Новые полностью человеческие моноклональные антитела против vap-1

Новые полностью человеческие моноклональные антитела против vap-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих полностью человеческие моноклональные антитела, распознающие белок адгезии эндотелиальных клеток, VAP-1, и, в частности, к полностью человеческому моноклональному антителу, обозначенному BTT-1023, которое распознает функциональный эпитоп VAP-1.

Известный уровень техники

Публикации и другой материал, используемый в настоящем описании для иллюстрации известного уровня техники и, в частности, фактов, предоставляющих дополнительные подробности в отношении практического использования, включены в настоящую заявку в качестве ссылки.

Обычно полноразмерные антитела обладают общей Y-образной структурой, состоящей из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей. Эти четыре полипептидные субъединицы составлены так, что две тяжелые цепи связаны, а легкая цепь присоединена к каждой тяжелой цепи с помощью дисульфидных связей. Каждый полипептид, составляющий антитело, состоит из вариабельной и константной области.

Вариабельная область локализована в плечах Y-образного антитела и определяет антиген-связывающую специфичность антитела. Эта область содержит короткие последовательности аминокислот, которые отвечают за связывание антитела с антигеном. Эти области называют областями, определяющими комплементарность (CDR). Остальные участки вариабельных областей важны для конформации антиген-связывающего кармана в целом.

Константная область антитела локализована в основе тяжелых цепей и определяет способность антитела активировать иммунные реакции путем взаимодействий со специфическими рецепторами. Эти области обычно высококонсервативны и их вариабельность ограничена пятью основными изоформами, IgA, IgD, IgE1 IgG и IgM.

Белок-1 адгезии сосудов (VAP-1) представляет собой неклассическую, индуцируемую воспалением молекулу адгезии, экспрессируемую на эндотелиальных клетках сосудов, где она опосредует перекатывание лейкоцитов при физиологическом сдвиге. В этой роли он вносит вклад в рециркуляцию лимфоцитов через венулы с высоким эндотелием (HEV) вторичной лимфоидной ткани как часть нормального процесса иммунологического надзора.

Однако в условиях воспаления VAP-1 способствует инфильтрации лейкоцитов в воспаленную ткань, тем самым способствуя и поддерживая воспалительный ответ. Эта инфильтрация сама может быть повреждающим фактором при хронических воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз и многие аутоиммунные и другие воспалительные заболевания. В других случаях массивная инфильтрация провоспалительных клеток в ткань после тяжелого тканевого повреждения в результате инфаркта миокарда, удара и других заболеваний вносит вклад в деструкцию ткани, наблюдаемую при этих острых воспалительных ответах. Снижение инфильтрации клеток в места воспаления путем предотвращения функционирования VAP-1 с помощью блокирующих антител, вероятно, позволит воспалению разрешиться и приведет к улучшению клинических симптомов этих заболеваний.

В патенте США 5580780 описано моноклональное антитело (mAb) 1B2, которое распознает VAP-1 и которое может блокировать связывание лимфоцитов с HEV миндалин в тесте на замороженных срезах. MAb 1B2 представляет собой антитело IgM мыши и специфично для VAP-1.

Применение мышиных mAb в качестве терапевтических средств имеет ограниченный потенциал, так как иммунная система человека распознает мышиные антитела как чужеродное вещество и продуцирует антимышиные антитела (HAMA) для удаления их из организма. Эта иммунная реакция является основным ограничением использования мышиных антител при долговременной терапии, когда необходимо повторное введение. Использование мышиных антител против VAP-1 в клинической практике должно быть ограничено больными, получающими лечение иммуносупрессорами, и, следовательно, менее склонными к реакциям на HAMA, когда допустимо только одно введение антител, такими как при повреждении при ишемии-реперфузии при остром инфаркте или остром респираторном дистресс-синдроме.

Еще одним недостатком использования для лечения антител IgM мыши против VAP-1 является неблагоприятный кинетический профиль таких антител, т.е. короткий период полжизни, который делает их неподходящими для использования при хронических нарушениях, таких как ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, псориаз и многие другие заболевания.

В данной области известно несколько методов создания менее иммуногенных моноклональных антител. Предпочтительные подходы включают «гуманизацию» антител. Часто используемыми стратегиями являются создание химерных mAb, гуманизированных mAb или полностью человеческих mAb. Химерные антитела представляют собой антитела, у которых вариабельная область является мышиной, а константная область является человеческой. В химерных антителах приблизительно 70% молекулы антитела грызуна обычно замещено соответствующими последовательностями человека, но при этом сохраняются антиген-связывающие сайты грызуна с их конкретной специфичностью и сродством. Гуманизированные антитела представляют собой антитела, в которых вариабельная область может быть мышиной, но которые подвергнуты мутации так, что более похожи на антитело человека и могут содержать человеческую константную область. Полностью человеческие антитела представляют собой антитела, в которых как вариабельная область, так и константная область являются человеческими.

В международной патентной публикации WO03/093319 раскрыто химерное моноклональное антитело BTT-1002 против VAP-1, которое отличается тем, что способно вызвать пониженный иммунный ответ по сравнению с соответствующими антителами мыши. Однако, будучи химерным антителом, BTT-1002 по прежнему имеет белковые последовательности, соответствующие вариабельные области антитела, которые непосредственно и без модификации являются мышиными. Это антитело сохраняет возможность распознаваться как чужеродное и быть иммуногенным при введении человеку. Его фармакологические свойства, такие как его полупериод выведения, и функциональные свойства также могут быть не удовлетворительными из-за его иммуногенности и, следовательно, продукции антител против него.

Таким образом, в данной области существует потребность в полностью человеческом антителе против VAP-1 с пониженной иммуногенностью и улучшенными фармакологическими свойствами.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение в широком смысле относится к новым полностью человеческим антителам против VAP-1, способам получения таких антител и применению антител. Настоящее изобретение дополнительно относится к полинуклеотидам, кодирующим указанные антитела против VAP-1.

Настоящее изобретение относится к полностью человеческому моноклональному антителу, которое можно использовать в диагностике и/или терапии in vivo, у которого понижен потенциал выработки иммунного ответа у больных и которое обладает эффективными фармакологическими характеристиками для терапевтических целей.

Также настоящее изобретение относится к тяжелой и легкой цепи полностью человеческих антител против VAP-1 или их фрагментов.

Дополнительно настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полностью человеческие антитела против VAP-1 или их фрагментам, а также экспрессионным векторам и клеткам-хозяевам, включающим эти нуклеиновые кислоты для рекомбинантной экспрессии антител против VAP-1.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам получения полностью человеческих антител против VAP-1 по настоящему изобретению рекомбинантными методами получения.

Описаны также фармацевтические композиции, содержащие указанные антитела, и их терапевтическое применение.

Краткое описание фигур

Ниже изобретение описано более подробно с помощью предпочтительных вариантов осуществления со ссылкой на прилагаемые фигуры.

На фигурах с 1 по 5 представлены нуклеотидные последовательности и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельных областей антител против VAP-1 8C10 (фигура 1A-B), 8A4 (фигура 2A-B), 3F10 (фигура 3A-B), 5F12 (фигура 4A-B) и 4B3 (фигура 5A-B). Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи (V_L) (A) и вариабельных областей тяжелой цепи (V_H) (B) были выведены из клонированных кДНК. Три CDR в каждой аминокислотной цепи представлены жирным шрифтом с подчеркиванием соответствующих нуклеотидных последовательностей.

На фигуре 6 представлено выравнивание вариабельных областей белковой последовательности 8C10, 8A4, 3F10, 5F12 и 4B3 тяжелой цепи V_H, показывающее консенсусную последовательность (фиг. 6A). Выравнивание CDR с 1 по 3 тяжелой цепи V_H с консенсусной последовательностью представлено на фиг. 6B, фиг. 6C и фиг. 6D. На фигуре 6E представлено выравнивание вариабельных областей белковой последовательности 8C10, 8A4, 3F10, 5F12 и 4B3 легкой цепи V_L, показывающее консенсусную последовательность. Выравнивание CDR с 1 по 3 легкой цепи V_L с консенсусной последовательностью представлено на фиг. 6F, фиг. 6G и фиг. 6H.

На фигуре 7 проиллюстрировано связывание VAP-1 рекомбинантным полностью человеческим антителом r8C10 (BTT-1023) на клетках Ax, экспрессирующих на клеточной поверхности VAP-1 человека, продемонстрированное с помощью FACS анализа (сортировки клеток с помощью активации флуоресценции) окрашенных на BTT-1023 клеток Ax, экспрессирующих VAP-1, по сравнению с контрольными окрашенными клетками.

Фигура 8 иллюстрирует эффект BTT-1023 на трансмиграцию лейкоцитов in vitro. Представлено количество мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), трансмигрировавших через монослои эндотелиальных клеток, обработанных BTT-1023 или контрольными антителами. Величины ошибки представлены как стандартная ошибка среднего, N= 6.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к полностью человеческим, предпочтительно, полученным рекомбинантными способами, моноклональным антителам (mAb), специфически распознающим белок-1 адгезии сосудов, VAP-1, человека. Полностью человеческие моноклональные антитела по настоящему изобретению имеют пониженную иммуногенность по сравнению с соответствующими гуманизированными антителами и, следовательно, являются эффективными для лечения ряда аутоиммунных заболеваний, воспалительных состояний и заболеваний соединительной ткани, кожи и желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы и легочных систем, включая такие состояния, как хронический артрит, воспалительные заболевания кишечника и хронические дерматиты. Полностью человеческие антитела против VAP-1, кроме того, эффективны для использования в диагностике in vitro и in vivo, включая иммуносцинтиографическую визуализацию участков воспаления in vivo.

Используемый в настоящем описании термин «вариант консервативной последовательности» включает модификации нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, которые существенно не изменяют связывающих свойств полностью человеческих антител против VAP-1 по настоящему изобретению. Варианты консервативной нуклеотидной последовательности включают варианты, возникающие из-за вырожденности генетического кода и из-за молчащих мутаций. Изобретение также охватывает нуклеотидные замены, делеции и добавки. Варианты консервативной аминокислотной последовательности включают варианты, возникающие из-за аминокислотных замен сходными аминокислотами, хорошо известными в данной области. Также изобретение включает делеции и добавки аминокислот.

Полипептиды и полинуклеотиды по настоящему изобретению включают полипептиды и полинуклеотиды, которые по меньшей мере на 80% или по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны полностью человеческим антителам против VAP-1 или полинуклеотидам, кодирующим указанные антитела, описанным ниже.

Настоящее изобретение относится к тяжелой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей по меньшей мере одну консенсусную последовательность CDR, выбранную из группы, состоящей из:

a) последовательности X₁X₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO:1), где

X₁ представляет собой небольшую полярную или основную аминокислоту, такую как S, N или R,

X₂ представляет собой ароматическую или небольшую полярную аминокислоту, такую как Y или S,

X₃ представляет собой небольшую гидрофобную или ароматическую аминокислоту, такую как A, G или W,

X₄ представляет собой гидрофобную аминокислоту, такую как M или I, и

X₅ представляет собой небольшую полярную или основную аминокислоту, такую как H или S;

b) последовательности X₁X₂X₃X₄X₅GX₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁DSVX₁₂G (SEQ ID NO:2), где

X₁ представляет собой небольшую аминокислоту, такую как V, A или N,

X₂ представляет собой небольшую алифатическую аминокислоту, такую как I или L,

X₃ представляет собой ароматическую, основную или гидрофобную аминокислоту, такую как W, G или K,

X₄ представляет собой ароматическую или алифатическую гидрофобную, или полярную аминокислоту, такую как F, Q, V или Y,

X₅ представляет собой небольшую кислую или небольшую аминокислоту, такую как D или G,

X₆ представляет собой небольшую или алифатическую аминокислоту, такую как S, G или I,

X₇ представляет собой полярную аминокислоту, такую как N, E или Y, или аминокислота отсутствует,

X₈ представляет собой полярную аминокислоту, такую как E, K или T,

X₉ представляет собой полярную аминокислоту, такую как Y, D или N,

X₁₀ представляет собой ароматическую аминокислоту, такую как Y или H,

X₁₁ представляет собой небольшую гидрофобную аминокислоту, такую как V или A, и

X₁₂ представляет собой заряженную основную аминокислоту, такую как K или R; и

c) последовательности X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂D Y (SEQ ID NO:3), где

X₁ представляет собой заряженную кислую аминокислоту, такую как D или E,

X₂ представляет собой небольшую или гидрофобную аминокислоту, такую как A, G, K, P или Y,

X₃ представляет собой ароматическую или небольшую аминокислоту, такую как W, F, G или N,

X₄ представляет собой ароматическую или небольшую аминокислоту, такую как F или G, или аминокислота отсутствует,

X₅ представляет собой небольшую аминокислоту, такую как G или S, или аминокислота отсутствует,

X₆ представляет собой небольшую аминокислоту, такую как G, или аминокислота отсутствует,

X₇ представляет собой небольшую полярную аминокислоту, такую как T, или аминокислота отсутствует,

X₈ представляет собой полярную ароматическую аминокислоту, такую как Y, или аминокислота отсутствует,

X₉ представляет собой заряженную кислую или ароматическую аминокислоту, такую как E или F, или аминокислота отсутствует,

X₁₀ представляет собой ароматическую или небольшую аминокислоту, такую как F, G, S, V или W,

X₁₁ представляет собой небольшую или полярную ароматическую аминокислоту, такую как Y или G, и

X₁₂ представляет собой ароматическую или алифатическую гидрофобную аминокислоту, такую как F или I.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к тяжелой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей аминокислотную последовательность первой CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 4 по 8, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или аминокислотную последовательность второй CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 9 по 13, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или аминокислотную последовательность третьей CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 14 по 18, и консервативных вариантов их последовательностей. Конкретные тяжелые цепи антитела по настоящему изобретению включают вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 19 по 23, и консервативных вариантов их последовательностей.

Настоящее изобретение дополнительно относится к легкой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей по меньшей мере консенсусную последовательность одной CDR, выбранную из группы, состоящей из:

a) последовательности RASQX₁X₂SX₃X₄X₅LA (SEQ ID NO:24), где

X₁ представляет собой небольшую аминокислоту, такую как G или S,

X₂ представляет собой алифатическую аминокислоту, такую как I или V,

X₃ представляет собой небольшую полярную или положительно заряженную аминокислоту, такую как S или R,

X₄ представляет собой небольшую полярную аминокислоту, такую как S, или аминокислота отсутствует, и

X₅ представляет собой небольшую гидрофобную или ароматическую гидрофобную аминокислоту, такую как A, F, W или Y;

b) последовательности X₁ASX₂X₃X₄X₅ (SEQ ID NO:25), где

X₁ представляет собой небольшую кислую или небольшую аминокислоту, такую как D или G,

X₂ представляет собой небольшую полярную аминокислоту, такую как S или N,

X₃ представляет собой алифатическую или положительно заряженную аминокислоту, такую как L или R,

X₄ представляет собой небольшую или полярную аминокислоту, такую как A, E или Q, и

X₅ представляет собой полярную или положительно заряженную аминокислоту, такую как S, T или R; и

c) последовательности QQX₁X₂X₃X₄PX₅T (SEQ ID NO:26), где

X₁ представляет собой ароматическую или положительно заряженную аминокислоту, такую как F, Y или R,

X₂ представляет собой небольшую аминокислоту, такую как N, G или S,

X₃ представляет собой небольшую полярную аминокислоту, такую как S или N,

X₄ представляет собой ароматическую или небольшую полярную аминокислоту, такую как Y, F, W или S, и

X₅ представляет собой алифатическую или положительно заряженную аминокислоту, такую как L или R.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к легкой цепи полностью человеческого антитела против VAP-1, включающей аминокислотную последовательность первой CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 27 по 31, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или аминокислотную последовательность второй CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 32 по 36, и консервативных вариантов их последовательностей, и/или аминокислотную последовательность третьей CDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 37 по 41, и консервативных вариантов их последовательностей. Конкретные тяжелые цепи антитела по настоящему изобретению включают вариабельную область, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 42 по 46, и консервативных вариантов их последовательностей.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к полностью человеческому антителу против VAP-1, включающему тяжелые и легкие цепи по настоящему изобретению. Молекулы антитела и цепи по настоящему изобретению могут включать полную природную молекулу антитела, обладающую полноразмерными тяжелыми и легкими цепями; их фрагмент, такой как Fab, Fab', F(ab')2 или Fv фрагмент; мономер или димер легкой или тяжелой цепи; или одноцепочечное антитело, например, одна цепь Fv, в которой вариабельные области тяжелой и легкой цепей соединены пептидным линкером; или любой другой рекомбинантный продукт, или молекула внедренной CDR. Сходно, вариабельная область тяжелой и легкой цепей может подходящим образом объединяться с другими доменами антитела.

В данной области хорошо известно, что домен CDR3 независимо от домена(нов) CDR1 и/или CDR2 один может определять специфичность связывания антитела в отношении своего антигена и что множественные антитела с одной и той же специфичностью связывания могут быть прогнозируемо созданы на основе общей последовательности CDR3.

Соответственно, в настоящем описании раскрыты моноклональные антитела, включающие один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей антитела человека или животного, не являющегося человеком, где моноклональное антитело способно специфически связывать VAP-1. В определенных аспектах настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, включающим один или несколько доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей антитела животного, не являющегося человеком, например, антитела мыши или крысы, где моноклональное антитело способно специфически связывать VAP-1. В некоторых вариантах осуществления такие антитела по изобретению, включающие один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей антитела животного, не являющегося человеком, (a) способны конкурировать за связывание с; (b) сохраняют функциональные характеристики; (c) связываются с тем же самым эпитопом; и/или (d) имеют сходное связывающее сродство, что и соответствующее родительское антитело животного, не являющегося человеком.

В других аспектах настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, содержащим один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей антитела человека, такого как, например, антитело человека, полученное у животного, не являющегося человеком, где антитело человека способно специфически связывать VAP-1. В других аспектах настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, содержащим один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей первого антитела человека, такого как, например, антитело человека, полученное у животного, не являющегося человеком, где первое антитело человека способно специфически связывать VAP-1 и где домен CDR3 первого антитела человека заменяет домен CDR3 антитела человека, которое не обладает специфичностью связывания в отношении VAP-1, с получением второго антитела человека, которое способно специфически связывать VAP-1. В некоторых вариантах осуществления такие антитела по изобретению, включающие один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепей первого антитела человека, (a) способны конкурировать за связывание с; (b) сохраняют функциональные характеристики; (c) связываются с тем же самым эпитопом; и/или (d) имеют сходное связывающее сродство, что и соответствующее родительское первое антитело человека.

Антитела по настоящему изобретению могут дополнительно характеризоваться различными физическими свойствами антител против VAP-1. Для определения и/или дифференциации различных классов антител на основе их физических свойств могут быть использованы различные тесты.

В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению могут содержать один или более сайтов гликозилирования в вариабельной области либо легкой, либо в тяжелой цепи. Присутствие одного или более сайтов гликозилирования в вариабельной области может приводить к повышенной иммуногенности антитела или изменению фармакокинетики антитела, обусловленной измененным связыванием антигена, как хорошо известно, в данной области. Как известно, гликозилирование возникает в мотивах, содержащих последовательность N-X-S/T. Гликозилирование вариабельной области может быть протестировано с использованием теста Glycoblot, при котором антитело расщепляется с получением Fab и затем тестируется на гликозилирование с использованием теста, который измеряет окисление периодата и образование основания Шиффа. Альтернативно, гликозилирование вариабельной области может быть протестировано с использованием хроматографии Dionex light (Dionex-LC), при которой сахариды Fab расщепляются до моносахаридов, и анализируется индивидуальное содержание сахаридов. В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело против VAP-1, вариабельная область которого негликозилирована. Это может быть достигнуто либо с помощью отбора антител, которые не содержат мотива гликозилирования в вариабельной области, либо с помощью мутации остатков в мотиве гликозилирования с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области.

В предпочтительном варианте осуществлении антитела по настоящему изобретению не содержат сайтов изомерии аспарагина. Деамидирование или эффект изоаспарагиновой кислоты может происходить на последовательностях N-G или D-G соответственно. Образование изоаспарагиновой кислоты может быть измерено с использованием теста равных количеств, при котором для тестирования изоаспарагиновой кислоты используется ВЭЖХ с обращенной фазой.

Каждое антитело должно иметь однозначную изоэлектрическую точку (pI), но обычно антитела попадают в диапазон рН между 6 и 9,5. pI для антитела IgG1 обычно попадает в диапазон рН 7-9,5 и pI для антитела IgG4 обычно попадает в диапазон рН 6-8. Антитела могут иметь pI, находящуюся вне этого диапазона. Изоэлектрическая точка может быть протестирована с использованием теста капиллярного изоэлектрического фокусирования, при котором создается градиент рН и может использоваться лазерное фокусирование для увеличения точности, как хорошо известно в данной области. В некоторых случаях предпочтительно иметь антитело против VAP-1, которое имеет величину pI, которая попадает в нормальный диапазон. Это может быть достигнуто либо с помощью отбора антител с pI в нормальном диапазоне, либо с помощью мутации заряженных поверхностных остатков с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области.

Каждое антитело должно иметь температуру плавления, которая является показателем тепловой стабильности. Более высокая тепловая стабильность указывает на более высокую стабильность антитела in vivo в целом. Точка плавления антитела может быть измерена с использованием таких способов, как дифференциальная сканирующая калориметрия. TM1 указывает температуру исходного разворачивания антитела. TM2 указывает температуру полного разворачивания антитела. Обычно предпочтительно, чтобы TM1 антитела по настоящему изобретению составляла выше 60°С, предпочтительно выше 65°С, даже более предпочтительно выше 70°С. Альтернативно, тепловая стабильность антитела может быть измерена с использованием кругового дихроизма, как хорошо известно в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления антитела отбирают так, что они не разрушаются быстро. Фрагментация антитела против VAP-1 может быть измерена с использованием капиллярного электрофореза (CE) и масс-спектрометрии с матрично активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ-МС), что хорошо известно из уровня техники.

В предпочтительном варианте осуществления антитела выбирают так, что они имеют минимальные агрегационные эффекты. Агрегация может вести к запуску нежелательного иммунного ответа и/или измененным неблагоприятным фармакокинетическим свойствам. Обычно приемлемы антитела с агрегацией 25% или менее, предпочтительно 20% или менее, даже более предпочтительно 15% или менее, даже более предпочтительно 10% или менее и даже более предпочтительно 5% или менее. Агрегация может быть измерена с помощью нескольких методов, хорошо известных в данной области, включая исключающую по размеру колоночную (SEC) высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и светорассеяние для идентификации мономеров, димеров, тримеров или мультимеров.

Антитела по настоящему изобретению, предпочтительно, являются антителами IgG типа и, более предпочтительно, IgG4 типа. Изобретение также охватывает другие изотипы антител, такие как IgG1, IgG2, IgG3, IgM и IgE.

В некоторых вариантах осуществления антитело по настоящему изобретению содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие аминокислотные последовательности, которые гомологичны аминокислотным последовательностям, описанным в настоящем документе предпочтительным антителам, и где антитела сохраняют желаемые функциональные свойства антител против VAP-1 по изобретению.

Например, изобретение относится к выделенному моноклональному антителу или его антиген-связывающей части, включающих вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где: (a) вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 19 по 23; (b) вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% гомологична аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: с 42 по 46; (c) антитело связывает VAP-1 человека с Kd 1 × 10^-7 М или ниже.

В других вариантах осуществления аминокислотные последовательности V_H и/или V_L на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологичны последовательностям, указанным выше. Антитело, обладающее областями V_H и V_L, с более высокой гомологией (т.е. 80% или выше) с областями V_H и V_L указанных выше последовательностей, может быть получено с помощью мутагенеза (например, сайт-направленного или опосредуемого ПЦР мутагенеза) молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих SEQ ID NO: с 19 по 23 и с 42 по 46, с последующим тестированием кодируемого измененного антитела на сохранность функции.

При использовании в настоящем описании процент гомологии между двумя аминокислотными последовательностями эквивалентен проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности двух последовательностей представляет собой функцию количества идентичных положений, используемых последовательностями (т.е. % гомологии = # идентичных положений/суммарное # положений × 100) с учетом числа пропусков и длины каждого пропуска, которые необходимы ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности двух последовательностей может быть осуществлено с использованием стандартных методов, известных в данной области.

В некоторых вариантах осуществления антитела по изобретению могут быть сконструированы с включением модификаций в области Fc, обычно с изменением одного или более функциональных свойств антитела, таких как период полужизни в сыворотке, фиксация комплемента, связывание с рецептором Fc и/или антигензависимая опосредуемая клетками цитотоксичность. Более того, антитело по изобретению может быть химически модифицировано (например, к антителу могут быть присоединены одна или более химических частей) или модифицировано для изменения его гликозилирования опять для изменения одного или более функциональных свойств антитела.

Например, область Fc может быть изменена путем замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, выбранного из аминокислотных остатков 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 (нумерация остатков в области Fc соответствует ЕС индексу Кабата), которые могут быть заменены на отличный аминокислотный остаток, так что антитело будет обладать измененным сродством к эффекторному лиганду, но сохранит антиген-связывающую способность родительского антитела. Эффекторный лиганд, сродство к которому изменяется, может представлять собой, например, рецептор Fc или компонент CI комплемента. Этот подход описывается более подробно, например, в патентах США 5624821 и 5648260.

Другой модификацией антител в настоящем описании, рассматриваемой изобретением, является пэгилирование. Антитело может быть пэгилировано, например, для повышения биологического периода полужизни антитела (например, в сыворотке). Для пэгилирования антитела антитело или его фрагмент обычно вводят в реакцию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционно-способное эфирное или альдегидное производное ПЭГ в условиях, при которых одна или более групп ПЭГ становятся присоединенными к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно, пэгилирование осуществляют путем реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционно-способной молекулой ПЭГ (или аналогичного реакционно-способного водорастворимого полимера). Используемый в настоящем описании термин «полиэтиленгликоль» предназначен для охвата любых форм ПЭГ, которые используются для дериватизации других белков, таких как моно (CI-CIO)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль-малеимид. В определенных вариантах осуществления антитело, предназначенное для пэгилирования, представляет собой антитело без гликозильных остатков. Методы пэгилирования белков известны в данной области и могут быть использованы в отношении антител по изобретению.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к специфическим полностью человеческим антителам против VAP-1 8C10, 8A4, 3F10, 4B3 и 5F12. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным полностью человеческим антителам против VAP-1, таким как 8C10, 8A4, 3F10, 4B3 и 5F12. В рекомбинантных r8C10 (BTT-1023) тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 47, и легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 48.

Таблица 1Аминокислотные последовательности полностью человеческих антител против VAP-1
SEQ ID NO	Описание последовательности
1	Консенсусная последовательность CDR1 тяжелой цепи
2	Консенсусная последовательность CDR2 тяжелой цепи
3	Консенсусная последовательность CDR3 тяжелой цепи
4	CDR1 тяжелой цепи 8C10
5	CDR1 тяжелой цепи 8A4
6	CDR1 тяжелой цепи 3F10
7	CDR1 тяжелой цепи 5F12
8	CDR1 тяжелой цепи 4B3
9	CDR2 тяжелой цепи 8C10
10	CDR2 тяжелой цепи 8A4
11	CDR2 тяжелой цепи 3F10
12	CDR2 тяжелой цепи 5F12
13	CDR2 тяжелой цепи 4B3
14	CDR3 тяжелой цепи 8C10
15	CDR3 тяжелой цепи 8A4
16	CDR3 тяжелой цепи 3F10
17	CDR3 тяжелой цепи 5F12
18	CDR3 тяжелой цепи 4B3
19	Вариабельная область тяжелой цепи 8C10
20	Вариабельная область тяжелой цепи 8A4
21	Вариабельная область тяжелой цепи 3F10
22	Вариабельная область тяжелой цепи 5F12
23	Вариабельная область тяжелой цепи 4B3
24	Консенсусная последовательность CDR1 легкой цепи
25	Консенсусная последовательность CDR2 легкой цепи
26	Консенсусная последовательность CDR3 легкой цепи
27	CDR1 легкой цепи 8C10
28	CDR1 легкой цепи 8A4
29	CDR1 легкой цепи 3F10
30	CDR1 легкой цепи 5F12
31	CDR1 легкой цепи 4B3
32	CDR2 легкой цепи 8C10
33	CDR2 легкой цепи 8A4
34	CDR2 легкой цепи 3F10
35	CDR2 легкой цепи 5F12
36	CDR2 легкой цепи 4B3
37	CDR3 легкой цепи 8C10
38	CDR3 легкой цепи 8A4
39	CDR3 легкой цепи 3F10
40	CDR3 легкой цепи 5F12
41	CDR3 легкой цепи 4B3
42	Вариабельная область легкой цепи 8C10
43	Вариабельная область легкой цепи 8A4
44	Вариабельная область легкой цепи 3F10
45	Вариабельная область легкой цепи 5F12
46	Вариабельная область легкой цепи 4B3
47	Тяжелая цепь рекомбинантного r8C10
48	Легкая цепь рекомбинантного r8C10

Полностью человеческие антитела против VAP-1, предпочтительно, получают путем иммунизации мышей, у которых природные гены иммуноглобулинов мыши инактивированы и функционально заменены на весь набор генов иммуноглобулинов человека или его часть. Таких мышей иммунизируют антигеном VAP-1 и затем от этих мышей создают гибридомы, продуцирующие антитела человека, с использованием обычных способов. Затем идентифицируют клонированные клетки гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, взаимодействующие с антигеном VAP-1, и наращивают их для получения очищенных полностью человеческих моноклональных антител.

Альтернативные способы получения антитела человека включают перенос специфичности антитела животного на иммуноглобулин человека. Например, мышей иммунизируют антигеном VAP-1 и затем от этих мышей создают продуцирующие антитела гибридомы с использованием обычных способов. Клонированные гибридомные клетки, которые продуцируют моноклональные антитела, взаимодействующие с антигеном VAP-1, затем идентифицируют и наращивают их для получения очищенных моноклональных антител. Определяют последовательности кДНК вариабельных областей тяже