Способ клонирования когнатных антител

Способ клонирования когнатных антител

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к процедуре сцепления когнатных пар кодирующих последовательностей V_H и V_L из популяции клеток, обогащенных специфическими поверхностными антигенными маркерами. Процедура сцепления включает мультиплексную процедуру молекулярной амплификации, способную в связи с амплификацией сцеплять представляющие интерес нуклеотидные последовательности в особой полимеразной цепной реакции (мультиплексной PCR). Этот способ особенно эффективен для создания библиотек когнатных пар, а также комбинаторных библиотек кодирующих последовательностей вариабельных областей из иммуноглобулина. Изобретение также относится к способам получения химерных человеческих/отличных от человеческих антител и библиотек экспрессии, полученных такими способами.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Документ WO 2005/042774 (Symphogen) раскрывает способ сцепления представляющих нуклеотидных последовательностей, в частности когнатных пар кодирующих последовательностей V_H и V_L, с применением мультиплексной молекулярной процедуры. В предпочтительном варианте представляющие интерес последовательности амплифицируют и сцепляют из выделенных единичных клеток после их серийного разведения или разделения при помощи других методик. Указанная ссылка раскрывает различные способы обогащения клеточной популяции, содержащей лимфоциты, для получения популяции плазмацитов, которые особенно пригодны для процедуры мультиплексной молекулярной амплификации.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на способы создания библиотек кодирующих последовательностей иммуноглобулинов, происходящих из животных, не являющихся человеком, и способах создания в несколько стадий, адаптированных к высокопроизводительному клонированию и скринингу, библиотек векторов, кодирующих химерные антитела, которые содержат константные области человека и вариабельные области, отличные от человеческих.

В первом аспекте изобретение относится к способу получения библиотеки когнатных пар, содержащих сцепленные кодирующие последовательности вариабельных областей, где указанный способ включает:

a) получение от донора клеточной фракции, содержащей лимфоциты,

b) получение популяции выделенных единичных клеток, включающее распределение клеток из указанной клеточной фракции индивидуально во множество резервуаров, где, по меньшей мере, субпопуляция клеток экспрессирует антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, и

c) амплификацию и осуществление сцепления кодирующих последовательностей вариабельных областей, содержащихся в указанной популяции выделенных единичных клеток, посредством амплификации в мультиплексной процедуре молекулярной амплификации представляющих интерес нуклеотидных последовательностей с использованием матрицы, полученной из выделенной единичной клетки или популяции изогенных клеток, и осуществления сцепления представляющих интерес нуклеотидных последовательностей.

Этот способ обеспечивает библиотеку когнатных пар антител или фрагментов антител. Еще в одном аспекте изобретение относится к способу сцепления случайным образом множества представляющих интерес несмежных нуклеотидных последовательностей, где указанный способ включает:

a) амплификацию в мультиплексной процедуре молекулярной амплификации представляющих интерес нуклеотидных последовательностей с использованием матрицы, полученной из популяции генетически различных клеток,

b) где генетически различные клетки получены из клеточной фракции, содержащей лимфоциты, от донора,

c) где, по меньшей мере, субпопуляция клеток экспрессирует антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220,

d) осуществление сцепления представляющих интерес нуклеотидных последовательностей, амплифицированных на стадии a).

Этот способ обеспечивает комбинаторную библиотеку комбинированных случайным образом вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи.

Экспериментальные данные, представленные в настоящей заявке, доказывают, что клеточные популяции, выделенные из мышиных спленоцитов и положительные в отношении перечисленных поверхностных антигенов, обеспечивают хороший стартовый материал для клонирования кодирующих последовательностей антител с применением способа мультиплексной молекулярной амплификации. Способы, предлагаемые изобретением, легко применимы к другим биологическим видам, экспрессирующим ортологи CD43 и CD138 или MHCII и B220, и в особенности эти способы применимы к другим грызунам, например крысам.

Способ дает несколько преимуществ по сравнению с альтернативами, например, созданием гибридомы. При получении гибридомы из иммунизированной мыши установленные клеточные линии будут кодировать репертуар разных изотипов антител. Впоследствии клеточные линии гибридомы необходимо скринировать как на функцию (например, на связывание со специфическим антигеном, эффективность нейтрализации патогена), так и на изотип антитела. Таким образом, в этом случае необходима двухстадийная процедура скрининга для отбора гибридомы со специфическим изотипом антитела и со специфическим эффектом в функциональном анализе. Наконец, для того чтобы создать клеточную линию-продуцент, необходимо клонировать и секвенировать антитело, секретируемое отобранной гибридомой прежде, чем его будет можно перенести в клеточную линию-продуцент.

Используя способ, предложенный настоящим изобретением, можно детерминировать изотип антитела посредством праймеров, использованных для мультиплексной молекулярной амплификации, следовательно, необходимость в его (изотипа) установлении отпадает. Изотип антитела также можно детерминировать (и изменить) при последующем сцеплении или сплайсинге константного домена (доменов) с клонированными вариабельными последовательностями. Кроме того, способ, предложенный изобретением, обеспечивает библиотеку полинуклеотидов, которую можно легко секвенировать и/или вставить в векторы, например, такие как векторы экспрессии, переноса, дисплея или челночные векторы, таким образом, если отобрано конкретное антитело, оно уже клонировано, его последовательность уже известна и его можно легко перенести в соответствующий вектор экспрессии для получения антитела.

Ожидается, что клетки, отсортированные в соответствии с предложенным протоколом, будут служить источником высокоаффинных антител, возможно, с аффинностью в пикомолярном диапазоне. Моноклональные антитела из гибридомы не обладают аффинностью в пикомолярном диапазоне и для достижения такой аффинности нуждаются в синтетическом созревании аффинности.

В соответствии с изобретением эти способы дополнительно включают перед мультиплексной молекулярной амплификацией оценку того, содержит ли популяция клеток, содержащая лимфоциты, клетки, экспрессирующие антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, предпочтительно CD43 и CD138. Эти способы также могут включать обогащение указанной клеточной фракции, содержащей лимфоциты, популяцией лимфоцитов, экспрессирующих антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, перед мультиплексной молекулярной амплификацией.

Предпочтительные способы дополнительно включают выделение из указанной популяции, содержащей лимфоциты, клеток, экспрессирующих антиген CD43 и CD138 или антиген MHCII и B220, перед мультиплексной молекулярной амплификацией. В предпочтительном варианте осуществления изобретения выделенные клетки или субпопуляция клеток представляют собой CD138 High/CD43 High или CD138 Intermediate/CD43 High клеточную фракцию с лимфоцитами, в которых антиген CD43 представлен на высоком, а антиген CD138 на высоком или промежуточном уровне по сравнению с клеточной фракцией, содержащей лимфоциты. Более предпочтительно выделенные клетки или субпопуляция клеток представляют собой CD138 High/CD43 High относительно клеточной фракции, содержащей лимфоциты.

Предпочтительно, чтобы обогащение или выделение включали автоматическую процедуру сортинга клеток, например MACS или FACS.

В следующем аспекте изобретение относится к способу получения вектора, кодирующего химерное антитело с константными областями человека и вариабельными областями, отличными от человеческих, где указанный способ включает:

a) получение клеточной фракции, содержащей лимфоциты, от животного, не являющегося человеком,

b) получение популяции выделенных единичных клеток, включающее распределение клеток из указанной клеточной фракции индивидуально во множество резервуаров,

c) амплификацию и осуществление сцепления кодирующих нуклеиновых кислот вариабельных областей, содержащихся в указанной популяции выделенных клеток, посредством амплификации указанных нуклеиновых кислот в мультиплексной процедуре молекулярной амплификации с использованием матрицы, полученной из выделенной единичной клетки или популяции изогенных клеток, и осуществления сцепления амплифицированных нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой и легкой цепей,

d) осуществление сцепления амплифицированных вариабельных областей с константными областями человека,

e) инсерцию полученных нуклеиновых кислот в вектор. Предпочтительным животным, не являющимся человеком, является мышь. В той степени, до которой способы, предлагаемые изобретением, применимы к мышиным клеткам, эти способы называются: Mouse-Symplex™ или mSymplex™.

В этом аспекте изобретения предлагается новый способ создания библиотек химерных антител человека/отличных от человека животных. Это стало возможным благодаря объединению мультиплексной молекулярной амплификации и последующего клонирования в скелет вектора с лигированием и/или сплайсингом константных доменов тяжелой и легкой цепи человека. Традиционно в способе получения химерных антител человека/отличного от человека животного химеризация была последней стадией после установления и скрининга гибридомы, а также клонирования кодируемого антитела. Химеризация может повлиять на специфичность связывания и/или аффинность антитела, поэтому существует риск того, что хорошее моноклональное мышиное антитело утратит свою эффективность при химеризации в антитело человека/мыши.

Предлагая способ, который напрямую генерирует антитело из категории химерных антител, можно осуществлять скрининг на продуктах, которые не нуждаются в дополнительной модификации перед доклинической и клинической стадиями разработки.

Константные области человека могут быть обеспечены на стадии молекулярной амплификации или быть частью векторного скелета, в котором клонируют вариабельные области после молекулярной амплификации. В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ включает дополнительную стадию амплификации, в которой полинуклеотид, кодирующий константную легкую цепь человека или ее фрагмент с перекрыванием, способным обеспечить сцепление с вариабельной легкой цепью, добавляют к смеси PCR вместе с набором праймеров, способным обеспечить амплификацию конструкции, содержащей в следующем порядке: мышиную цепь VH, линкер, мышиную цепь VL и константную легкую цепь человека.

В другом варианте осуществления изобретения способ включает дополнительную стадию амплификации, в которой полинуклеотид, кодирующий константную тяжелую цепь человека или ее фрагмент с перекрыванием, способным обеспечить сцепление с вариабельной тяжелой цепью, добавляют к смеси PCR вместе с набором праймеров, способным обеспечить амплификацию конструкции, содержащей в следующем порядке: константную тяжелую цепь человека, мышиную цепь VH, линкер и мышиную цепь VL.

Вследствие этого также предлагается библиотека векторов, кодирующих химерные антитела, где каждый член, относящийся к антителу, состоит из кодирующих последовательностей вариабельных областей иммуноглобулина, отличного от человеческого, и кодирующих последовательностей константных областей тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека. Предпочтительно, чтобы векторы представляли собой векторы экспрессии, обеспечивающие экспрессию членов библиотеки, относящихся к антителу, для последующего скрининга. Более предпочтительно, чтобы вектор экспрессии был приспособлен к экспрессии в организме млекопитающего.

Векторы, входящие в состав библиотеки, могут быть получены способом, предлагаемым изобретением.

В одном из вариантов осуществления изобретения константная область легкой цепи представляет собой константную область каппа.

Последовательности, отличные от человеческих, могут быть получены от крысы, овцы, козы, кролика, морской свинки или другого подходящего животного, для которого существуют протоколы иммунизации, для которого доступна информация о последовательностях, позволяющая сконструировать подходящие праймеры, и для которого доступны подходящие методики клеточного сортинга, позволяющие отсортировать плазмациты для мультиплексной молекулярной амплификации единичной клетки с целью сцепления когнатных пар последовательностей вариабельных областей. В одном из вариантов осуществления изобретения последовательности, отличные от человеческих, могут происходить от не являющегося человеком примата, например обезьяны cynomolgous, от обезьяны резус, от шимпанзе или от макака. Предпочтительно, чтобы последовательности, отличные от человеческих, происходили от грызунов, например от мыши или крысы. Еще в одном варианте осуществления изобретения последовательности, отличные от человеческих, представляют собой последовательности кролика.

Предпочтительно, чтобы вариабельные области антител представляли собой когнатные пары.

Еще в одном аспекте изобретение относится к вспомогательной библиотеке, которая кодирует антитела, проявляющие желаемые специфичности связывания, направленные к конкретной мишени, выбранной из библиотеки в соответствии с изобретением.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1. Мышиная модель - mSymplex™ PCR: Расширение мультиплексного перекрывания RT-PCR для амплификации и когнатного сцепления генов тяжелой и легкой цепи антитела из единичной клетки. Типичные смеси праймеров, использованные для RT-PCR и вложенной PCR, подробно описаны в таблице 2 и таблице 3 (или в таблице 5).

Фиг.2. Клонирование мышиного репертуара: Пул продуктов mSymplex™ PCR, кодирующих пары генов VH/VL из единичных плазматических клеток, был сплайсирован до гена, кодирующего константную легкую каппа-цепь человека, посредством сплайсинга через расширение перекрывания. Пул генов, кодирующих полноразмерные химерные антитела человека-мыши, был вставлен в вектор экспрессии с последующей вставкой двунаправленной промоторной кассеты (2×CMV). Смеси праймеров, использованные для сплайсинга каппа человека, подробно описаны в таблице 6.

Фиг.3A. Сортинг мышиных спленоцитов. (A) Для выделения плазмацитов, определенных как CD43 high (с высоким содержанием CD43), CD138 high (с высоким содержанием CD138), клетки, положительные по PI (пропидиум иодид), или мертвые клетки были исключены на нижней левой панели (не P1). Затем плазмациты были отсортированы как CD43 high, CD138 high на нижней правой панели (P2). Наконец, дубликаты были исключены на графике SSC-H по SSC-W, верхняя правая панель (P3). Клетки, положительные по всем трем выходам, были отсортированы в планшеты ELISPOT. (B) Для выделения плазмабластов, определенных как MHCII-intermediate (с промежуточным содержанием MHCII), B220-intermediate (с промежуточным содержанием B220), клетки, положительные по PI (пропидиум иодид), или мертвые клетки были исключены на нижней левой панели (не P1). Затем плазмабласты были отсортированы как MHCII-intermediate, B220-intermediate, нижняя правая панель (P2). Дубликаты были исключены на графике SSC-H по SSC-W, верхняя правая панель (P3), и, наконец, клетки были отсортированы по размеру на верхней левой панели (P4). Клетки, позитивные по всем четырем проходам, были отсортированы в планшеты ELISPOT.

Фиг.4. Сортинг мышиных спленоцитов. Прежде всего, PI-положительные или мертвые клетки были исключены на нижней левой панели (P1). На верхней правой точечной диаграмме отображены CD138 PE и CD43 FITC. Для фенотипически различных клеточных популяций были установлены четыре прохода: P2 означает CD138 intermediate, CD43 high. P3 означает CD138 high, CD43 high. P4 означает CD138 high, CD43 отрицательные. P5 означает CD138 intermediate, CD43 low. 10000 клеток, положительных по P1 и каждому из четырех проходов, были отсортированы в пробирки и заморожены для оценки в симплексной системе.

Фиг.5. Гель-электрофорез продуктов PCR, полученных в симплексной PCR при титровании клеточного лизата из 4 отсортированных фракций. P2, P3, P4 и P5 представляют собой проходы, отсортированные в соответствии с фиг.4. M - маркеры молекулярного веса.

Фиг.6. Схематическое представление вектора экспрессии 00-VP-002 полноразмерного антитела млекопитающего. Amp и Amp pro - ген устойчивости к ампициллину и его промотор, pUC origin - начало репликации pUC, CMV - промотор млекопитающих, управляющий экспрессией легкой цепи и тяжелой цепи, IGHV Leader - геномный лидер тяжелой цепи человека, H stuffer - вставка, которая заменена на кодирующую последовательность вариабельной области тяжелой цепи, IGHG1 - последовательность, кодирующая константную область тяжелой цепи изотипа G1 геномного иммуноглобулина (последовательность показана в приложении 1), Rabbit B-globin A - полиА последовательность бета-глобина кролика, IGKV Leader - мышиный каппа-лидер, L Stuffer - вставка, которая заменена на кодирующую последовательность легкой цепи, SV40 term - терминаторная последовательность вакуолизирующего обезьяньего вируса 40, FRT - целевой сайт распознавания FIp, Neo - ген устойчивости к неомицину, SV40 poly A - полиА сигнальная последовательность вакуолизирующего обезьяньего вируса 40.

Фиг.7. Анализ репертуара химерных антител anti-hEGFR. Кластерный анализ различий в поглощении на уровне 450-620 nm. Супернатанты сгруппированы по реактивности, на что указывают цифры (от 1 до 4) после номера клона. Темно-серый цвет указывает на уменьшение количества метаболически активных клеток, тогда как светло-серый цвет указывает на увеличение количества метаболически активных клеток. Черный цвет указывает на супернатанты, не оказывающие влияния на количество метаболически активных клеток.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет дальнейшие возможности применения способа амплификации и сцепления, раскрытого в документе WO 2005/042774, для обеспечения коллекций векторов антител от животных, отличных от человека. Эти усовершенствования позволяют клонировать кодирующие последовательности химерных антител человека/не являющегося человеком с когнатными парами вариабельных областей для их подгонки к высокопроизводительному формату. По существу это достигается посредством доставки нового стартового материала для процессов амплификации и сцепления и обеспечения способов создания библиотек химерных антител человека/не являющегося человеком с когнатными парами вариабельных областей.

Одним из аспектов изобретения является способ сцепления вариабельных последовательностей тяжелой и легкой цепи, включающий амплификацию в мультиплексной процедуре молекулярной амплификации важных нуклеотидных последовательностей с использованием матрицы, полученной из выделенной единичной клетки, популяции изогенных клеток или популяции генетически различных клеток, и осуществление последующего сцепления амплифицированных последовательностей.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин "когнатная пара" описывает исходную пару представляющих интерес несмежных нуклеиновых кислот, которые содержатся в единичной клетке или извлечены из единичной клетки. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения когнатная пара содержит две кодирующие последовательности вариабельных областей, которые совместно кодируют вариабельный домен связывающего белка, причем их генные последовательности получены из одной и той же клетки. Таким образом, при экспрессии в виде полного связывающего белка или его стабильного фрагмента они сохраняют аффинность связывания и специфичность связывающего белка, изначально экспрессируемого из этой клетки. Например, когнатная пара может состоять из кодирующей последовательности вариабельной тяжелой цепи антитела, связанной с кодирующей последовательностью вариабельной легкой цепи из той же самой клетки, или из кодирующей последовательности α-цепи рецептора T-клетки, связанной с кодирующей последовательностью β-цепи из той же самой клетки. Библиотека когнатных пар представляет собой коллекцию таких когнатных пар. Термин "полимераза горячего запуска" описывает полимеразы, которые неактивны или имеют очень низкую активность при температурах, используемых для обратной транскрипции. Для того чтобы стать функциональными, такие полимеразы нуждаются в активации высокими температурами (от 90 до 95°C). Это, например, является преимуществом в процедурах одностадийной RT-PCR, поскольку исключает вмешательство полимеразы в реакцию обратной транскриптазы.

Термин "изогенная популяция клеток" описывает популяцию генетически идентичных клеток. Особый интерес в настоящем изобретении представляет изогенная популяция клеток, полученная посредством клональной экспансии выделенной единичной клетки.

Термин "выделенная единичная клетка" описывает клетку, которая была физически отделена от популяции клеток, то есть соответствует определению "единичная клетка в отдельном резервуаре". При распределении популяции клеток поодиночке во множество резервуаров получают популяцию выделенных клеток. Как указано в разделе, озаглавленном "источники матриц", для того чтобы можно было применять название совокупность единичных клеток, доля резервуаров с единичной клеткой не обязательно должна составлять 100%.

Термины "связка" или "сцепление" применительно к амплификации описывают ассоциацию амплифицированных последовательностей нуклеиновой кислоты, которая составляет представляющие интерес последовательности нуклеиновой кислоты, закодированные в одном сегменте. Применительно к когнатным парам сегмент содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен, например вариабельную область тяжелой цепи антитела, связанный с кодирующей последовательностью вариабельной области легкой цепи антитела, полученной из той же клетки. Сцепление может быть достигнуто либо одновременно с амплификацией, либо представляет собой стадию, непосредственно следующую за амплификацией. Не существует каких-либо требований к форме или функциональности сегмента: он может быть линейным, кольцевым, одноцепочечным или двухцепочечным. Сцепление также не обязательно должно быть перманентным: одну из представляющих интерес последовательностей нуклеиновой кислоты можно по желанию выделить из сегмента, например одну из кодирующих последовательностей вариабельной области можно выделить из сегмента когнатной пары. Однако до тех пор, пока исходные вариабельные области, составляющие когнатную пару, не перемешаны с другими вариабельными областями, они все еще считаются когнатной парой, хотя и не сцеплены в единый сегмент. Предпочтительное сцепление представляет собой фосфодиэфирное сцепление нуклеотидов. Однако сцепление можно также получить посредством других химических процедур перекрестного соединения.

Термин "мультиплексная молекулярная амплификация" описывает одновременную амплификацию двух или более целевых последовательностей в одной и той же реакции. Пригодные способы амплификации включают полимеразную цепную реакцию (PCR) (патент США 4683202), лигазную цепную реакцию (LCR), (Wu and Wallace, 1989, Genomics 4, 560-9), методику амплификации с замещением цепи (SDA) (Walker et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20, 1691-6), самоподдерживающуюся амплификацию последовательности (Guatelli et al., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 87, 1874-8) и амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) (Compton J., 1991, Nature 350, 91-2). Два последних способа амплификации включают изотермические реакции, основанные на изотермической транскрипции, которая продуцирует как одноцепочную РНК (ssRNA), так и двуцепочную ДНК (dsDNA).

Термин "мультиплексная PCR" описывает вариант PCR, в котором одновременно амплифицируются две или более целевые последовательности, причем в одной и той же реакции используется более одного набора праймеров, например один набор праймеров адаптирован для амплификации вариабельной области тяжелой цепи, а другой набор праймеров адаптирован для амплификации вариабельной области каппа-цепи в той же реакции PCR. Дополнительно или альтернативно набор праймеров, адаптированный для амплификации вариабельной области лямбда-цепи, может быть скомбинирован с другими наборами праймеров.

Термин "мультиплексная RT-PCR" описывает мультиплексную реакцию PCR, которая предваряется стадией обратной транскрипции (RT). Мультиплексная RT-PCR может быть проведена либо как двухстадийный процесс с отдельной стадией RT перед мультиплексной PCR, либо как одностадийный процесс, в котором все компоненты как RT, так и мультиплексной PCR комбинируются в одной пробирке. Термины "мультиплексная PCR перекрывания-удлинения" и "мультиплексная RT-PCR перекрывания-удлинения" означают, что мультиплексная PCR или мультиплексная RT-PCR проводится с применением смеси праймеров перекрывания-удлинения для амплификации целевых последовательностей, то есть для одновременного достижения амплификации и сцепления целевых последовательностей.

Термин "множество резервуаров" описывает любой объект (или коллекцию объектов), который позволяет осуществить физическое отделение единичной клетки от популяции клеток. Это могут быть пробирки, многолуночные планшеты (например, 96-луночные, 384-луночные, титрационные микропланшеты или другие многолуночные планшеты), матрицы, микроматрицы, микрочипы, гели или гелевые матрицы. Предпочтительно, чтобы объект был применим для амплификации в PCR.

Термин "поликлональный белок" или "поликлональность" при использовании здесь относится к белковой композиции, содержащей разные, но гомологичные молекулы белка, предпочтительно выбранные из суперсемейства иммуноглобулинов. Таким образом, каждая молекула белка гомологична другим молекулам композиции, но также содержит один или более участков вариабельной последовательности полипептида, которые характеризуются различиями в аминокислотной последовательности между индивидуальными элементами поликлонального белка. Известные примеры таких поликлональных белков включают молекулы антитела или иммуноглобулина, рецепторы T-клеток и рецепторы B-клеток. Поликлональный белок может состоять из определенной подгруппы молекул белка, которые были охарактеризованы таким общим признаком, как совпадающая активность связывания с желательной целью, например, с поликлональным антителом, проявляющим специфичность связывания по отношению к желательному целевому антигену.

Термин "популяция генетически различных клеток" при использовании здесь относится к такой клеточной популяции, в которой клетки, входящие в состав популяции, отличаются друг от друга на геномном уровне. Такая популяция генетически различных клеток представляет собой, например, популяцию клеток, полученных от донора, или фракцию таких клеток, например клеточную фракцию, содержащую В-лимфоциты или T-лимфоциты.

Термин "набор праймеров" употребляется взаимозаменяемо с термином "пара праймеров" и описывает два или более праймеров, которые вместе способны служить затравкой амплификации представляющей интерес нуклеотидной последовательности (например, один элемент когнатной пары). Рассматриваемый в настоящем изобретении набор праймеров можно сконструировать для затравки амплификации семейства нуклеотидных последовательностей, содержащего кодирующие последовательности вариабельной области. Примерами разных семейств являются легкие каппа-цепи антител, легкие лямбда-цепи антител, вариабельные области тяжелой цепи, а также вариабельные области α, β, γ или δ рецепторов T-клеток. Набор праймеров для амплификации семейства нуклеотидных последовательностей, содержащего кодирующие последовательности вариабельных областей, часто состоит из множества праймеров, в котором некоторые праймеры могут быть вырожденными праймерами.

Термин "идентичность последовательностей" означает процентный показатель, указывающий на степень идентичности между последовательностями нуклеиновой кислоты, исходя из длины более короткой из двух последовательностей. Идентичность можно рассчитать по формуле (N_ref-N_dif)×100%/N_ref, где N_ref означает число остатков в более короткой из двух последовательностей, а N_dif - общее число неидентичных остатков в N_ref при оптимальной выверке совпадения по длине между двумя последовательностями.

Таким образом, последовательность ДНК AGTCAGTC (Seq. no. 32) будет иметь идентичность 75% с последовательностью TAATCAATCGG (Seq. no. 33) (N_dif=2 и N_ref=8) (подчеркивание показывает оптимальную выверку, а жирный шрифт выделяет два неидентичных остатка из 8).

Термины "случайно" или "случайный" применительно к сцеплению относятся к сцеплению нуклеотидных последовательностей, который не были выделены из одной и той же клетки, но поперечно сцеплены в популяции генетически различных клеток. Если представляющие интерес нуклеотидные последовательности являются кодирующими последовательностями вариабельных областей, то это приведет к комбинаторной библиотеке сцепленных последовательностей. C другой стороны, если представляющие интерес нуклеотидные последовательности кодируют не имеющий разнообразия гетеромерный белок, то случайно сцепленные последовательности окажутся подобными сцепленным последовательностям из единичной клетки.

Термин "матрица, полученная из выделенной единичной клетки", применительно к обратной транскрипции, относится к нуклеиновым кислотам, находящимся внутри такой выделенной клетки. Например, нуклеиновые кислоты могут быть в виде РНК, мРНК, ДНК или геномной ДНК. Нуклеиновые кислоты либо могут быть выделенными из клетки, либо по-прежнему сохранять связь с остальным содержимым клетки, причем клетка может быть как в интактном виде, так и в лизированном виде.

Термин "CD43" относится к поверхностному клеточному антигену мыши, известному под многими синонимическими названиями, включая антиген 3E8, A630014B01 Rik, антиген дифференциации B-клеток LP-3, Cd43, антиген CD43, Galgp, лейкоцитарный сиалогликопротеин, лейкосиалин, предшественник лейкосиалина, Ly48, Ly-48, сиалофорин, а также к ортологичным поверхностным маркерам клеток других животных.

Термин "CD138" относится к поверхностному клеточному антигену мыши, известному под многими синонимическими названиями, включая Syndecan-1, AA408134, AA409076, CD138, syn-1, Synd, Synd1, SYND1, Synd-1, предшественник Syndecan-1, а также к ортологичным поверхностным маркерам клеток других животных.

Термин "MHCII" относится к поверхностному клеточному антигену мыши, известному под многими синонимическими названиями, включая антиген CD74, CLIP, DHLAG, гамма-цепь антигена гистосовместимости класса H-2 II, HLADG, HLA-DR-GAMMA, инвариантная цепь, ассоциированная с антигеном Ia, Ia-GAMMA, Ii, инвариантная цепь, ассоциированная с MHC класса II, а также к ортологичным поверхностным маркерам клеток других животных. Термин "B220" относится к поверхностному клеточному антигену мыши, известному под многими синонимическими названиями, включая Cd45, CD45, антиген CD45, CD45R, L-CA, общий предшественник лейкоцитарного антигена, loc, Ly-5, общий лимфоцитарный антиген Ly-5, Lyt-4, T200, а также к ортологичным поверхностным маркерам клеток других животных.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Процесс амплификации и сцепления

Одной из особенностей настоящего изобретения является уменьшение числа пробирок, необходимых для амплификации представляющих интерес нуклеотидных последовательностей, с применением варианта PCR, в котором две или более целевые последовательности подвергаются одновременной амплификации в одной пробирке при участии более одного набора праймеров, например всех праймеров, необходимых для амплификации кодирующих последовательностей вариабельных областей, в одной реакции. В общем смысле этот подход известен как мультиплексная полимеразная цепная реакция (мультиплексная PCR).

Следующая особенность настоящего изобретения заключается в том, что две или более целевые последовательности, амплифицированные в мультиплексной PCR, становятся сцепленными в непосредственной близости в результате процесса амплификации. Особенно важно, что в этом процессе происходит сцепление кодирующих последовательностей вариабельных областей.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения использует то обстоятельство, что можно сконструировать мультиплексную смесь праймеров, работающую в процедуре PCR перекрывания-удлинения, что приводит к одновременной амплификации и сцеплению представляющих интерес нуклеотидных последовательностей. Эта методика мультиплексной PCR перекрывания-удлинения способствует уменьшению числа реакций, необходимых для выделения и сцепления представляющих интерес нуклеотидных последовательностей, в особенности когнатных пар сцепленных вариабельных областей. Другие варианты осуществления настоящего изобретения ориентированы на сцепление посредством лигирования или рекомбинации в качестве альтернативы сцеплению посредством мультиплексной PCR перекрывания-удлинения. В этих процедурах сцепление осуществляется не одновременно с мультиплексной PCR, а представляет собой самостоятельную стадию, непосредственно следующую за амплификацией. Однако сцепление по-прежнему можно осуществлять в той же пробирке, в которой проводилась мультиплексная PCR.

Мультиплексная PCR перекрывания-удлинения требует присутствия двух или более наборов праймеров (мультиплексной смеси праймеров), причем, по меньшей мере, один праймер в каждом наборе оснащен хвостом перекрывания-удлинения. Хвосты перекрывания-удлинения позволяют осуществить сцепление продуктов, генерированных каждым набором праймеров во время амплификации. Такую смесь праймеров называют мультиплексной смесью праймеров перекрывания-удлинения. Мультиплексная PCR перекрывания-удлинения отличается от обычной PCR перекрывания-удлинения тем, что последовательности, подлежащие сцеплению, генерируются одновременно в одной и той же пробирке, что обеспечивает немедленное сцепление целевых последовательностей в ходе амплификации без какой-либо промежуточной очистки.

Следующей особенностью настоящего изобретения является стадия обратной транскрипции (RT), предшествующий мультиплексной PCR или амплификации в мультиплексной PCR перекрывания-удлинения, с использованием матрицы, полученной из выделенной единичной клетки или популяции изогенных клеток.

Следующей особенностью настоящего изобретения является применение нуклеотидных последовательностей, происходящих из выделенной единичной клетки или популяции изогенных клеток, в качестве матрицы для амплификации в мультиплексной PCR. Предпочтительно, чтобы перед проведением мультиплексной PCR была осуществлена обратная транскрипция РНК в кДНК. Для амплификации некоторых представляющих интерес последовательностей нуклеиновых кислот в качестве альтернативы мРНК можно использовать геномную ДНК. Используя в качестве матрицы выделенные единичные клетки или популяцию изогенных клеток, полученную посредством клональной экспансии из выделенной единичной клетки, можно избежать перемешивания нуклеотидных последовательностей, кодирующих представляющий интерес гетеродимерный белок, с нуклеотидными последовательностями, извлеченными из разных клеток, входящих в популяцию клеток. Это важно, если задачей является получение начальной композиции представляющих интерес последовательностей. Особенно важной отличительной особенностью изобретения является применение выделенной единичной клетки или популяции изогенных клеток в качестве матрицы для генерирования когнатной пары кодирующих последовательностей вариабельных областей.

В дополнение к этому настоящее изобретение облегчает создание библиотек представляющих интерес сцепленных последовательностей нуклеиновой кислоты в виде специальных комбинаторных библиотек и библиотек когнатных пар вариабельных областей. Далее, настоящее изобретение использует нуклеиновые кислоты, извлеченные из единичных клеток, предпочтитель