Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб

Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб

Реферат

Изобретение относится к рыбной промышленности и может использоваться при искусственном воспроизводстве ценных видов рыб, в частности осетровых, а также для создания криобанков с образцами генетического материала.

Известен способ замораживания ооцитов и эмбрионов крупного рогатого скота (см. ст. Троицкий П.А. Замораживание ооцит-кумулюсных комплексов коров в витрификационном растворе с различной концентрацией криопротекторов. //Сб. ВИЖ «Актуальные проблемы биологии и воспроизводства», Дубовицы Быково, 2007. - С.122-124).

Однако этот способ не обеспечивает высокой выживаемости яйцеклеток осетровых рыб, так как предусматривает использование протекторов, содержащих большее количество воды, которое не приемлемо для ооцитов рыб.

Прототип предлагаемого способа не выявлен.

Техническая задача - создание способа криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб, обеспечивающего выживаемость половых клеток после двойного температурного шока.

Технический результат - повышение качества дефростированных яйцеклеток осетровых рыб.

Он достигается тем, что в качестве протекторов используют смесь подсолнечного масла и рыбьего жира в соотношении 1:1 при скорости замораживания 1500°С, оттаивание образцов осуществляют в дистиллированной воде при температуре 42-45°С в течение 45-75 секунд до достижения жидкой фракции.

Использование смеси подсолнечного масла и рыбьего жира в соотношении 1:1 обеспечивает выживаемость дефростированных яйцеклеток рыб. Икринки с овариальной жидкостью обволакиваются смесью масел, предохраняя ее от действия воды, которая запускает дробление икры и делает процесс криоконсервации невозможным.

Скорость замораживания также имеет определяющее значение. Ступенчатые методы замораживания в данном случае не оказывают защитного действия на клетки. Поэтому использовали сверхвысокие скорости заморозки - 1500°С/мин.

Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб осуществляется следующим образом.

Пример 1. Работы по криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб проводили в Отделе аквакультуры и водных биоресурсов Южного научного центра РАН. Биологический материал заготавливали на осетровых рыбоводных заводах Астраханской области (Сергиевский, Житнинский, Александровский). Объектом исследований служила неоплодотворенная икра белуги, русского осетра, стерляди и бестера.

Перед началом работ всю необходимую посуду, икру, протекторы охлаждали до температуры 10-15°С. К охлажденной икре добавляли протекторную среду в соотношении 1:1. Процесс эквилибрации продолжался в течение 1,5 часов при температуре 14-18°С.

Замораживание проводили в ампулах Эпендорфа, объемом 1,5 и 2 мл. Количество икринок в ампуле в зависимости от вида рыб составляло от 40 до 60 шт.

Оттаивание образцов осуществляли в дистиллированной воде при температуре 42-45°С. Время отогрева до достижения жидкой фракции составляло 45-75 секунд.

Для осуществления контроля за выживаемостью яйцеклеток после оттаивания икринки отмывали в естественной воде при нерестовых температурах (14-18°С) и оплодотворяли спермой. Оплодотворение осуществляли в чашках Петри. Количество спермы рассчитывали в соответствии с рыбоводными нормативами, время оплодотворения - не более 5 минут. После оплодотворения икру не обесклеивали (методика Коханской Е.М., 1980), что удобно при экспериментировании на малых количествах материала, и через 15 минут (после появления клейкости) регистрировали количество приклеенных к дну чашки Петри икринок в процентах.

В качестве контрольного образца использовали икру от тех же особей, при аналогичных манипуляциях без обработки смесью жиров. Всего реализовано по 10 опытов на икре белуги, русского осетра, стерляди и бестера. Результаты опытов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Результаты криоконсервации спермы осетровых рыб с применением нового способа
Вид рыб	Выживаемость икринок, %
контроль	опыт
Белуга	0	85
Русский осетр	0	75
Стерлядь	0	86
Бестер (гибрид первого поколения)	0	50

В результате использования нового способа криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб удалось получить от 50 до 85% живых дефростированных клеток.

Способ криоконсервации яйцеклеток осетровых рыб, включающий обработку протекторными растворами, эквилибрацию, замораживание, оттаивание, отличающийся тем, что эквилибрацию осуществляют в течение 1,5 ч при температуре 14-18°С, а в качестве протектора используют смесь подсолнечного масла и рыбьего жира в соотношении 1:1 при скорости замораживания 1500°С/мин, оттаивание образцов осуществляют в дистиллированной воде при температуре 42-45°С в течение 45-75 с до достижения жидкой фракции.