Композиции на основе полипептида -амилазы из bacillus, вид 195, и их применение

Композиции на основе полипептида -амилазы из bacillus, вид 195, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем изобретении описываются композиции и способы использования α-амилазных ферментов, полученных из Bacillus sp. 195.

Предпосылки создания изобретения

Крахмал представляет собой смесь амилозы (15-30 вес. %) и амилопектина (70-85 вес. %). Амилоза состоит из линейных цепей α-1,4-связанных глюкозных единиц с молекулярным весом (М.в.) от примерно 60000 до примерно 800000. Амилопектин представляет собой разветвленный полимер, содержащий α-1,6 точки ветвления через каждые 24-30 глюкозных единиц; его М.в. может достигать 100 миллионов.

Сахара из крахмала, в виде концентрированных сиропов декстрозы, в настоящее время получают в процессе ферментативного катализа, который включает: (1) ожижение (или снижение вязкости) твердого крахмала с α-амилазой до получения декстринов со средней степенью полимеризации 7-10 и (2) осахаривание полученного ожиженного крахмала (т.е. гидролизата крахмала) амилоглюкозидазой (также называемой глюкоамилазой или ГА). Полученный сироп характеризуется высоким содержанием глюкозы. Большую часть получаемого в коммерческих масштабах глюкозного сиропа далее подвергают ферментативной изомеризации до смеси декстрозы/фруктозы, известной как изосироп.

Как известно, α-амилазы (ЕС 3.2.1.1) гидролизуют крахмал, гликоген и родственные полисахариды путем расщепления внутренних α-1,4-глюкозидных связей в случайном порядке. Этот фермент имеет множество важнейших направлений его применения, в частности, в сахарной, пивоваренной, спиртовой и текстильной промышленностях. При этом α-амилазы выделяют из большого числа бактерий, грибов, растений и животных, используемых в качестве источника. Наиболее важные α-амилазы, в контексте их в промышленного применения, включают те α-амилазы, которые выделяют из видов Bacilli.

В течение многих лет α-амилазные ферменты использовали для различных целей, включая ожижение крахмала, расшлихтовку нитей, модификацию крахмала в бумажной и целлюлозно-бумажной промышленности и в пивоварении. Эти ферменты могут также использоваться в средствах для мытья посуды и для стирки для удаления крахмалистых окрашенных веществ.

Одна из α-амилаз Bacillus, которая была подвергнута секвенированию, представляет собой фермент из Bacillus sp. 195 (ВАА). Этот фермент состоит из двух доменов: каталитического домена, аналогичного таковым в α-амилазах животных, и домена, который содержит два крахмалсвязывающих мотива (см. J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region of Bacillus sp. 195 a-amylase contributes to starch binding and raw starch degrading," Biochem J. 350: 477-484 (2000)). В указанной работе Сумитани с соавт. (Sumitani et al., (2000)) были обнаружены три активных формы генных продуктов в культуральном супернатанте из Streptomyces lividans, где в указанной культуре генный продукт Bacillus sp. 195 экспрессировался в гетерологическом варианте. Три указанных продукта представляют собой форму размером 69 кДа, форму размером 60 кДа и форму размером 50 кДа. Форма размером 69 кДа, во всей видимости, представляет собой полноразмерный зрелый белок с молекулярным весом, эквивалентным его расчетному значению, вычисленному на основе нуклеотидной последовательности гена полной длины. Форма размером 60 кДа, по всей видимости, соответствует природному ферменту из Bacillus sp. 195 и, предположительно, может быть получена при протеолитическом процессинге, осуществляемом на участке между двумя крахмалсвязывающими мотивами, на С-конце. Эта форма характеризуется сниженной активностью применительно к связыванию и деградации необработанного крахмала в сравнении с формой 69 кДа. Тогда как форма размером 50 кДа вообще не способна связывать или разлагать нерастворимые крахмалы.

Амилазы использовались при обработке текстильных материалов, в препаратах для стирки и чистки, в композициях для расшлихтовки волокон, в хлебопечении, при ожижении и обработке крахмала. Таким образом, имеется насущная потребность в идентификации α-амилаз, которые можно было бы получать в рамках более легкого процесса со сниженной стоимостью с целью достижения рентабельности их производства, снижения стоимости доставки от производственных помещений и с достижением большей активности продуктов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Соответственно, один аспект настоящего изобретения относится к α-амилазе из Bacillus sp. 195, которая может быть получена в больших количествах и с меньшей стоимостью в ответ на потребности промышленного производства. Указанные варианты могут использоваться во множестве композиций и способов, где используется α-амилаза.

Один из объектов настоящего изобретения относится к нуклеиновой кислоте, в одном из альтернативных подходов, к оптимизированной нуклеиновой кислоте, показанной на фиг. 2 (SEQ ID NO: 2). Другой аспект настоящего изобретения относится к гену α-амилазы, оперативно связанному с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид α-амилазы из Bacillus licheniformis или его усеченный, процессированный полипептид.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует усеченную форму полипептида, показанного на фиг. 4, где указанное усечение, или процессинг, может быть осуществлен по любому остатку после аминокислоты 491 (например, по аминокислоте 492, 494, 504, 509, после любого крахмалсвязывающего домена и т.п.).

Другой аспект настоящего изобретения относится к полноразмерному полипептиду, показанному на фиг. 4, или к любому усеченному по карбоксиконцу продукту, где указанное усечение локализовано после остатка 491.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к вектору, оперативно связанному с нуклеиновой кислотой, кодирующей указанные полипептиды.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к выделенной клетке-хозяину, содержащей любую из указанных нуклеиновых кислот или векторов, включающих указанные нуклеиновые кислоты. Выделенная клетка-хозяин может представлять собой прокариотическую или эукариотическую клетку. Выделенная клетка-хозяин может представлять собой бактериальную клетку (например, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus. B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. thuringiensis, Streptomyces lividans, S. murinus или Escherichia coli).

Другой аспект относится к детергентной добавке, включающей полипептид согласно настоящему описанию, где указанная детергентная добавка необязательно имеет вид нераспыляемого гранулята, микрогранулята, стабилизированной жидкости, геля или защищенного фермента. Указанный полипептид в детергентной добавке может представлять собой усеченный полипептид согласно приведенному выше описанию. Детергентная добавка может содержать от примерно 0,02 мг до примерно 200 мг полипептида на грамм детергентной добавки. Указанная детергентная добавка может дополнительно включать фермент, выбранный из группы, состоящей из протеазы, липазы, пероксидазы, оксидазы, аминолитического фермента, целлюлазы, полиэстеразы и любого их сочетания.

Другой аспект относится к детергентной композиции, включающей любую из описанных выше детергентных добавок. Детергентная композиция может необязательно включать один или несколько из указанных ингредиентов: поверхностно-активное вещество, отбеливающее систему или отбеливатель, детергентный наполнитель, полимер, стабилизатор, кондиционер для ткани, пенообразователь, супрессор образования мыльной пены, антикоррозийный агент, краситель, отдушку, средство для суспендирования загрязняющего материала, ингибитор потускнения, оптический осветлитель или бактерицидное вещество. Детергентная композиция может включать или включать вдобавок дополнительный фермент, где указанный фермент представляет собой протеазу, липазу, пероксидазу, оксидазу, амилолитический фермент, целлюлазу, полиэстеразу или любое их сочетание.

Другой аспект относится к детергентной композиции для ручного или автоматизированного мытья посуды, включающей полипептид согласно настоящему описанию.

Еще один аспект относится к способу мытья посуды, где указанный способ включает применение детергента для ручного или автоматизированного мытья посуды согласно настоящему описанию для мытья одной или нескольких единиц, при необходимости. Указанный способ мытья посуды включает добавление детергента для мытья посуды в таком количестве, что промывная жидкость содержит полипептид согласно настоящему описанию, в количестве от примерно 0,01 м.д. до примерно 4 м.д.

Другой аспект относится к детергентной композиции для стирки белья, включающей детергентную добавку согласно настоящему описанию. Еще один аспект относится к способу чистки ткани, включающему промывку загрязненной ткани в растворе детергентной композиции согласно настоящему изобретению. Рассматриваемый способ также относится к полипептиду согласно настоящему описанию, где указанный полипептид применяется в растворе в количестве от примерно 0,01 до примерно 2 м.д. в растворе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг. 1 А-В. Нуклеотидная кодирующая последовательность для α-амилазы из Bacilus sp. 195 (номер доступа АВ006823). Нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид amy195, подчеркнута. STOP-кодон выделен жирным шрифтом. SEQ ID NO:1.

Фиг. 2. Нуклеотидная кодирующая последовательность для α-амилазы из Bacilus sp. 195, после оптимизации кодонов. Нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый белок amyl95, находится после нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный пептид для α-амилазы из B. licheniformis (LAT) (SEQ ID NO: 2). Нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид LAT, подчеркнута. Стоп-кодон выделен жирным шрифтом. Оптимизация аминокислотных кодонов проведена с использованием системы GeneArt® (GeneArt GmbH, Germany).

Фиг. 3. Полипептидная последовательность Amy195 (SEQ ID NO: 3). Сигнальная последовательность охватывает остатки 1-46 (подчеркнуты). Зрелый белок Amy195 начинается от остатка 47. Кодоны, кодирующие выделенные жирным шрифтом и подчеркиванием остатки, замещены стоп-кодоном с целью получения генетически процессированных форм. Таким образом, Y511, K521 и V526, где используется нумерация согласно фиг. 3, представляют собой последние аминокислотные остатки в генетически процессированных формах.

Фиг. 4. Аминокислотная последовательность Amy195 показана в виде гетерологичного белка слияния с сигнальной последовательностью LAT (SEQ ID NO: 4). Прописными буквами в карбоксиконцевой части показаны крахмалсвязывающие домены, принадлежащие к семейству CBD-25. Прописными буквами (остатки 1-29) на аминоконце обозначены сигнальные последовательности амилазы, полученные из B. licheniformis. Заглавные буквы обозначают каталитический домен фермента, включающий субдомены, А, В и С, которые, предположительно, будут охватывать остатки, примерно на участках 30-105 и 208-300 для субдомена А; примерно остатки 106-207 для субдомена В; и примерно остатки 301-492 для субдомена С. Val492 представляет собой последний аминокислотный остаток в протеолитически усеченной форме (используется нумерация, приведенная на фиг. 4). Следует отметить, что субдомен А прерывается в показанной линейной последовательности полипептида.

Фиг. 5. Схематическое изображение связи нуклеиновой кислоты, кодирующей α-амилазу из Bacillus sp. 195, с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнальную последовательность LAT и терминирующую последовательность LAT в векторе pHPLT. Указанные плазмиды pHPLT известны в данной области (см., например, патенты США No. 5871550 и 6562612, а также публикации патента США 20060014265). Вектор pHPLT встраивают с достижением генной экспрессии amy195 в девяти штаммах B. subtilis с делетированной протеазой (см. US20050202535A1).

Фиг. 6. Показаны результаты теста на функционирование фермента Amy195 в качестве функции рН и концентрации белка. Исследованная фракция показана в виде е-пула на фиг. 10. Тест проводят в 96-ячеечном планшете. В каждую ячейку помещают образцы ткани в одну четверть дюйма (0,00635 м), загрязненные окрашенным рисовым крахмалом (Testfabrics Inc., CS28-окрашенный рисовый крахмал). Буфер: 25 мМ HEPES, pH 8,0 или 25 мM CAPS, pH 10,3 добавляют к каждой ячейке. Планшет подвергают предварительной инкубации при 40°C. Реакцию начинают добавлением фермента Amy195 до конечной концентрации от 0 м.д. до 2 м.д. Планшет инкубируют при температуре 40°C в течение 10 минут при встряхивании со скоростью 750 об/мин в аппарате Эппендорф/Термомикс. После инкубации супернатантную жидкость переносят в новый 96-ячеечный планшет и измеряют поглощение при длине волны 488 н.м. в устройстве для анализа планшетов Molecular Devices, модель Spectra Max 190. На основе полученных данных строят график с использованием пакета прикладных программ GRAFIT, программное обеспечение Erithicus. Для построения графика используют изотермический алгоритм Лангмуира, который имеет ту же форму, что и алгоритм Михаэлиса-Ментен, доступный в составе программного обеспечения. Каждый экспрессируемый белок Amy195 содержит сигнальный пептид из LAT, но удаляется в процессе секреции и не присутствует в зрелом белке Amy195.

Фиг. 7. Тест на функционирование всех протеолитических фрагментов, показанных на фиг. 10. Проводят указанный тест и результаты изображают в виде графика, как было описано в примере 3, в соответствии с условиями, приведенными для фиг. 6, при pH 8. Приведенные данные показывают, что все фракции функционируют так же или даже лучше, чем OxAm (Genencor International, Inc.).

Фиг. 8. Проводят электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле и выявляют экспрессию кинетически процессированных молекул Amy195. При процессинге выявляются C-концевые остатки 494, 504 и 509, согласно системе нумерации, приведенной на фиг. 4. Экспрессию в культурах проводят в соответствии с описанием, приведенным в примере 2, и концентрацию оценивают с использованием OxAm в качестве стандарта плотности.

Фиг. 9. Функционирование в данном варианте применения генетически процессированных форм амилазы Amy195. Тесты на функционирование проводят с использованием культурального супернатанта, который не подвергался дальнейшей очистке. Процедуры тестирования и построения графика на основе полученных данных описаны в примере 3 согласно условиям, описанным для фиг. 6, при рН 8,0. Приведенные данные показывают, что процессированные молекулы функционируют лучше, чем OxAm.

Фиг. 10. Анализ фракций из β-циклодекстриновой колонки, которая содержит протеолитические фрагменты Amy195. Фракции обозначены символами "wl" ("промывка 1", элюированная из колонки с использованием 25 мM бис-трис-пропана, pH 8,5, 2 мM CaCl₂); "w2" ("промывка 2", элюированная дополнительной аликвотой того же буфера); и "e-пул" (фракции, элюированные 50 мM β-циклодекстрином в том же буфере и при нанесении на гель трех разных концентраций). Матрицу для β-циклодекстриновой колонки синтезируют в лабораторных условиях по стандартному протоколу из β-циклодекстрина (Sigma Aldrich Cat. No. c4767) и с использованием эпоксиактивированной Сефарозы-6B (GE Healthcare, N.J. Cat. No. 17-0480-01).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим α-амилазу из Bacillus sp. 195, и к способам их использования. Описываются также вариации способов получения α-амилазы и ее гетерологичных форм посредством модификации полипептидной последовательности зрелой α-амилазы.

Загрязнения одежды и посуды в значительной мере варьирует по составу и, в этой связи, также по их способности к удалению. Относительно небольшое число амилаз, имеющихся в настоящее время на рынке, может использоваться и для чистки одежды, и для мытья посуды. Полученная из Bacillus sp. 195 α-амилаза не демонстрирует высокой идентичности относительно какой-либо из бактериальных амилаз, применяемых в настоящее время. Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к использованию белка дикого типа в качестве скелета для идентификации его вариантов, где указанный белок обладает лучшими характеристиками с целью его применения в композициях для мытья посуды и стирки, достигаемых, например, за счет снижения зависимости от Ca²⁺, улучшения стабильности LAS, улучшения диапазона pH, улучшения температурного диапазона, повышения удельной активности и т.п.

1. Определения и сокращения

Согласно приведенному в настоящем тексте подробному описанию изобретения могут использоваться следующие сокращения и определения. Следует иметь в виду, что в тексте всего описания формы единственного числа включают также их множественные варианты, если из контекста явно не следует иное. Так, например, ссылка на фермент включает множество таких ферментов, а ссылка на дозировку включает ссылку на одну или несколько дозировок и их эквиваленты, известные специалистам в данной области и т.п.

Если особо не указано иное, все технические и научные термины в контексте настоящего описания имеют значения, общепринятые и известные специалистам в данной области. Ниже приведены следующие термины.

1.1 Сокращения

Приведенные ниже сокращения имеют указанное значение, если из приведенного описания обсуждения не следует иное.

AE	этоксилат спирта
AEO	этоксилат спирта
AEOS	этоксисульфат спирта
ASAE	этоксисульфат спирта
Amy 195	α-амилаза из Bacillus sp. 195
AOS	α-олефинсульфонат
AS	Алкилсульфат
CBD-25	семейство белков с углеводсвязывающим доменом 25
кДНК	Комплементарная ДНК
КМЦ (CMC)	карбоксиметилцеллюлоза
ДНК	дезоксирибонуклеиновая кислота
DTMPA	диэтилентриаминпентауксусная кислота
EC	Комитет по номенклатуре ферментов
ЭДТА (EDTA)	этилендиаминтетрауксусная кислота
EMPA	Eidgenoessische Matenalprufungs- und Forschungs Anstalt (Федеральная лаборатория Швейцарии по тестированию и оценке материалов)
EO	этиленоксид (полимерный фрагмент)
F&HC	средства по уходу за тканями и для других хозяйственных нуждцелей
ГА (GA)	глюкоамилаза
IPTG	изопропил-β-D-тиогалактозид
кДа	килодальтон
LAS	линейный алкилбензолсульфонат
LAT	относится к амилазе B.lichemformis (например, сигнальная или, терминирующая последовательность амилазы из B.lichemformis)
MW	молекулярный вес
MWU	Модифицированные единицы Вольгемута; 1,6×l0-5 мг/MWU= единица активности
NOBS	нонаноилоксибензолсульфонат
NTA	нитрилуксусная кислота
OxAm	Purastar HPAM 5000L (Genencor International, Inc.)
PEG	Полиэтиленгликоль
pI	изоэлектрическая точка
ПВА (PVA)	поли(виниловый спирт)
ПВП (PVP)	поли(винилпирролидон)
РНК	рибонуклеиновая кислота
SAS	алкансульфонат
ДСН-ПААГ	электрофорез в полиакриламидном геле-додецилсульфате натрия
sp.	вид
TAED	тетраацетилендиамин
w/v	вес/объем
w/w	вес/вес

1.2 Определения

Термины «амилаза» или «амилолитический фермент» в контексте настоящего описания включают любую амилазу, из таких как глюкоамилазы, α-амилазы, β-амилазы, α-амилаза Bacillus sp. дикого типа, например, такую как α-амилаза из В. licheniformis и B. subtilis. Термин «амилаза» обозначает фермент, который в числе других свойств способен катализировать разложение крахмала. Амилаза представляет собой гидролазу, которая расщепляет α-D-(1→4) O-гликозидные связи в крахмале. В основном, α-амилазы (EC 3.2.1.1; α-D-(1→4)-глюкан-глюкангидролазы) определяются как эндоферменты, расщепляющие α-D-(1→4) O-гликозидные связи в молекуле крахмала в случайном порядке. Тогда как экзоферменты амилолитического действия, такие как β-амилазы (EC 3.2.1.2; α-D-(1→4)-глюкан-мальтогидролазы) и некоторые специфичные для определенного продукта амилазы типа мальтогенной α-амилазы (EC 3.2.1.133), расщепляют молекулу крахмала с невосстановленного конца субстрата. β-амилазы, α-глюкозидазы (EC 3.2.1.20; α-D-глюкозид-глюкогидролазы), глюкоамилазы (EC 3.2.1.3; α-D-(1→4)-глюкан-глюкогидролазы) и специфичные для определенного продукта амилазы могут продуцировать мальтоолигосахариды конкретной длины из крахмала.

Термины «вариант амилазы», «вариант α-амилазы», «вариантный полипептид α-амилазы» и «вариант фермента» в контексте настоящего описания обозначают белок α-амилазы из Bacillus sp. 195, который был модифицирован, например, путем использования сигнальной последовательности из другой α-амилаз и который содержит оптимизированную последовательность. В контексте настоящего описания термины «исходные ферменты», «исходная последовательность», «исходный полипептид дикого типа», «α-амилазный белок дикого типа» и «исходные полипептиды» обозначают ферменты и полипептиды, из которых были получены вариантные формы полипептидов α-амилазы. Исходный фермент может представлять собой фермент дикого типа или α-амилазу, которая была ранее сконструирована по рекомбинантной технологии. Таким образом, α-амилазный полипептид может представлять собой рекомбинантный сконструированный фермент. Вариант α-амилазы может также представлять собой белок слияния, содержащий гетерологичный полипептид α-амилазы. Так, например, белок α-амилазы может включать сигнальный пептид из α-амилазы B. licheniformis (LAT), соединенный со зрелым белком другой α-амилазой из Bacillus. Термин «вариант» может использоваться взаимозаменяемо с термином «мутант». Варианты включают полипептиды, а также нуклеиновые кислоты. Варианты включают вставки; указанные варианты могут также включать дополнительные замещения, вставки, трансверсии, усечения и/или инверсии в одном или нескольких положениях. Варианты могут включать последовательности, которые являются комплементарными к последовательностям, которые способны гибридизироваться с нуклеотидными последовательностями согласно настоящему описанию. Например, вариантная последовательность комплементарна к последовательностям, способным гибридизироваться в жестких условиях (т.е. в условиях, включающих 50°C и промывку с использованием 0,2 × SSC {I × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃ цитрат, pH 7,0}) с нуклеотидными последовательностями согласно настоящему описанию. Термин «вариант» может также включать последовательности, которые комплементарны к последовательностям, способным гибридизироваться в очень жестких условиях (т.е. при температуре 65°C и при промывке в 0,1 × SSC {I × SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃ цитрат, pH 7,0}) с нуклеотидными последовательностями согласно настоящему описанию.

Термины «α-амилаза Bacillus sp. 195», «α-амилаза Amy 195» или «Amy 195» в контексте настоящего описания обозначают нуклеиновую кислоту (фиг. 1), кодирующую белок согласно фиг. 3, или синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты согласно фиг. 2, которая также кодирует белок согласно фиг. 4. Она может включать любую усеченную форму (например, усеченную после остатка 492 в природном, рекомбинантном или синтетическом варианте, фермента форму фермента без сигнальной последовательности или форму фермента с гетерологичной сигнальной последовательностью и усеченной по карбоксиконцу). Кроме того, указанные термины могут охватывать любую производную последовательность согласно фиг. 3 и соответствующую ей последовательность ДНК, содержащую аминокислотные замещения, делеции, вставки или расширения аминокислот по N- или C-концу, которые не встречаются в природе.

Термин «выделенная» относится к последовательности, которая, по меньшей мере, в значительной части свободна, по меньшей мере, от одного другого компонента, с которым данная последовательность ассоциирована и встречается в природе.

Термин «очищенный» обозначает материал, который находится в относительно чистом состоянии, т.е., по меньшей мере, в состоянии 90% чистоты или который характеризуется, по меньшей мере, примерно 95% чистоты или, по меньшей мере, примерно 98% чистоты.

Термин «термостабильный» в контексте настоящего описания обозначает способность фермента сохранять активность после воздействия повышенных температур. Термостабильность фермента, такого как α-амилаза, определяется по его периоду полужизни. Период полужизни (t_1/2) представляет собой время в минутах, часах или днях, в течение которого теряется половина ферментативной активности в определенных условиях. Значение периода полужизни вычисляется при измерении остаточной активности α-амилазы.

Выражение «диапазон рН» относится к способности фермента демонстрировать каталитическую активность в условиях, варьирующих от кислых до основных, с охватом 5 или более единиц рН.

В контексте настоящего описания термин «рН-стабильный» относится к способности фермента сохранять активность в широком диапазоне значений рН.

В контексте настоящего описания термин «аминокислотная последовательность» используется как синоним термина «полипептид» и/или термина «белок». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» используется как синоним термина «пептид». В некоторых случаях термин «аминокислотная последовательность» используется как синоним термина «фермент».

В контексте настоящего описания термин «нуклеотидная последовательность» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относится к олигонуклеотидной последовательности или полинуклеотидной последовательности и к их варианту, гомологам, фрагментам и производным (таким как их часть). Указанная нуклеотидная последовательность может быть геномной, синтетической или рекомбинантной и может быть как двуцепочечной, так и одноцепочечной, представляя смысловую или антисмысловую цепь. В контексте настоящего описания термин «нуклеотидная последовательность» включает геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК.

Термин «гомолог» в контексте настоящего описания обозначает структуру, обладающую определенной степенью идентичности с целевыми аминокислотными последовательностями и с целевыми нуклеотидными последовательностями. Гомологичная последовательность включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 75%, 80%, 85% или 90% идентична или, по меньшей мере, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична целевой последовательности. В типичном случае, гомологи включают те же активные сайты, что и целевая аминокислотная последовательность.

В контексте настоящего описания термин «гибридизация» обозначает способ, посредством которого одна цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью в ходе спаривания оснований, а также способ амплификации, проводимый в рамках полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР). Вариантная форма нуклеиновой кислоты для α-амилазы может существовать в виде одноцепочечной или двуцепочечной ДНК или РНК, гетеродуплекса РНК/ДНК или сополимера РНК/ДНК.

В контексте настоящего описания, термин «сополимер» относится к одноцепочечной нуклеиновой кислоте, которая включает и рибонуклеотиды, и дезоксирибонуклеотиды. Нуклеиновая кислота для α-амилазы может даже быть оптимизирована по кодонам для дополнительного усиления экспрессии.

В контексте настоящего описания, термин «синтетический» определяет условия, при которых была достигнута продукция in vitro, путем химического или энзиматического синтеза. Этот термин включает, без ограничения, вариантные формы нуклеиновых кислот для α-амилазы, которые получают при оптимизации использования кодонов в организмах-хозяевах, таких как, без ограничения, Pichia, Streptomyces, Trichoderma reesei и Hansenula.

В контексте настоящего описания, термин «трансформированная клетка» включает клетки, которые были генетически изменены за счет использования технологии рекомбинантных ДНК. Трансформацию в типичном случае проводят при встраивании одной или нескольких нуклеотидных последовательностей в клетку. Встроенная нуклеотидная последовательность может представлять собой гетерологичную нуклеотидную последовательность (т.е. последовательность, которая не является природной для клетки, подлежащей трансформации, такая как последовательность, кодирующая белок слияния).

В контексте настоящего описания, термин «оперативно связанный» обозначает тот факт, что описываемые компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать заданным способом. Регуляторную последовательность, оперативно связанную с кодирующей последовательностью, подвергают лигированию таким образом, чтобы экспрессия кодирующей последовательности достигалась в условиях, совместимых с контрольными последовательностями.

В контексте настоящего описания, термин «биологически активный» относится к последовательности, имеющей аналогичные структурные свойства (но необязательно в той же самой степени) и/или аналогичную регуляторную функцию (но необязательно в той же степени), и/или аналогичную биохимическую функцию (но необязательно в той же степени), что и природная последовательность.

2. Нуклеиновые кислоты и кодируемые ими полипептиды

Последовательность нуклеиновой кислоты из Bacillus sp. 195 может быть оперативно связана с различными промоторами и регуляторами в векторе и экспрессироваться в различных клетках-хозяинах. Последовательность нуклеиновой кислоты, включающая 2103 остатка, описана и депонирована в GenBank с номером доступа No. AB006823 (см. фиг. 1A-B). Полипептидная последовательность, кодируемая последовательностью нуклеиновой кислоты из 2103 остатков, описана и депонирована в GenBank с номером доступа BAA22082.1 и включает 700 аминокислот в длину (фиг. 3). Первые 46 аминокислот формируют сигнальный пептид. Расщепление осуществляется после остатка 46 (Ala46).

При экспрессии в клетках B.subtilis образуются три протеолитически процессированных формы белка, выявляемые при анализе в геле. Все указанные формы имеют одинаковый аминоконец, но отличаются по своему карбоксиконцу. Форма размером 49,5 кДа заканчивается остатком Val492 (последовательность, приведенная на фиг. 4), т.e. в ней протеолитическое расщепление происходит после остатка 492. Две других более длинных формы, размером 69 кДа и 60 кДа, соответственно, содержат один и два крахмалсвязывающих домена, как описано в работе Сумитани с соавт. (Sumitani et al., (2000)). Генетически усеченные по С-концу формы получают с использованием продуктов, содержащих на С-конце остатки Tyr494, Lys504 и Val509. Все указанные продукты с усечением, полученным по рекомбинатной технологии, экспрессируются на высоком уровне в девяти штаммах B. subtilis с делетированной протеазой (см. US20050202535A1) под контролем LAT промотора и сигнальной последовательности, как показано на фиг. 8.

2.1 Белки слияния и рекомбинантные белки

Один аспект настоящего изобретения относится к белкам слияния, где используются сигнальные последовательности амилаз из других микроорганизмов, таких как дрожжи или другая бактерия, присоединенные к зрелому белку из Bacillus sp. 195. А именно: первые 46 аминокислот, формируют сигнальную последовательность согласно фиг. 3, которая может быть удалена и заменена сигнальной последовательностью из другого микроорганизма или вариантом сигнальной последовательности из другого микроорганизма. Так, например, LAT последовательность (подчеркнутая и приведенная прописными буквами) может быть замещена по первым 46 аминокислотам, как показано на фиг. 4.

Другие примеры включают, без ограничения, сигнальную последовательность для α-амилазы из В. subtilis (amyE) для экспрессии в B. subtilis, aprE промотор из B. subtilis и сигнальные последовательности, также подходящие для экспрессии в B. subtilis. Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается возможность тестирования экспрессии в Streptomyces sp. при использовании промоторов из Streptomyces и сигнальные последовательности из CelA.

3. Способ продукции и очистки белков

Способы продукции и очистки белков, которые секретируются в культуральную среду из Baallus, известны в данной области, как и известны подходящие клетки-хозяева для продукции α-амилаз. Репрезентативные методы для продукции α-амилаз описаны ниже.

3.1 Материалы и методы для продукции α-амилаз

Последовательность ДНК, кодирующая α-амилазу Amy195 или ее вариант, полученная по приведенным в настоящем описании способам или согласно любому из альтернативных способов, известных в данной области, может быть экспрессирована с образованием энзиматической формы, при использовании вектора экспрессии, который в типичном случае включает контрольные последовательности, кодирующие соответствующий промотор, оператор, сайт связывания рибосомы, сигнальную последовательность инициации трансляции и необязательно ген-репрессор или различные гены-активаторы.

Так, например, Bacillus sp. 195 может культивироваться при температуре 30°C, как описано в работе Кавагучи с соавт. (Kawaguchi et al., "Purification и some properties of a Haim-sensitive α-амилаз from newly isolated Bacillus sp. 195," Biosс. Biotechnol. Biochem 56: 1792-1796 (1992)). Альтернативно, ген, кодирующий α-амилазу, оперативно связанную с вектором, может быть трансфицирован в другой организм, такой как Streptomyces lividans TK-24, с последующим культивированием в подходящих условиях, как описано в литературе (J. Sumitani et al., "New type of starch-binding domain: the direct repeat motif in the C-terminal region oi Bacillus sp. 195 α-амилаз contributes to starch binding и raw starch degrading," Biochem. J. 350: 477-484 (2000)).

Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует α-амилазу Amy195 или ее вариант, может представлять собой любой вектор, который может быть в удобном варианте подвергнут процедурам на основе рекомбинантных ДНК, и выбор такого вектора в основном зависит от клетки-хозяина, в которую он должен вводиться. Так, указанный вектор может представлять собой автономно реплицирующийся вектор, т.е. вектор, который существует в виде внехромосомной единицы, репликация которого не зависит от репликации хромосомы, т.е. это может быть плазмида, бактериофаг или внехромосомный элемент, мини-хромосома или искусственная хромосома. Альтернативно, указанный вектор может представлять собой такой вектор, который при его введении в изолированную хозяйскую клетку интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с одной или несколькими хромосомами, в которые он интегрирован. Интегрированный ген может также быть амплифицирован с образованием множественных копий гена в хромосоме за счет использования амплифицируемой конструкции, созданной при отборе на антибиотиках или при использовании другого фактора селективного давления, такого как обязательный регуляторный ген, или за счет комплементации по типу доза-эффект применительно к обязательному гена конкретного метаболического пути.

В векторе последовательность ДНК должна быть оперативно связана с подходящей промоторной последовательностью. Указанный промотор может представлять собой любую последовательность ДНК, которая демонстрирует транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине и может быть получена из генов, кодирующих белки, гомологичные или гетерологичные, в клетке-хозяине. Репрезентативные промоторы для осуществления транскрипции последовательности ДНК, кодирующей α-амилазу Amy 195 или ее вариант, в особенности, бактериальной хозяйской клетке, представляют собой промотор lac-оперона из E. coli, промоторы гена агаразы dagA или сelA из Streptomyces coelicolor, промоторы гена α-амилазы из Bacillus licheniformis (amyL), промоторы гена мальтогенной амилазы (amyM) из Bacillus stearothermophilus, промоторы α-амилазы (amyQ) из Bacillus amyloliquefaciens, промоторы генов xylA и xylB из Bacillus subtilis и т.п. Для транскрипции в грибном организме-хозяине в качестве примеров подходящих промоторов можно указать промоторы, полученные из генов, кодирующих, соответственно, амилазу из Aspergillus oryzae TAKA, аспарагиновую протеиназу из Rhizomucor miehei, нейтральную α-амилазу из Aspergillus niger, кислотостабильную α-амилазу из A. niger, глюкоамилазу из A. niger, липазу из Rhizomucor miehei, щелочную протеазу из A. oryzae, триозофосфатизомеразу из A. oryzae или ацетамидазу из A. nidulans. В том случае, когда ген, кодирующий вариантный полипептид α-амилазы, экспрессируется в клетках бактерий, таких как E. coli, может быть выбран соответствующий промотор, например, промотор из бактериофага, включающий T7 промотор и промотор фага ламбда. Примеры подходящих промоторов для экспрессии в дрожжах включают, без ограничения, промоторы Gal 1 и Gal 10 из Saccharomyces cerevisiae и промоторы из Pichia pastor AOX1 или AOX2. Для экспрессии в клетках