены в природе, даже если эти полимеры изготовлены из природно-встречающихся биоматериалов. Термин "природный полимер" относится к полимерам, которые являются природно-встречающимися. Эти биосовместимые полимеры могут быть также биодеградируемыми. Биодеградируемые полимеры легко разрушаются на маленькие сегменты при контактировании с влажной тканью тела. Затем эти сегменты либо абсорбируются телом, либо выводятся телом. Более конкретно, эти биодеградированные сегменты не вызывают перманентной хронической реакции чужеродного тела, так как они абсорбируются телом или выводятся из тела, так что никакой перманентный след или остаток этого сегмента не удерживается телом.

В одном варианте осуществления, микрочастица состоит по меньшей мере из одного синтетического полимера. Подходящие биосовместимые синтетические полимеры включают, но не ограничиваются ими, полимеры алифатических сложных полиэфиров, поли(аминокислоты), сополимеры (простой эфир-сложный эфир), полиалкиленоксалаты, полиамиды, полученные из тирозина поликарбонаты, поли(иминокарбонаты), полиортоэфиры, полиоксаэфиры, полиамидоэфиры, полиоксаэфиры, содержащие аминогруппы, поли(ангидриды), полифосфазены, поли(пропиленфумарат), полиуретан, сложный полиэфируретан, простой полиэфируретан, и их смеси и сополимеры. Подходящие синтетические полимеры для применения в данном изобретении могут также включать биосинтетические полимеры на основе последовательностей, обнаруженных в коллагене, ламинине, гликозаминогликанах, эластине, тромбине, фибронектине, крахмалах, поли(аминокислоте), желатине, альгинате, пектине, фибрине, окисленной целлюлозе, хитине, хитозане, тропоэластине, гиалуроновой кислоте, шелке, рибонуклеиновых кислотах, дезоксирибонуклеиновых кислотах, полипептидах, белках, полисахаридах, полинуклеотидах, и их комбинации.

Для цели этого изобретения алифатические сложные полиэфиры включают, но не ограничиваются ими, гомополимеры и сополимеры мономеров, включающих лактид (который включает молочную кислоту, D-, L- и мезолактид); гликолид (включающий гликолевую кислоту); эпсилон-капролактон; п-диоксанон (1,4-диоксан-2-он); триметиленкарбонат (1,3-диоксан-2-он); алкилпроизводные триметиленкарбоната; и их смеси. Алифатические сложные полиэфиры, используемые в данном изобретении, могут быть гомополимерами или сополимерами (статистическими сополимерами, блоксополимерами, сегментированными, коническими блоксополимерами, привитыми сополимерами, триблок-сополимерами и т.д.), имеющими линейную, разветвленную или звездообразную структуру. В вариантах, в которых скелет включает по меньшей мере один природный полимер, подходящие примеры природных продуктов включают, но не ограничиваются ими, материалы на основе фибрина, материалы на основе коллагена, материалы на основе гиалуроновой кислоты, материалы на основе гликопротеина, материалы на основе целлюлозы, разновидности шелка и их комбинации.

Специалисту в данной области будет понятно, что выбор подходящего материала для образования биосовместимых микрочастиц зависит от нескольких факторов. Эти факторы включают механические свойства in vivo; реакцию клеток на этот материал, включающую присоединение, пролиферацию, миграцию и дифференцировку; и необязательно кинетику биодеградации. Другие релевантные факторы включают химический состав, пространственное распределение компонентов, молекулярную массу полимера и степень кристалличности.

В другом варианте осуществления, в композиции этого изобретения может быть включен биологический эффектор. Эти биологические эффекторы стимулируют заживление и/или регенерацию пораженной ткани (например, факторы роста и цитокины), предотвращают инфекцию (например, противомикробные агенты и антибиотики), уменьшают воспаление (например, противовоспалительные агенты), предотвращают или минимизируют образование адгезии, такие как окисленная регенерированная целлюлоза (например, INTERCEED и Surgicel®, доступные из Ethicon, Inc.) и гиалуроновая кислота, и подавляют иммунную систему (например, иммуносупрессоры).

Биологические эффекторы включают, но не ограничиваются ими, гетерологичные и аутологичные факторы роста, белки матрикса, пептиды, антитела, ферменты, гликопротеины, гормоны, цитокины, гликозаминогликаны, нуклеиновые кислоты, обезболивающие агенты. Понятно, что в этой композиции могут быть включены один или несколько биологических эффекторов одной и той же или различной функциональности.

Известно, что гетерологичные или аутологичные факторы роста стимулируют заживление и/или регенерацию травмированной или поврежденной ткани. Примеры факторов роста включают, но не ограничиваются ими, TGF-β, костный морфогенный белок, фактор-5 дифференцировки роста (GDF-5), полученный из хряща морфогенный белок, фактор роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста, эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор роста, фактор роста гепатоцитов и их фрагменты. Подобным образом, подходящие эффекторы включают агонисты и антагонисты вышеуказанных агентов.

Гликозаминогликаны являются высокозаряженными полисахаридами, которые играют роль в клеточной адгезии. Примеры гликозаминогликанов, применимых в качестве биологических эффекторов, включают, но не ограничиваются ими, гепарансульфат, гепарин, хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератинсульфат, гиалуронан (также известный как гиалуроновая кислота) и их комбинации.

Биологический эффектор может быть также ферментом, таким как расщепляющие матрикс ферменты, которые облегчают миграцию клеток из внеклеточного матрикса, окружающего клетки. Подходящие расщепляющие матрикс ферменты включают, но не ограничиваются ими, коллагеназу, хондроитиназу, трипсин, эластазу, гиалуронидазу, пептилазу, термолизин, матриксную металлопротеазу и протеазу.

Специалисту в данной области будет понятно, что подходящий биологический эффектор (подходящие биологические эффекторы) могут определяться хирургом на основе принципов медицинской науки и целей применяемого лечения. Количество биологического эффектора, включаемого с этой композицией, будет варьироваться в зависимости от различных факторов, в том числе от конкретного применения, такого как стимуляция выживаемости клеток, пролиферация, дифференцировка, или облегчение и/или ускорение заживления ткани. Этот биологический эффектор может быть включен в композиции жизнеспособных фрагментов мышечной ткани и носителя до или после введения этой композиции в зону повреждения ткани.

Композиция для лечения недержания может быть приготовлена сначала получением пробы мышечной ткани из донора (аутологичного, аллогенного или ксеногенного) с использованием подходящих инструментов для забора проб. Затем эту пробу мышечной ткани либо тонко измельчают и делят на малые фрагменты при заборе ткани, либо альтернативно, проба мышечной ткани может быть измельчена после взятия и сбора пробы вне тела. В экспериментах, в которых эту пробу ткани измельчают после ее забора, эти пробы ткани могут быть взвешены и затем промыты три раза в забуференном фосфатом солевом растворе. Затем приблизительно 100-500 мг ткани могут быть измельчены на маленькие фрагменты в присутствии небольшого количества, например, приблизительно 1 мл, физиологического буферящего раствора, такого как забуференный фосфатом солевой раствор, или расщепляющего матрикс фермента, такого как 0,2% коллагеназа, в среде Ham F12. Эту мышечную ткань измельчают с получением фрагментов размером приблизительно 0,1-1 мм³. Измельчение этой ткани может выполняться различными способами. В одном варианте осуществления, измельчение выполняют двумя стерильными скальпелями в параллельном и противоположном направлениях, а в другом варианте осуществления, эту ткань измельчают обрабатывающим инструментом, который автоматически делит эту ткань на частицы желаемого размера. В одном варианте осуществления, эта измельченная ткань может быть отделена от физиологической жидкости и сконцентрирована при помощи любого из различных способов, известных специалистам с обычной квалификацией в данной области, например, просеиванием, осаждением или центрифугированием. В вариантах в которых измельченную ткань фильтруют и концентрируют, суспензия измельченной ткани предпочтительно сохраняет небольшое количество жидкости в этой суспензии для предотвращения высыхания этой ткани. Эту суспензию фрагментов жизнеспособной мышечной ткани объединяют с носителем, описанным выше, и необязательно с микрочастицами и доставляют в участок репарации ткани посредством инъекции. Кроме того, биологический эффектор может быть добавлен к этой композиции с микрочастицами или без микрочастиц перед введением в участок репарации ткани.

Описанные здесь композиции применимы в лечении мягкой ткани. Мягкой тканью называют обычно находящиеся вне скелета структуры, расположенные по всему телу, и мягкая ткань включает, но не ограничивается ими, периодонтальную ткань, кожную ткань, ткань сосудов, мышечную ткань, фасциальную ткань, глазную ткань, перикардиальную ткань, легочную ткань, синовиальную ткань, нервную ткань, почечную ткань, эзофагеальную ткань (ткань пищевода), урогенитальную ткань, кишечную ткань, колоректальную ткань, ткань печени, ткань поджелудочной железы, ткань селезенки, жировую ткань, и их комбинации. Предпочтительно, описанные здесь композиции применимы в лечении урогенитальной ткани, такой как уретра, уретральный сфинктер и мочевой пузырь, эзофагеальной ткани, такой как пищевод и кардиальный (кардиоэзофагеальный) сфинктер, и колоректальной ткани, такой как ободочная кишка, прямая кишка и колоректальный сфинктер. Эти композиции могут быть также использованы для придания объемности ткани, нарастания ткани, косметических обработок, терапевтических способов лечения и герметизации (уплотнения) ткани.

Один неограничивающий пример приготовления композиции для лечения недержания является следующим. Пациента готовят для операции по репарации ткани общепринятым образом с использованием общепринятых хирургических способов. Пробу мышечной ткани, используемую для образования этой композиции, получают из пациента с использованием общепринятых инструментов для изъятия ткани. Эту пробу мышечной ткани тонко измельчают и делят на фрагменты жизнеспособной мышечной ткани, имеющие размер частиц в диапазоне приблизительно 0,1 - приблизительно 3 мм³. Эту ткань измельчают с использованием общепринятого способа измельчения, такого как разрезание двумя стерильными скальпелями в противоположных параллельных направлениях. Измельчают приблизительно 100-500 мг ткани в присутствии приблизительно 1 мл физиологического буферящего раствора, требуемое количество ткани зависит от степени повреждения ткани в участке репарации. Эти фрагменты жизнеспособной мышечной ткани фильтруют и/или концентрируют для отделения фрагментов жизнеспособной мышечной ткани от физиологического буферящего раствора. Фрагменты жизнеспособной мышечной ткани концентрируют центрифугированием. Затем фрагменты жизнеспособной мышечной ткани объединяют со сбалансированным солевым раствором-носителем Хенкса и необязательно с микрочастицами и инъецируют в участок репарации ткани. В приготовлении этих композиций может быть использован набор. Этот набор включает инструмент для взятия проб, стерильный контейнер, в который помещен реагент для поддержания жизнеспособности ткани, обрабатывающий инструмент, носитель и доставляющее устройство. Инструмент для взятия проб используют для получения жизнеспособной мышечной ткани из субъекта. Эта ткань может быть помещена в стерильном контейнере, содержащем реагент для поддержания жизнеспособности ткани. Подходящие реагенты для поддержания жизнеспособности пробы ткани включают, но не ограничиваются ими, солевой раствор, забуференный фосфатом раствор, сбалансированный солевой раствор Хенкса, стандартную среду для культивирования клеток, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, аскорбиновую кислоту, HEPES, заменимую аминокислоту, L-пролин, аутологичную сыворотку и их комбинации. Обрабатывающий инструмент используют для измельчения ткани до фрагментов жизнеспособной мышечной ткани, или, альтернативно, инструмент для взятия проб может быть адаптирован для забора пробы ткани и для обработки этой пробы до тонко измельченных частиц ткани. Этим носителем может быть физиологический буферный раствор, инъекционный раствор геля, солевой раствор или вода, как описано здесь, и он может включать микрочастицы. Устройство доставки позволяет депонировать эту композицию фрагментов жизнеспособной мышечной ткани в носителе в патологические ткани, например, смежные с участками уретрального сфинктера или окружающий уретральный сфинктер.

ПРИМЕР 1

Эффективность новой терапии на основе применения композиции фрагментов жизнеспособной мышечной ткани для восстановления давления точки подтекания (LPP) исследовали на модели стрессового недержания мочи (SUI) у крыс. Фрагменты жизнеспособной мышечной ткани генерировали из скелетных мышц самцов крыс. В целом 24 самки крыс Lewis относили случайным образом к одной из 3 групп (8 животных на группу), а именно, животных с недержанием мочи, животных с недержанием мочи, инъецированных носителем + фрагментами жизнеспособной мышечной ткани. SUI создавали в 2-х последних группах рассечением билатерального полового нерва (PNT). Спустя одну неделю после хирургии композицию вводили каждой группе животных интрауретральной инъекцией. Спустя 5 недель LPP измеряли по меньшей мере 4 раза у каждой крысы и определяли среднее.

Уход за животными

За животными, используемыми в этом исследовании, ухаживали и их поддерживали в соответствии со всеми применимыми разделами норм the Final Rules of the Animal Welfare Act (9 CFR), the Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals, the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Этот протокол и любые исправления или процедуры, включающие уход за животными или применение животных в этом исследовании, были рассмотрены и одобрены the Testing Facility Institutional Animal Care and Use Committee перед началом таких процедур.

Крысы Lewis были выбраны вследствие их сингенного фенотипа. Он позволяет оценивать композицию для лечения SUI, полученную из одной крысы и имплантированную в другую крысу, без использования иммуносупрессии. Этих животных содержали раздельно в микроизоляторах. Контроли окружающей среды устанавливали на поддержание температур 18-26°C (64-79°F) с относительной влажностью 30-70%. Поддерживали цикл 12-часовой свет/12-часовая темнота, за исключением прерывания для аккомодации к процедурам исследования. В помещениях животных поддерживали десять или более замен воздуха в час 100% свежим воздухом (без рециркуляции воздуха). Животным обеспечивали рацион Purina Certified Diet и отфильтрованную водопроводную воду ad libitum.

Материалы и способы

Животные. SUI создавали ранее установленным способом рассечения билатерального полового нерва (PNT). Все процедуры выполняли при асептических условиях. Крыс готовили для асептической хирургии и анестезию индуцировали с использованием изофлурана при 2,5-4%. После индукции анестезию поддерживали изофлураном, доставляемым через носовой конус при 0,5-2,5%. Для PNT-хирургии, шерсть на участке, простирающемся от тазобедренного сустава до основания хвоста, на седалищной области и на обратной стороне задних конечностей сбривали и животное помещали в вентральное лежачее положение. Посредством дорсального продольного разреза билатерально открывали седалищно-прямокишечную ямку. С использованием увеличения лупы выделяли и рассекали половой нерв. Разрез закрывали с использованием жидкого локального тканевого клея Nexaband®. Группу животных без недержания мочи подвергали той же самой хирургической процедуре, за исключением фактического рассечения нерва.

Приготовление и введение композиции. Трех самцов крыс Lewis эвтанизировали избыточной дозой внутривенного натрий-пентобарбитала (100 мг/кг). Извлекали ткань из их обеих четырехглавых мышц. Кусок скелетной мышцы мелко измельчали на фрагменты скальпелем и затем наносили в сетчатый фильтр для клеток с отверстиями 300 микрометров. Фрагменты проталкивали через эту сетку поршнем шприца на 10 мл. Нижнюю сторону этого фильтра выскребали лезвием скальпеля и полученные фрагменты жизнеспособной мышечной ткани ресуспендировали в 3 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) без Ca²⁺ и без Mg²⁺ (cat#: 14175-095 Invitrogen, CA) с получением однородной композиции. Общая концентрация ткани была равна 0,3 г/мл. Эту жизнеспособную измельченную мышечную ткань суспендировали в HBSS, загружали в шприц Гамильтона на 100 микролитров и инъецировали в уретру крыс иглой для подкожного введения. Животных подвергали этой обработке спустя одну неделю после создания повреждения SUI. Самок крыс анестезировали и выполняли затем две инъекции (10 микролитров каждая) на крысу при положении уретры 2 часа и 10 часов. Обработанные носителем животные получали только HBSS таким же образом.

Тестирование давления точки подтекания (LPP). При 5 неделях после хирургии, крыс анестезировали и помещали в лежащее положение на спине при нулевом уровне давления и опустошали мочевой пузырь мануально. Затем мочевой пузырь наполняли солевым раствором при комнатной температуре (5 мл в час) через надлобковый катетер. Этот надлобковый катетер соединяли с насосом типа шприца и датчиком давления. Все давления мочевого пузыря относили к давлению воздуха на уровне мочевого пузыря. Сигналы давления и силы датчика усиливали и оцифровывали для сбора данных компьютером с использованием AD-инструментов, компьютерной программы Power Lab пр