Семена трансгенных растений с повышенным содержанием лизина

Семена трансгенных растений с повышенным содержанием лизина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Испрашиваемый приоритет

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США с серийным номером 60/723178, поданной 3 октября 2005 г. и полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

1. Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем описании раскрыты ДНК-конструкции, пригодные для получения трансгенных растений с частями, имеющими повышенное содержание лизина, а также способы использования таких ДНК-конструкций для получения трансгенных растений и семян, собранных с растений материалов, а также муки и пищевых продуктов, получаемых из вышеперечисленного сырья. Такие ДНК-конструкции пригодны для получения трансгенных растений повышенной пищевой ценности, обусловленной повышением накопления лизина в семенах. Также раскрыты полинуклеотидные молекулы и способы, пригодные для получения трансгенных растений с повышенным содержанием лизина в семенах.

2. Описание уровня техники

Zea mays, обычно называемая маисом или кукурузой, представляет собой зерновую культуру, широко используемую в качестве пищи для человека и животного корма. Зерно, в настоящем описании называемое также семенами, является источником белка, крахмала и масла для многих низших животных, в том числе для свиней, мясного и молочного скота, рыбы и домашней птицы. В некоторых странах, таких как Мексика, более 70% собранной кукурузы потребляется людьми и кукуруза и получаемые из нее продукты, такие как мамалыга и плоские маисовые лепешки, являются пищевыми продуктами массового потребления. Основная часть аминокислотного состава зерна определяется количеством и типом аминокислот, содержащихся в полипептидах. Только относительно небольшая часть, до 10%, доступных аминокислот в зерне находится в виде свободных аминокислот; остальные содержатся в различных белках. Большинство полипептидов кукурузы, находящихся в зерне, являются запасными белками семян, или зеинами. Эти запасные белки семян синтезируются в ходе развития зерна и используются в качестве источника энергии в ходе прорастания и роста последнего. Однако эти запасные белки семян содержат мало лизина либо вообще не содержат этой аминокислоты. Из десяти аминокислот, которые считаются незаменимыми в смешанных зерновых кормах (аргинин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин или цистеин, фенилаланин или тирозин, треонин, триптофан и валин), не только лизин, но также треонин и метионин практически отсутствуют в кукурузном зерне. Нехватка этих незаменимых аминокислот, в особенности лизина, требует добавления этих питательных веществ к пищевому кукурузному зерну, что часто достигается путем дополнительного введения соевой муки или синтетического лизина. Увеличение содержания лизина в семенах кукурузы с целью повышения питательной ценности последних в качестве пищи или кормового зерна может быть полезным в данной области техники. Дополнительное преимущество может быть реализовано в том случае, если к зерну нужно будет добавлять лишь малые количества лизина либо не добавлять его вообще.

В отношении питания человека имеет место плохая тенденция к употреблению пищи, относительно богатой недорогими крахмалосодержащими продуктами и относительно бедной высококачественным белком. Квашиоркор (детская пеллагра) - форма нарушения питания, вызванная потреблением белков неадекватного качества при общей высокой энергетической ценности (общей калорийности) потребляемой пищи. Ранние симптомы являются очень общими и включают усталость, раздражительность и сонливость. При продолжительном дефиците белка наблюдается отставание в росте, потеря мышечной массы, генерализированный отек (эдема) и снижение иммунитета. Обычным является вздутие живота. Часто наблюдаются кожные проявления (такие, как дерматит, изменение пигментации, истончение волос и витилиго). Смерти предшествуют шок и кома. Согласно одной из правительственных оценок не менее 50% пожилых людей в домах престарелых США страдают от нарушения питания, связанного с низким уровнем белковой калорийности пищи. Таким образом, продукты, полученные из кукурузы с улучшенным в силу повышенного содержания лизина качеством белкового состава, могли бы значительно улучшить не только питательную ценность пищевых продуктов, но и общий уровень здоровья.

Молекулярно-биологический подход к повышению содержания лизина включает идентификацию и введение в кукурузу генов с целью оказания воздействия на содержание лизина в зерне, не сопровождающегося отрицательным воздействием на агрономические свойства. Лизин продуцируется из аспартата, метаболизм которого, в свою очередь, взаимно связан с биохимическими путями, в которых участвуют треонин, метионин и изолейцин. Сам лизин служит конечным продуктом, модифицирующим и регулирующим ферменты, принимающие участие в его собственном биосинтезе. Ключевыми ферментами, принимающими участие в метаболизме лизина, являются аспартаткиназа (AK) и дигидродипиколинатсинтаза (DHDPS), в то время как лизинкетоглутаратредуктаза (LKR, бифункциональный фермент, также известный как сахаропиндегидрогеназа, SDH), по-видимому, играет ключевую роль в катаболизме лизина. AK и DHDPS формируют петлю обратной связи, регулируемую лизином; по мере повышения содержания лизина он подавляет активность этих ферментов.

Таким образом, для повышения содержания лизина предпочтительно оперировать с вариантами AK или DHDPS, нечувствительными к обратной связи. Были описаны нечувствительные к лизину варианты бактериального, а также растительного генов AK (см. Falco с соавторами, патент США № 5773691, включенный в настоящее описание посредством ссылки). Нечувствительные к лизину формы AK были идентифицированы в ячмене, кукурузе и табаке. Было показано, что бактериальный ген DHDPS, выделенный из E.coli, по меньшей мере в 20 раз менее чувствителен к повышению содержания лизина (Glassman с соавторами, патент США № 5258300; Galili c соавторами, патент США № 5367110).

В публикациях Falcо с соавторами (патенты США № 5773691 и 6459019, публикация заявки на патент США № 2003/0056242) и Dizigan с соавторами (патентная публикация № 2005/0132437), каждая из которых полностью включена в настоящее описание посредством ссылки, описано выделение и использование нечувствительной к лизинопосредованной обратной связи аспартаткиназы (ген AK, известный как lysС) из E.coli, DHDPS из E.coli, а также DHDPS из Corynebacterium (известный и обозначаемый в настоящем описании как CORgl.dapА), для получения трансгенных растений - рапса, табака, кукурузы и сои с повышенным содержанием лизина в семенах.

Настоящее изобретение относится к ДНК-конструкциям, которые, будучи экспрессированными в растительных клетках, обеспечивают повышение питательной ценности растений, в частности повышенное содержание лизина в семенах растения.

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к ДНК-конструкциям, которые при функционировании в геноме трансгенного растения обеспечивают повышение содержания лизина в семени растения. Собранные семена с высоким содержанием лизина могут быть полезны для производства пищевой и кормовой продукции, такой как кукурузная мука (в том числе мука, известная как «маса харина»), кукурузная мука и мучные изделия, в которые нужно добавлять лишь небольшие количества лизина либо не нужно добавлять его вообще. Предпочтительно трансгенное растение и семя представляет собой растение и зерно сельскохозяйственных культур, предпочтительно - однодольное растение и семя и наиболее предпочтительно - семя и растение кукурузы.

Настоящее изобретение относится к содержащим ДНК-конструкции трансгенным растениям и семенам с повышенным содержанием лизина в семени. ДНК-конструкции по настоящему изобретению включают молекулу, которая, будучи экспрессированной в клетках кукурузы, ингибирует продукцию лизиндеградирующего полипептида, а также молекулу, которая, будучи экспрессированной в клетках кукурузы, обеспечивает продукцию нечувствительных к лизину полипептида дигидродипиколинатсинтазы и аспартаткиназы.

Даже в том случае, если собранное зерно является нежизнеспособным и, таким образом, не может быть использовано в качестве семян, оно тем не менее содержит повышенное содержание лизина и характеризуется повышенным качеством белка согласно настоящему изобретению. Подобное собранное зерно может быть переработано тем же образом, что и обычное зерно. Соответственно, в другом воплощении настоящее изобретение относится к корму для животных с повышенным содержанием лизина, получаемому путем выращивания трансгенного растения по настоящему изобретению и сбора семян с повышенным содержанием лизина или путем переработки по настоящему изобретению либо их части. В другом воплощении настоящее изобретение относится к муке или мучным изделиям, получаемым путем выращивания трансгенного растения по настоящему изобретению и сбора семян с повышенным содержанием лизина или путем переработки семян по настоящему изобретению либо их части.

В одном из воплощений настоящего изобретения ДНК-конструкция включает новые полинуклеотидные композиции, усовершенствованные для экспрессии в растительных клетках, особенно в клетках кукурузы. Один из новых полинуклеотидов (SEQ ID NO:5) кодирует полипептид дигидродипиколинатсинтазы, другой новый полинуклеотид (SEQ ID NO:9) является гомологичным и комплементарным части полинуклеотидной последовательности, кодирующей лизинкетоглутаратредуктазу. Экспрессия этой ДНК-конструкции в растительной клетке, особенно в клетке кукурузы, предпочтительно в клетке кукурузного семени, приводит к повышению содержания лизина в кукурузном семени. ДНК-конструкция включает полинуклеотиды, например такую последовательность, как SEQ ID NO:1, кодирующую нечувствительную к лизину дигидродипиколинатсинтазу, а также такую последовательность, как SEQ ID NO:2, кодирующую лизинкетоглутаратредуктазу и используемую в качестве матрицы для конструирования ингибиторных молекул РНК, либо такую последовательность, как SEQ ID NO:3, кодирующую аспартаткиназу. ДНК-конструкция предпочтительно содержит молекулу промотора, усовершенствованную для управления транскрипцией функционально связанного полинуклеотида в семени кукурузы. Помимо этого ДНК-конструкция может содержать новую молекулу ДНК (SEQ ID NO:10), содержащую молекулу для подавления гена, мишенью которой является ген лизинкетоглутаратредуктазы, где молекула, подавляющая ген, помещена в интрон ДНК-конструкции.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к способу получения кукурузного семени с повышенным содержанием лизина посредством скрещивания инбредных родительских растений с последующим получением гибридных семян, при котором каждое из родительских растений содержит в своем геноме одну или несколько ДНК-конструкций, составляющих предмет настоящего изобретения, в составе кассет для экспрессии в растениях, причем в каждом из родительских растений экспрессионные кассеты различны и ни одно из родительских растений не содержит всех трех; а также последующим сбором семян, имеющих содержание лизина выше, чем в каждом из родительских растений.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к способу получения продуктов питания человека или кормовых продуктов для животных, содержащих повышенное содержание лизина, включающему стадию переработки семян или их части, полученных из трансгенных растений, геном которых содержит экзогенную ДНК-конструкцию или набор конструкций согласно настоящему изобретению. Помимо этого настоящее изобретение относится к способу получения продуктов питания человека или кормовых продуктов для животных, имеющих повышенное содержание лизина, включающему стадию выращивания трансгенного растения с последующим получением семян, геном которых содержит экзогенную ДНК-конструкцию по настоящему изобретению, с последующим сбором семян.

Краткое описание графического материала

Фиг.1. Карта плазмиды pMON66649.

Фиг.2. Карта плазмиды pMON80003.

Фиг.3. Карта плазмиды pMON79465.

Фиг.4. Карта плазмиды pMON93092.

Фиг.5. Карта плазмиды pMON93093.

Фиг.6. Карта плазмиды pMON80378.

Фиг.7. Содержание свободного лизина в зернах, полученных из объектов, содержащих pMON93092.

Фиг.8. Содержание свободного лизина в зернах, полученных из объектов, содержащих pMON93093.

Подробное описание изобретения

Трансгенное растение или семя, проявляющее желаемое свойство, например повышенное содержание лизина по изобретению, содержит специфическую экзогенную ДНК, встроенную в геном трансгенного растения и обуславливающую наличие желаемого свойства. Данное свойство может быть выражено как измеряемое изменение природного свойства контрольного растения, например растения или семени практически того же генотипа, лишенного специфической экзогенной ДНК. Предпочтительно изменение оценивается путем сопоставления количественного выражения данного свойства в трансгенном растении или семени, имеющем специфическую экзогенную ДНК, и количественного выражения того же свойства в контрольном растении или семени. Таким образом «маис с повышенным содержанием лизина» представляет собой растение кукурузы (маиса) с повышенным содержанием лизина в любой части растения, предпочтительно в семенах, которые в настоящем описании также могут быть названы зерном (в том числе и в агрегированной форме). Настоящее изобретение относится к ДНК-конструкциям и семенам, содержащим в своем геноме по крайней мере одну из ДНК-конструкций в составе кассет, экспрессии в растениях по настоящему изобретению, а также характеризующимся повышенным содержанием лизина по сравнению с семенами, не содержащими конструкции.

Повышенное содержание лизина может проявляться растением путем накопления повышенных количеств данной аминокислоты в зерне и может быть измерено при помощи любого подходящего способа, такого как масс-спектрофотометрия или высокоэффективная жидкостная хроматография подходящим образом полученного тканевого экстракта. Трансгенное кукурузное зерно с повышенным содержанием лизина по настоящему изобретению особенно полезно в качестве пищевого продукта или корма, а также муки или мучных изделий, в качестве сырья для получения очищенных кукурузных белковых продуктов либо в качестве сырья для получения других продуктов, получаемых из зерна, содержащего повышенное содержание лизина по сравнению с нетрансгенным зерном подобного сорта.

Общее содержание лизина в кукурузном зерне, составляющее примерно 4000 частей на миллион (ppm), является достаточным для того, чтобы в получаемые из этого зерна пищевые продукты или корма не нужно было добавлять лизин из дополнительных источников. Продукция и накопление лизина в кукурузе с повышенным содержанием этой аминокислоты по настоящему изобретению достигает вышеуказанного уровня. Настоящее изобретение относится к способам и композициям, значительно улучшенным по сравнению с ранее описанными способами и композициями для повышения содержания лизина в кукурузном зерне (см., например, патент США № 5773691).

Способы повышения содержания аминокислот в трансгенных растениях включают экспрессию рекомбинантных молекул ДНК, кодирующих белки, вовлеченные в пути синтеза аминокислот, на более высоком уровне по сравнению с экспрессией нативных генов. Одним из способов повышения содержания лизина в кукурузе является экспрессия бактериальной дигидродипиколинатсинтазы (DHDPS) согласно раскрытому в патентах США № 5288300, 6459019, а также в публикации патентной заявки США № 2003/0056242А1, и подавление эндогенной LKR (публикация патентной заявки США № 2005/0193444); каждая из вышеприведенных в данном абзаце публикаций полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

Любое из растений или их частей по настоящему изобретению может быть переработано для получения корма, муки тонкого и грубого помола, белковых продуктов или масла. Особенно предпочтительной для этих целей частью растений является семя. В одном из предпочтительных воплощений настоящего изобретения корм, мука тонкого и грубого помола, белковые продукты или масло используются для кормления сельскохозяйственных животных (скота). Способы получения корма, муки тонкого и грубого помола, белковых продуктов или масла известны в данной области техники, см., например, патенты США № 4957748, 5100679, 5219596, 5936069, 6005076, 6146669 и 6156227, полностью включенных в настоящее описание посредством ссылки. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения белковые продукты представляют собой продукты с высоким содержанием белка, такие как концентраты или изоляты. Продукт с высоким содержанием белка имеет содержание белка, превышающее 5% масс./об., предпочтительно более 10% масс./об., еще более предпочтительно 15% масс./об.

В другом воплощении мука по настоящему изобретению может быть смешана с другими мучными продуктами. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения мука, полученная из растений или семян по настоящему изобретению либо при помощи способа по настоящему изобретению составляет более чем примерно 0,5%, примерно 1%, примерно 5%, примерно 10%, примерно 25%, примерно 50%, примерно 75% или примерно 95% по объему или массе мучного компонента любого продукта. В другом воплощении настоящего изобретения мучной продукт может быть смешан и составлять более примерно 10%, более примерно 25%, более примерно 35%, более примерно 50% или более примерно 75% от смеси по объему. Настоящее изобретение также относится к способу усиления интенсивности роста человека или низшего животного, включающему употребление человеком или низшим животным пищи, по крайней мере часть которой представляет собой кукурузу с высоким содержанием лизина, содержащую одну или несколько кассет, для экспрессии в растениях по настоящему изобретению. В настоящем описании термин «низшие животные» относится к птицам, рыбам, а также млекопитающим.

Рекомбинантные ДНК-конструкции

Настоящее изобретение относится к ДНК-конструкциям, содержащим функционально связанные полинуклеотиды, способные обеспечить повышенное содержание лизина в зернах кукурузы. Термин «ДНК-конструкция» включает без ограничения полинуклеотидные молекулы, которые управляют транскрипцией связанных полинуклеотидных молекул в клетке растения. По меньшей мере часть ДНК-конструкции по настоящему изобретению может использоваться в способе трансформации растительной клетки, что подразумевает стабильное встраивание этой части ДНК-конструкции в геном данной клетки. Эта часть обуславливает наличие фенотипа, характеризующегося высоким содержанием лизина в зернах кукурузы или мучных продуктах, изготовленных из таких зерен, и является аспектом настоящего изобретения. ДНК-конструкции pMON93092 и pMON09093 были депонированы Monsanto Technology LLC согласно Будапештскому соглашению в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номерами доступа PTA-6733 и PTA-6734 соответственно. Данные депозиты составляют часть раскрытия настоящего изобретения, и, хотя последовательности, приведенные в настоящем письменном раскрытии, по мнению авторов, являются точными, при необходимости полинуклеотидные последовательности молекул ДНК, содержащие регуляторные элементы, кодирующие и некодирующие молекулы, могут быть определены при помощи этих депозитов и использованы для коррекции последовательностей, раскрытых в настоящем изобретении.

Полинуклеотидные молекулы связаны в рекомбинантных ДНК-конструкциях при помощи способов, известных специалистам в данной области. Примером пригодной технологии создания ДНК-конструкций может служить технология клонирования GATEWAY™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California), в которой применяется сайт-специфичная реакция клонирования LR-рекомбиназы в системе Integrase/att бактериофага лямбда для создания векторной конструкции без использования эндонуклеаз и лигаз. В руководстве по использованию технологии клонирования GATEWAY™ компании Invitrogen также приводятся четкие инструкции по стандартному клонированию любого желаемого полинуклеотида в вектор, содержащий действующие элементы для экспрессии в клетках растений. Дополнительные способы раскрыты в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3-е издание, тома 1, 2 и 3. J.F. Sambrook, D.W. Russell и N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000 (в настоящем тексте ссылки на данный источник приводятся как «Sambrook с соавторами»).

Используемый в настоящем описании термин «экзогенная ДНК или выделенная ДНК» относится к молекуле ДНК, которая в норме не присутствует в геноме клетки-хозяина, или же к ДНК, которая в норме не присутствует в геноме клетки-хозяина в идентичном контексте, или же к двум связанным прилегающим друг к другу последовательностям, которые в норме или в природе не связаны друг с другом. Экзогенная ДНК может включать полинуклеотидную молекулу ДНК или РНК, которая является нативной для генома клетки-хозяина, или же может содержать нативный полинуклеотид, измененный путем присоединения или делеции одного или нескольких полинуклеотидов или же путем модификаций регуляторных элементов ассоциированного полинуклеотида или другой полинуклеотидной последовательности согласно описанному в настоящем описании. В дополнение к регуляторным элементам экзогенная ДНК может содержать кодирующую последовательность, продуктом которой является белок или полипептид, или же некодирующую последовательность, продуктом которой является небелковый продукт, такой как, например, молекула РНК, оказывающая влияние на транскрипцию или трансляцию другой последовательности ДНК. ДНК-конструкция по настоящему изобретению содержит кодирующую и некодирующую последовательности.

Используемые для трансформации растительных клеток экзогенные ДНК-конструкции содержат представляющую интерес кодирующую последовательность, а также обычно другие регуляторные элементы согласно описанному в настоящем описании, такие как (без ограничения) промоторы, интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые области, лидерные последовательности, последовательности сигналов локализации и транзитных сигналов, а также энхансеры, функциональное соединение которых обуславливает экспрессию РНК в клетках растений. Подобные ДНК-конструкции в контексте настоящего изобретения называются кассетами для гетерологичной экспрессии в растениях. ДНК-конструкции, перечисленные в таблице 1, иллюстрируют связи регуляторных элементов в экспрессионных кассетах, которые экспрессируют кодирующие и некодирующие последовательности; помимо этого также указан средний уровень лизина в трансгенных семенах маиса, содержащих каждую конструкцию. Примерами молекул промоторов ДНК экзогенной ДНК-конструкции по настоящему изобретению могут служить промоторы, усиливаемые в семени или семяспецифические промоторы, включающие, например, промоторы, используемые в однодольных сельскохозяйственных культурах, такие как кукурузный L3-промотор (промотор, описанный в патенте США № 6433252, включенном в настоящее описание посредством ссылки, или его гомологи; в контексте настоящего изобретения - P-Zm.L3), кукурузный B32-промотор (последовательность SEQ ID NO:4 или ее гомологи; в контексте настоящего изобретения - P-Zm.B32), промотор кукурузного гамма-коиксина (промотор, описанный в патенте США № 6635806, включенном в настоящее описание посредством ссылки, или его гомологи; в контексте настоящего изобретения - P-Zm.Gcx), а также любой из промоторов, используемых в ДНК-конструкциях по настоящему изобретению, либо другие промоторы, индуцирующие повышенную транскрипцию в семенах кукурузы; все подобные промоторы в контексте настоящего изобретения обозначаются как P-Zm.seed. Примеры дополнительных промоторов, функционирующих в семенах, включают без ограничения промоторы, индуцирующие экспрессию запасных белков семян, таких как рисовый глутелин и проламиновые белки Triticeae, а также промоторы, контролирующие экспрессию ферментов, вовлеченных в синтез крахмала в семени, таких как промоторы, активирующие экспрессию АДФ-глюкоза-крахмал-гликозилтрансферазы однодольных растений. Выбранный промотор семени функционально связан с кодирующей областью гена DHDPS (например, последовательность SEQ ID NO:1, в контексте настоящего изобретения обозначаемая как CORgl.dapA) либо с кодирующей областью гена аспартаткиназы (например, последовательность SEQ ID NO:3). Дополнительные промоторы, усиливаемые в семени, или семяспецифические промоторы, известны в данной области и могут быть выбраны и протестированы в функциональной связи с кодирующими и некодирующими молекулами ДНК по настоящему изобретению при помощи способов, описанных в контексте настоящего изобретения, либо подобных способов, известных специалистам в области молекулярной биологии растений. Промотор, усиливаемый в семени, первично экспрессируется во всем семени или его части, хотя может быть вторично экспрессирован в других клетках, тканях или органах растения. Части семени включают без ограничения зародыш, эндосперм, семенную оболочку, колеоптиль, семядолю, подсемядольное колено, алейроновый слой, перикарпий и скутеллум. Дополнительные регуляторные элементы, содержащиеся в ДНК-конструкциях, включают без ограничения интрон (I-), транзитные сигналы (TS-), 5'-нетранслируемые лидерные последовательности (L-), 3'-области полиаденилирования (T-) или некодирующие антисмысловые области. Также могут быть включены экспрессионные кассеты, содержащие селектируемый или количественно оцениваемый маркер для селекции или идентификации трансформированных растительных клеток и тканей. Конструкция по настоящему изобретению необязательно содержит экспрессионную кассету, которая придает кукурузному растению устойчивость к глифосату и может быть использована в качестве селектируемого маркера. Используемый в настоящем описании термин «трансген» относится к экзогенной ДНК, встроенной в геном хозяина или способной к автономной репликации в клетке-хозяине, экспрессирующей один или несколько клеточных продуктов. При помощи подобных трансгенов можно получить клетку-хозяина, получаемые из нее растения или части этих растений с новым по сравнению с нетрансформированной клеткой или растением фенотипом, например с повышенным содержанием лизина в кукурузном зерне. Трансгены могут быть непосредственно введены в растения при помощи генетической трансформации и предпочтительно являются стабильными и наследуемыми таким образом, что они могут быть унаследованы от растений любого предыдущего поколения, которые были трансформированы экзогенной ДНК.

Используемый в настоящем описании термин «ген» или «кодирующая последовательность» относится к молекуле ДНК, с которой транскрибируется молекула РНК. Молекула ДНК содержит область (CR-), кодирующую мРНК, которая, в свою очередь, кодирует белковый продукт, либо РНК, которая функционирует как молекула, подавляющая ген, либо структурные молекулы РНК, такие как тРНК, рРНК, snРНК либо другие молекулы РНК. Используемый в настоящем описании термин «экспрессия» относится к комбинации внутриклеточных процессов, включающих транскрипцию и трансляцию, при помощи которых молекула ДНК, такая как ген, продуцирует полипептид или молекулу РНК. Примером кодирующей последовательности является ген дигидродипиколинатсинтазы Corynebacterium (DHDPS; Bonnassie с соавторами, 1990; Richaud с соавторами, 1986), пригодный для получения кукурузных зерен с повышенным содержанием лизина. Кукурузное растение, трансформированное таким образом, что оно содержит и экспрессирует ген DHDPS Corynebacterium или любой другой ген, экспрессия которого приводит к повышению содержания лизина в ткани зерна, в контексте настоящего изобретения также называется кукурузным растением с повышенным содержанием лизина. Кодирующая область гена DHDPS Corynebacterium согласно настоящему изобретению дополнительно модифицируется для повышения экспрессии в растительных клетках, предпочтительно в клетках однодольных растений и наиболее предпочтительно в клетках кукурузы. Модифицированная кодирующая область гена DHDPS Corynebacterium, используемая в контексте настоящего изобретения, соответствует последовательности SEQ ID NO:5, обозначаемой в настоящем описании как CORgl.dapA.nno.

Используемый в настоящем описании термин «промотор» относится к области последовательности ДНК, инициирующей транскрипцию РНК с ДНК. Промоторы расположены с 5'-конца смысловой цепи транскрибируемой молекулы ДНК и содержат области, служащие в качестве сайтов связывания для РНК-полимеразы, а также области, вовлеченные во взаимодействия с другими факторами, индуцирующими транскрипцию РНК. Более конкретно, базальные промоторы растений содержат канонические области, ассоциированные с инициацией транскрипции, такие как CAAT- и TATA-боксы. В контексте настоящего изобретения предпочтительные молекулы промоторов и 5'-нетранслируемые молекулы индуцируют транскрипцию в клетках семян или тканей на более высоком уровне, чем в других клетках или тканях растения. Молекулы промоторов могут быть выбраны из числа молекул, известных в данной области, например из промоторов, описанных в патенте США № 6437217 (кукурузный RS81-промотор), в патенте США № 5641876 (промотор рисового актина), в патенте США № 6426446 (кукурузный RS324-промотор), в патенте США № 6429362 (кукурузный PR-1-промотор), в патенте США № 6232526 (кукурузный A3-промотор), в патенте США № 6177611 (конститутивный кукурузный промотор), в патентах США № 5322938, 5352605, 5359142 и 5530196 (35S-промотор), в патенте США № 6433252 (кукурузный L3-промотор олеозина, P-Zm.L3), в патенте США № 6429357 (промотор рисового актина 2, а также интрон рисового актина 2), в патенте США № 5837848 (специфичный для корней промотор), в патенте США № 6294714 (светоиндуцируемый промотор), в патенте США № 6140078 (солеиндуцируемый промотор), в патенте США № 6252138 (патоген-индуцируемый промотор), в патенте США № 6175060 (промотор, индуцируемый недостатком фосфора), в патенте США № 6635806 (промотор гамма-коиксина, P-Cl.Gcx) и в патентной заявке США № 09/757089 (промотор хлоропластной альдолазы кукурузы); все вышеперечисленные публикации включены в настоящее описание посредством ссылки. Помимо этого могут быть сконструированы химерные промоторные молекулы, содержащие цис-элементы, полученные из гетерологичных источников, которые дополнительно улучшают экспрессионный профиль промотора, используемого в контексте настоящего изобретения. Например, было показано, что элементы промоторов растительных вирусов повышают эффективность промоторных элементов растений, функционально связанных вирусными промоторами (патент США № 6660911, полностью включенный в настоящее описание посредством ссылки).

Помимо промотора ДНК-конструкции, используемые для трансформации растений, обычно также содержат другие регуляторные элементы, такие как, без ограничения, 3'-нетранслируемые области (содержащие сайты полиаденилирования), транзитные или сигнальные пептиды для направления белка в определенные клеточные органеллы растений, в частности в хлоропласты, лейкопласты и другие пластидные органеллы.

Специалистам в данной области известны различные интроны, энхансеры, транзитные пептиды, нацеливающие сигнальные последовательности. 5'- и 3'-нетранслируемые области (UTR), полезные для конструирования эффективных векторов для экспрессии в растениях, подобных раскрытым, например, в публикации патентной заявки США № 2003/01403641 (включенной в настоящее описание посредством ссылки).

5'-UTR, функционирующий как трансляционная лидерная последовательность, представляет собой генетический ДНК-элемент, локализованный между промоторной и кодирующей последовательностями гена. Трансляционная лидерная последовательность присутствует в полностью процессированной мРНК с 5'-конца от последовательности начала трансляции. Трансляционная лидерная последовательность может оказывать влияние на процессинг первичного транскрипта в мРНК либо на стабильность мРНК или эффективность трансляции. Примеры трансляционных лидерных последовательностей включают лидерные последовательности генов белков теплового шока кукурузы и петуньи (патент США № 5362865), лидерные последовательности генов оболочечных белков вирусов растений, лидерные последовательности растительных генов рибулозабисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Rubisco) и т.д. (Turner и Foster, 1995). Примерами лидерных молекул, в естественном контексте ассоциированных с промоторными молекулами, описанными в контексте настоящего изобретения, могут служить лидерная последовательность B32 кукурузы (L-Zm.B32), лидерная последовательность рисового актина 1 (L-Os.Act1) и лидерная последовательность гамма-коиксина (L-Cl.Gcx).

3'-нетранслируемая область (3' UTR) или 3'-область полиаденилирования представляет собой молекулу ДНК, связанную со структурной полинуклеотидной молекулой и локализованную с 3'-конца от последней, и содержит полинуклеотиды, содержащие сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, влияющие на транскрипцию, процессинг мРНК или экспрессию генов. Функция сигнала полиаденилирования в растениях состоит в запуске полиаденилирования, т.е. добавления полиаденилатнуклеотида к 3'-концу предшественника мРНК. Последовательность полиаденилирования может быть получена из природного гена, из множества растительных генов либо из Т-ДНК генов агробактерий. Примерами 3'-UTR могут служить 3'-область нопалинсинтазы (nos 3'; Fraley с соавторами, 1983), 3'-UTR-последовательности гена hsp17 пшеницы (T-Ta.Hsp17) и T-Ps.RbcS2:E9 (малая субъединица рибулозабисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (rubisco) гороха), 3'-UTR-последовательности, раскрытые в патенте № WO0011200A2, а также другие известные в данной области техники 3'-UTR-последовательности, которые могут быть протестированы и использованы в комбинации с кодирующими областями DHDPS или AK и в настоящем описании обозначаются как T-3'UTR.

Под термином «транзитные сигналы» в целом понимают пептидные молекулы, которые, будучи связанными с представляющим интерес белком, направляют последний в ту или иную ткань, клетку, внутриклеточный компартмент или клеточную органеллу. Примеры подобных пептидов включают без ограничения хлоропласт-транзитные пептиды, сигналы ядерной локализации и вакуолярные сигналы. В контексте настоящего изобретения особо применимыми являются пластид-транзитные пептиды, направляющие экспрессию фермента DHDPS в пластиды клеток семян. Хлоропласт-транзитный пептид (CTP) может быть получен в виде химерной конструкции, в которой CTP слит с N-концом белка, предназначенного для транспорта в хлоропласты. Множество белков, локализованных в хлоропластах, экспрессируются ядерными генами в виде предшественников и далее направляются в хлоропласты за счет CTP, удаляемого в ходе процессов, связанных с импортом белка в хлоропласты. Примеры хлоропластных белков включают малую субъединицу (RbcS2) рибулоза-1,5-бисфосфат-карбоксилаза, ферредоксин, ферредоксин-оксидоредуктаза, белки 1 и 2 светособирающего комплекса и тиоредоксин F. Было продемонстрировано, как in vivo, так и in vitro, что нехлоропластные белки могут быть перенаправлены в хлоропласты путем использования химерных CTP-слитых белков, а также что наличие CTP является достаточным условием для направления белка в хлоропласты. Было показано, что встраивание подходящего хлоропласт-транзитного пептида, такого как CTP генов EPSPS Arabidopsis thaliana (Klee с соавторами, 1987) и Petunia hybridа (della-Cioppa с соавторами, 1986), приводит к направлению гетерологичных белков в хлоропласты трансгенных растений. CTP гена DapA Zea mays (SEQ ID NO:6, в настоящем описании обозначаемая как TS-Zm.DapA) согласно настоящему изобретению может быть применен для направления связанного с ним полипептида DHDPS в пластиды семян. Специалистам в данной области будет понятно, что могут быть получены различные химерные конструкции, в которых используется функциональность специфического CTP для импорта гетерологичного полипептида DHDPS в пластиды растительной клетки. Описание использования хлоропласт-транзитных пептидов приведено в патенте США № 5188642, полностью включенном в настоящее описание посредством ссылки.

В таблице 1 приведены комбинации промоторов и других регуляторных элементов, функционально связанных с молекулами, подавляющими ген LKR, и с кодирующими молекулами DHDPS, а также соответствующие эффекты в отношении содержания лизина в растениях и зернах кукурузы. Специалисту в данной области будет ясно, что экзогенн