Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk)

Антитела, связывающиеся с внеклеточным доменом тирозинкиназного рецептора (alk)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Заявка заявляет приоритет предварительной заявки US №60/795831, зарегистрированной 28 апреля 2006 г., все содержание которой включено сюда посредством ссылки.

Содержание всех патентов, патентных заявок и ссылок, процитированных по ходу настоящей заявки, включено сюда полностью посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителу, специфичному к ALK человека (киназе анапластической лимфомы), в частности к scFv, к кодирующей его последовательности нуклеиновой кислоты, его получению и применению в качестве медикамента или с диагностическими целями. Упомянутое антитело применимо для местного лечения опухолей или рака, в частности глиобластомы.

Уровень техники

ALK (киназа анапластической лимфомы, CD246) является членом семейства рецепторов тирозинкиназы (RTK). Как типичный представитель этого семейства она является трансмембранным белком типа I, в основном состоящим из трех доменов: внеклеточного домена, связывающего лиганд (аминокислотные остатки 19-1038), который содержит домен LDL-рецептора класса А и два домена МАМ (МАМ: меприн, А5 антиген протеиновая тирозинфосфатаза µ), трансмембранного домена (аминокислотные остатки 1039-1059) и цитоплазматического домена (аминокислотные остатки 1060-1620), содержащего домен тирозинкиназы. На N-конце образующегося белка присутствует сигнальный пептид (аминокислотные остатки 1-18), который отщепляется при секреции.

Полноцепочечные ALK мыши и человека были клонированы в 1997 г. двумя независимыми группами (Iwahara 1997; Morris 1997). ALK обладает высоким сходством с RTK, называемым лейкоцитарной тирозинкиназой (LTK) и принадлежит сверхсемейству рецепторов инсулина. ALK проявляет 57% идентичности аминокислотной последовательности и 71% сходства аминокислотной последовательности с LTK в районах их перекрывания (Morris 2001). ALK обладает высокой степенью N-гликозилирования и содержит 21 предполагаемый участок N-гликозилирования. Аминокислотные остатки от 687 до 1034 обладают значительным сходством (50% идентичности) с LTK. Однако проксимальная N-концу последовательность из 686 аминокислот не демонстрирует никакой гомологии ни с одним известным белком за исключением очень короткой последовательности, обнаруженной также в рецепторе LDL (Duyster 2001/SWISSPROT). Дополнительно, она содержит два домена МАМ в виде аминокислотных последовательностей 264-427 и 478-636 (меприн, А5 антиген протеиновая тирозинфосфатаза µ). Считается, что эти домены обладают функцией адгезии, поскольку они широко распространены среди различных белков адгезии, задействованных в межклеточном взаимодействии (De Juan 2002). Дополнительно, имеется участок связывания предполагаемых лигандов ALK, соответствующий аминокислотной последовательности 396-406 (Stoica 2001; см. ниже). Аминокислотная последовательность киназного домена мышиной ALK демонстрирует 98% идентичность аминокислотной последовательности человеческой ALK, 78% идентичность аминокислотной последовательности мышиной LTK, 52% идентичность аминокислотной последовательности мышиной ros, 47% идентичность аминокислотной последовательности рецептору инсулиноподобного ростового фактора человека и 46% идентичность аминокислотной последовательности инсулинового рецептора человека (Iwahara 1997; Ladanyi 2000). Никакие сплайсинг-варианты ALK не были описаны до сих пор. Однако ALK часто связывают с хромосомными транслокациями (см. ниже).

Ген ALK занимает около 315 кб и включает 16 экзонов. Большая часть гена состоит из двух больших интронов, охватывающих около 170 кб. Транскрипт ALK составляет 6,5 кб в длину (Kutok 2002). Согласно Morris кДНК составляет 6226 пар оснований (Morris 2001).

Экспрессия ALK у мышей начинается во время эмбриогенеза примерно на стадии развития Е11, сохраняется в неонатальном периоде развития, где он экспрессируется в нервной системе. У взрослых его физиологическая экспрессия ограничена определенными нейрональными районами ЦНС (нервными и глиальными клетками и, вероятно, эндотелиальными клетками) на низком уровне (Morris 1997; Duyster 2001; Stoica 2001). Действительно, распространенность ALK в постнатальном периоде падает (Morris 2001). На основе образца (распределения) его экспрессии сделано предположение о роли рецептора в развитии головного мозга (Duyster 2001). Ограниченная нервной системой экспрессия ALK предполагает, что он служит рецептором нейротрофных факторов (см. далее). В согласии с этим образец его экспрессии перекрывается с генами, кодирующими семейство нейротрофиновых рецепторов TRK (Morris 2001). Однако мыши, несущие нокаут ALK, не проявляют какого-либо определенного фенотипа (неопубликованные данные), что может быть обусловлено некоторой функциональной избыточностью членов семейства TRK или других нейротрофиновых рецепторов. Следует отметить, что гематопоэтические ткани не показывают никакого различимого уровня экспрессии ALK (см. ниже) (Morris 2001).

Недавно описаны два потенциальных лиганда ALK «плейотрофин» (PTN) и «мидкин» (МК) (Stoica 2001; Duyster 2001; Stoica 2002). Взаимодействие между PTN и ALK идентифицировано с помощью очищенного белка плейотрофина человека для скрининга пептидной библиотеки фагового дисплея. С помощью такого способа была идентифицирована последовательность, присутствующая во внеклеточном домене ALK (аминокислотные остатки 396-406). Важно, что эта последовательность не является общей с LTK, являющейся RTK наиболее близкородственной ALK. Этот район связывания лиганда также является консервативным у потенциального гомолога ALK у Drosophila (Loren 2001). ALK быстро фосфорилируется при связывании PTN (Bowden 2002). Дополнительно, показано, что ALK стимулируется плейотрофином в культуре клеток. Это делает взаимодействие плейотрофина с ALK особенно интересным в свете участия плейотрофина в патологических процессах (Stoica 2001). Клеточные линии, лишенные экспрессии ALK, неспособны проявлять ростовой ответ на плейотрофин и vice versa (Stoica 2001). In vivo повышенные уровни плейотрофина показаны в сыворотке крови больных, страдающих различными солидными опухолями, и исследования на животных указывают на вклад плейотрофина в рост опухолей (Stoica 2002). Роль PTN в качестве лимитирующего скорость ангиогенного фактора при росте опухолей хорошо установлена на животных моделях (Choudhuri 1997). В 1996 г. Czubayko et al. (Czubayko 1996) показали важность PTN в ангиогенезе опухолей при предотвращении апоптоза и при метастазах путем модуляции уровней PTN с помощью направленного применения рибозимов. Уровни PTN в сыворотке крови мышей показали четкую корреляцию с размером опухолей. PTN играет значительную роль в ряде наиболее агрессивных типов рака человека, таких как меланома и рак поджелудочной железы, предоставляя таким образом интересные перспективы для возможных дальнейших применений ингибитора ALK (Weber 2000; Stoica 2001). Среди больных людей повышенные уровни плейотрофина в сыворотке крови обнаружены у больных раком поджелудочной железы (n=41; Р<0,0001) и раком кишечника (n=65; Р=0,0079). У здоровых индивидуумов PTN экспрессируется строго регулируемым образом во время перинатального развития органов и в выборочных популяциях нейронов и глии у взрослых.

Наличие совместной экспрессии PTN и ALK, как обнаружено у некоторых раковых клеточных линий, указывает на то, что они могут образовывать аутокринную петлю ростовой стимуляции (Stoica 2001). Несмотря на все эти данные из литературы следует, что неясно, является ли действие PTN опосредованным одним ALK и/или другими неидентифицированными рецепторами PTN (Duyster 2001). Предложены, по меньшей мере, два других потенциальных рецептора PTN: рецептор тирозинфосфатазы RPTPβ и гепаринсульфат протеогликан N-синдекан. Однако RPTPβ может действовать как модулятор сигнала в PTN/ALK пути передачи сигнала и N-синдекан может действовать в качестве шаперона лиганда (Bowden 2002).

Недавно в качестве второго лиганда ALK был идентифицирован другой секретируемый ростовой фактор, родственный плейотрофину, называемый мидкином (МК). Сходным с PTN способом связывающую и активирующую функции МК (например, индукцию колониеобразования на мягком агаре в культуре клеток) можно блокировать тем же антителом, выработанным против ALK-ECD (Stoica 2001). Подобно плейотрофину, мидкин регулируется на повышение во многих опухолях, хотя его физиологическая экспрессия в нормальных тканях взрослых очень ограничена (Stoica 2002). Анализ 47 образцов опухоли мочевого пузыря выявил, что экспрессия МК значительно повышена (примерно в четыре раза) по сравнению с нормальной тканью мочевого пузыря. Дополнительно, заметная сверхэкспрессия коррелирует с плохой выживаемостью больных (O'Brien 1996).

Однако сродство МК к ALK примерно в пять раз ниже, чем сродство плейотрофина (Stoica 2002). Интересно, что, как и в случае плейотрофина, ингибирование ALK рибозимами также ингибирует воздействия МК на клеточную культуру (Stoica 2002). Авторы этих исследований также пришли к заключению, что ингибирование пути PTK/MK/ALK открывает очень привлекательные возможности для лечения различных заболеваний, у некоторых из которых пока что возможности лечения очень ограничены, например глиобластомы и рака поджелудочной железы (Stoica 2002).

У здоровых индивидуумов экспрессия мРНК ALK достигает пика во время неонатального периода и сохраняется у взрослых в нескольких избранных разделах нервной системы. Недавно экспрессию белка ALK обнаружили также в эндотелиальных клетках, связанных с нейрональными и глиальными клетками. Доказательство того, что, по крайней мере, часть злокачественных активностей, описанных для плейотрофина, опосредована ALK, получено в опытах, в которых экспрессию ALK сводят на нет с помощью направленного применения рибозима.

Такое истощение ALK предотвращало стимулированное плейотрофином фосфорилирование противоапоптозного белка Akt и приводило к продлению жизни мышей, получивших ксенотрансплантаты. Действительно, количество апоптозных клеток в трансплантатах опухоли значительно повышено при подавлении экспрессии ALK (Powers 2002).

Доказательство того, что злокачественные активности, описанные для МК, опосредованы ALK, получено в экспериментах с моноклональными антителами против ALK ECD. Добавление супернатанта клеток гибридомы с двумя антителами против ALK ECD при разведении 1:25 приводит к значительному уменьшению колониеобразования клетками SW-13 в мягком агаре (Stoica 2002). Анализ десяти различных клеточных линий выявил, что способность к ростовому ответу на PTN отлично коррелирует с экспрессией мРНК ALK (обнаружено, что следующие клеточные линии, отвечавшие на PTN, экспрессируют мРНК ALK: HUVEC, NTH3T3, SW-13, Colo357, МЕ-180, U87, MD-MB 231; Stoica 2001). Интересно, что у некоторых раковых клеточных линий (Colo357 рак поджелудочной железы, Hs578T рак груди и U87 глиобластома) PTN и ALK экспрессируются совместно, указывая на то, что PTN и ALK образуют аутокринную петлю стимуляции роста (Stoica 2001).

Интересно то, что показано, что оба PTN и МК вызывают транскрипционную регуляцию на повышение противоапоптозного белка bcl-2 (Stoica 2002). Дополнительно, активированный Akt (который является важной нижерасположенной мишенью аберрантной передачи сигнала ALK) фосфорилирует проапоптозный фактор, называемый bad, приводя, таким образом, к диссоциации bcl-xl, который, будучи свободным от bad, может подавлять апоптоз путем блокирования высвобождения цитохрома с (см. ссылки в Bowden 2002).

Аберрантная экспрессия ALK может быть вовлечена в развитие нескольких типов рака. Однако первоначально ее связывали с подгруппой высокозлокачественных неходжкинских лимфом (NHL), так называемых анапластических крупноклеточных лимфом (ALCL). Неходжкинские лимфомы представляют клональные неоплазии, развивающиеся из различных клеток лимфатического происхождения.

У большинства больных с первичным системным клиническим подтипом ALCL имеется транслокация t2,5, приводящая к экспрессии составного белка, соединяющего N-конец нуклеофосмина (NPM) с С-концом ALK. Составной белок состоит из аминокислотных остатков 1-117 NPM, присоединенных к аминокислотным остаткам 1058-1620 ALK, и хромосомный разрыв находится в интроне, расположенном между экзонами, кодирующими ТМ и околомембранный домен ALK (Duyster 2001). NPM-ALK является продуктом транскрипции, содержащим открытую рамку считывания из 2040 пар оснований, кодирующих белок из 680 аминокислотных остатков (Morris 2001). Это соответствует разрыву в интроне 4 NPM, который охватывает 911 пар оснований, и в интроне 16 ALK, который охватывает 2094 пар оснований (Kutok 2002). Скорее всего, последовательность ALK в этом составном белке является минимальной последовательностью, необходимой, чтобы белок приводил к ALCL (Duyster 2001). Инверсированный составной белок (ALK-NPM) не экспрессируется, по крайней мере, в лимфоидных клетках (Kutok 2002). Белок NPM дикого типа характеризуется повсеместной экспрессией и функционирует в качестве переносчика белков из цитоплазмы в ядро. Фактически NPM является ядерным белком размером 38 кДа, кодируемым хромосомой 5, который содержит NLS, связывает ядерные белки и участвует в передвижении цитоплазма/ядро (Duyster 2001). NPM является одним из наиболее распространенных ядерных белков и обычно присутствует в виде гексамера (Morris 2001). Наиболее важно то, что NPM обычно претерпевает самоолигогмеризацию (гексамеры), а также гетерогенную олигомеризацию с NPM-ALK (Duyster 2001). Транслокация 2;5 помещает часть гена ALK, кодирующую тирозинкиназу на хромосоме 2 под контроль сильного промотора NPM на хромосоме 5, что приводит к постоянной экспрессии химерного белка NPM-ALK (p80) (Duyster 2001). Поэтому ALK киназа является нерегулируемой и эктопической как в плане клеточного цикла (лимфоидного), так и клеточного компартмента (ядро/ядрышко и цитоплазма) (Ladanyi 2000). Локализация NPM (питоплазматическая или ядерная), по всей видимости, не влияет на его действие на генез лимфом (Duyster 2001). Возникающая аберрантная тирозинкиназная активность запускает злокачественное перерождение через конститутивное фосфорилирование внутриклеточных мишеней. Разные другие менее распространенные составные белки с ALK также связаны с ALCL. Все варианты показывают связь тирозинкиназного домена ALK с альтернативным промотором, регулирующим его экспрессию.

Показано, что полноцепочечная ALK также экспрессируется примерно в 92% клеток первичной нейробластомы и в некоторых рабдомиосаркомах (Lamant 2000). Однако до сих пор не было показано какой-либо корреляции между экспрессией ALK и биологией опухоли. Этот факт, взятый вместе с отсутствием доказательства в отношении значительных уровней эндогенно фосфорилированной ALK в этих опухолях, предполагает, что экспрессия ALK в нейробластоме отражает ее обычную экспрессию в незрелых нейрональных клетках, а не первичную онкогенную роль, и ALK в этих опухолях не является фосфорилированным конститутивно, таким образом ставя под вопрос важность роли ALK в этих опухолях (Duyster 2001; PuIford 2001). Тем не менее, передача сигнала ALK может быть важной, по меньшей мере, в некоторых нейробластомах, как предполагают Miyake et al., которые обнаружили сверхэкспрессию и конститутивное фосфорилирование ALK благодаря генной амплификации в клеточных линиях, выведенных из нейробластомы (Miyake 2002). Однако другие клеточные линии, выведенные из нейробластомы, не показывают конститутивной активации ALK, выступая, таким образом, против основного участия ALK в патологии (Dirks 2002; PuIford 2004).

Интереснее всего, что ALK кажется важным для роста глиобластомы многоформной, очень злокачественной опухоли мозга, предоставляющей очень ограниченные возможности для терапии (Powers 2002). Показано, что в этих разрушительных опухолях происходят множественные генетические изменения, включая утрату или мутации PTEN, р53 и INK4a-ARF. Дополнительно, передача сигнала RTK играет особенно важную роль в росте и развитии этих опухолей, которые сверхэкспрессируют различные ростовые факторы, например PDGF, HGF, NGF и VBGF, что указывает на наличие аутокринных петель сигнала RTK. Powers и соавторы показали экспрессию мРНК и белков ALK в образцах опухоли больных глиобластомой, тогда как такие сигналы не детектировались в нормальных смежных тканях головного мозга (Powers 2002). Дополнительно, клетки глиобластомы человека U87MG (полученные от больного и представляющие хорошо охарактеризованную модельную систему для исследования генезиса опухолей и передачи сигнала в глиобластоме) демонстрируют ALK-зависимое противоалоптозное поведение в исследовании с применением ксенотрансплантата. Когда ALK подавлен в этих раковых клетках с помощью рибозимов, мыши, которым инъецировали такие опухолевые клетки, выживают, по меньшей мере, в два раза дольше, чем мыши, которым инъецировали опухолевые клетки дикого типа, и такие опухолевые клетки демонстрируют значительно повышенный апоптоз. Таким образом, ALK и его лиганды предоставляют важный сигнал выживания, который является лимитирующим скорость роста опухолевых клеток U87MG in vivo (Powers 2002). Эти данные указывают, что ингибирование передачи сигнала ALK может быть многообещающим подходом для улучшения прогноза продолжительности жизни больных глиобластомой.

Глиобластома многоформная с большим отрывом является наиболее распространенной и злокачественной первичной глиальной опухолью с количеством случаев примерно 2/100000 в год (примерно 15000 случаев в US и Западной Европе в год). Она преимущественно поражает полушария головного мозга, но может также поразить ствол мозга (в основном у детей) или спинной мозг. Опухоли могут появляться de novo (первичная глиобластома) или могут развиваться из астроцитом более низкой степени (вторичная глиобластома). Первичные и вторичные глиобластомы демонстрируют небольшое молекулярное перекрывание и на молекулярном уровне представляют собой различные заболевания. Они обе содержат много генетических отклонений, включая изменения р53, EGFR, MDM2, PDGF, PTEN, p16, RB.

Никаких значительных достижений терапии не достигнуто за последние 25 лет. Терапии являются только паллиативными и могут продлевать прогноз жизни от 3 месяцев до одного года. Больные обычно проявляют медленно прогрессирующий неврологический дефицит, например слабость моторики, симптомы внутричерепного давления, например головная боль, головокружение, дурнота, рвота, когнитивные нарушения или припадки. Изменения личности также могут быть ранними симптомами. Этиология глиобластомы неизвестна, семейные случаи представляют менее 1%. Единственным реальным идентифицированным фактором риска является контакт с бензиновыми соединениями. Диагноз обычно ставят с помощью исследования изображений мозга (СТ, ЯМР) и биопсии. Полное определение стадии большинства глиобластом не является ни практическим, ни возможным, поскольку у этих опухолей нет ясно определенных границ. Скорее они проявляют хорошо известные тенденции к местной инвазии и распространению по путям плотного белого вещества. Первичной причиной того, почему невозможно лечение до исцеления больного, является то, что опухоль находится за пределами местного контроля при диагностике. Первичными химиотерапевтическими агентами являются кармустин (алкилирующий агент) и цисплатина, но только 40% больных до некоторой степени реагируют на лечение.

Хотя имеются известные неопределенности относительно роли ALK в глиобластомах, это заболевание предлагает различные подходы для направленных на ALK лекарств. Фактически для этой разрушительной болезни даже небольшое улучшение возможностей имеющейся на настоящее время терапии сослужит огромную службу потребностям медицины. Важно заметить, что, поскольку клетки глиобластомы экспрессируют полноцепочечный ALK, для лечения этого рака можно считать ALK мишенью не только для небольших молекул ингибиторов киназы, но также для антител и/или фрагментов антител, например scFv, т.е. для индукции апоптоза в клетках опухоли. Строго ограниченная локализация глиобластомы в ЦНС способствует применению scFv, поскольку их можно эффективно доставлять в ЦНС (быстрый клиренс отсутствует из-за компартментализации, но имеется лучшее проникновение в опухоль по сравнению с IgG из-за их меньшего размера). Антитела и/или фрагменты антител можно направлять против связывающей лиганд последовательности ALK (аминокислотные остатки 396-406) или против других областей внеклеточной части рецептора.

Очень ограниченная экспрессия ALK в здоровых тканях при физиологических условиях указывает, что опухоли, экспрессирующие ALK, могут быть превосходными мишенями при лечении болезни с применением радиоактивных или связанных с токсином антител и/или фрагментов антител независимо от того, является ли ALK вовлеченным в патогенез этих опухолей или нет. В дополнение к клеткам глиобластомы экспрессия ALK с высокой значимостью обнаружена в клеточных линиях меланомы и клеточных линиях карциномы груди (где она не является конститутивно фосфорилированной) (Dirks 2002). Тот факт, что большая часть внеклеточного домена ALK представляется довольно уникальной в протеоме человека, должно сделать этот подход высокоспецифичным.

WO 9515331/US 5529925 раскрывает клонирование и секвенирование последовательностей нуклеиновых кислот человека, которые подвергаются перегруппировке при хромосомной перестановке t(2;5) (p23;q35), происходящей в лимфоме человека. Обнаружено, что перестановка перемещает последовательность гена ядерного фосфопротеина (гена NPM) на хромосоме 5q35 к последовательности ранее не идентифицированного гена тирозинкиназы (здесь и далее гена ALK) на хромосоме 2р23. Последовательность составного гена и составного белка (составного гена и белка NPM/ALK соответственно) также раскрыты.

Полная последовательность ALK запатентована в US 5770421, названном "Human ALK Protein Tyrosine Kinase." Дополнительно, патент US 6174674 В1 "Method of detecting a chromosomal rearrangement involving a breakpoint in the ALK or WPM gene" раскрывает праймеры для детектирования слитой (составной) последовательности NPM-ALK в образцах, полученных от больных. В другой патентной заявке US 6696548 "ALK protein tyrosine kinase/receptor and ligands thereof" раскрыто применение ALK для детектирования лигандов ALK и связывание антител со специфическими последовательностями ALK. Раскрыт также способ идентификации агента, способного связываться с выделенным полипептидом ALK.

WO 0196394/US 20020034768 раскрывают роль ALK в качестве рецептора плейотрофина. US 20040234519 раскрывает антитела против плейотрофина, и WO 2006020684 описывает определение плейотрофина.

Раскрытие изобретения

Основным объектом изобретения является предоставление стабильного и растворимого антитела или производного антитела, которое связывается с человеческим белком ALK in vitro и in vivo. Наиболее предпочтительно антитело является специфически направленным против связывающего лиганд домена ALK (аминокислотные остатки 396-406) и в этой связи блокирует как биологическое действие МК, имеющие K_D для ALK приблизительно 170 пМ, так и биологическое действие PTN, имеющего K_D для ALK примерно 20-30 пМ (Stoica 2002; Stoica 2001). В предпочтительном осуществлении упомянутое антитело или фрагмент антитела является scFv антителом или Fab фрагментом. Далее термин антитело включает полноцепочечные антитела, а также производные антитела.

Теперь, для того чтобы выполнить эти и дополнительные объекты изобретения, которые прояснятся при прочтении описания, упомянутое антитело характеризуется тем, что оно включает CDR3 вариабельного района тяжелой цепи с последовательностью, имеющей, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности SEQ. ID. NO:2. Предпочтительно идентичность последовательности составляет, по меньшей мере, 60%, 65%, 75%, 85% или более, предпочтительно, по меньшей мере, 92%. Наиболее предпочтительно упомянутое антитело имеет CDR3 V_H с последовательностью SEQ. ID. NO:2.

В одном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть согласно изобретению специфически связывается с конкретным эпитопом белка ALK. Такие аминокислотные остатки эпитопа находятся, например, среди аминокислотных последовательностей 1-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-900, 900-1000, 1000-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500 или 1500-1620 белка ALK или их любых интервалов, частей или отрезков. В одном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, включающим, в основном состоящим, или фрагментом района, охватывающего аминокислотные остатки 391±3 и 406±3 (SEQ. ID No:91 показывает аминокислотные остатки от 388 до 409 человеческого белка ALK), предпочтительно аминокислотные остатки 391-406 (SEQ. ID. No:1) белка ALK (SEQ ID NO:1). Понятно, что указанные отрезки не следует рассматривать как отрезки, имеющие резкие границы, но что антитело или его связывающая антиген часть может связываться или частично связываться с районом, расположенным близко или находящимся внутри связывающего лиганд домена ALK. Предпочтительно антитела или производные антител связываются с эпитопом белка ALK из 10-20 аминокислотных остатков в длину.

В другом осуществлении антитело или его связывающая антиген часть может характеризоваться как специфически связывающаяся с белком ALK с K_D менее примерно 10×10^-6 М. В конкретном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связываются с белком ALK (иди его фрагментом) с K_D, по меньшей мере, примерно 10×10^-7 М, по меньшей мере, примерно 10×10^-8 М, по меньшей мере, примерно 10×10^-9 М, по меньшей мере, примерно 10×10^-10 М, по меньшей мере, примерно 10×10^-11 М, по меньшей мере, примерно 10×10^-12 М или с еще более благоприятной K_D.

В других различных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает вариабельный район тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района тяжелой цепи согласно SEQ ID NO:4.

В других осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает вариабельный район легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района легкой цепи согласно SEQ ID NO:5.

В других дополнительных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть включает как вариабельный район тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района тяжелой цепи согласно SEQ ID NO:4, так и вариабельный район легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности аминокислотной последовательности вариабельного района легкой цепи согласно SEQ ID NO:5.

В других конкретных осуществлениях антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, связывающимся с антителом или производным антитела ESBA521 (SEQ. ID. NO:19) и/или конкурирует за связывание белка ALK или его части с антителом или производным антитела ESBA521. В родственном осуществлении антитело или его связывающая антиген часть специфически связывается с эпитопом, включающим остатки 391-406 (SEQ ID NO:1) белка ALK или его частью.

Вариабельные районы тяжелой и легкой цепей антител или их связывающие антиген части обычно включает один или более район, определяющий комплементарность (CDR). Такие районы включают CDR1, CDR2 и CDR3. В конкретных осуществлениях CDR вариабельных районов тяжелой цепи имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR антитела ESBA521. В других конкретных осуществлениях CDR вариабельных районов легкой цепи имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.

Соответственно, конкретное антитело или фрагмент согласно изобретению включает вариабельный район тяжелой цепи, включающий один или более район, определяющий комплементарность (CDR), представляющий, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района тяжелой цепи ESBA521 и вариабельный район легкой цепи, включающий один или более район, определяющий комплементарность (CDR), представляющий, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.

Вариабельный район тяжелой цепи антитела или его связывающая антиген часть может также включать все три CDR, представляющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района тяжелой цепи ESBA521 и/или все три CDR, представляющие, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно 100% идентичности CDR вариабельного района легкой цепи антитела ESBA521.

В другом осуществлении изобретения антитела или их связывающие антиген части (а) включают вариабельный район тяжелой цепи, кодируемый или полученный из (т.е. являющийся продуктом) человеческого гена V_H (например, Н3 типа), и/или (б) включает вариабельный район легкой цепи, кодируемый или полученный из человеческого гена V κ или λ (например, λ1 типа).

Антитела согласно настоящему изобретению включают полноцепочечные антитела, например моноклональные антитела, включающие эффекторный домен (например, Fc домен), а также части или фрагменты антител, например одноцепочечные антитела и Fab фрагменты. Антитела также могут быть связаны с различными терапевтическими агентами (например, противораковыми агентами, химиотерапевтическими агентами или токсинами) и/или с меткой (например, радиоактивной меткой).

В другом аспекте изобретение представляет выделенные нуклеиновые кислоты, включающие последовательность, кодирующую вариабельный район тяжелой цепи антитела, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности SEQ ID NO:22. Изобретение также представляет выделенные нуклеиновые кислоты, включающие последовательность, кодирующую вариабельный район легкой цепи антитела, имеющую, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности SEQ ID NO:21.

Изобретение также представляет экспрессирующие векторы, включающие любую из вышеупомянутых нуклеиновых кислот саму по себе или в комбинации (например, экспрессируемую с помощью одного или более векторов), а также клетки хозяина, включающие такие экспрессирующие векторы.

Подходящие клетки хозяина для экспрессии антител согласно изобретению включают разнообразные эукариотические клетки, например клетки дрожжей, клетки млекопитающих, например клетки яичника китайского хомяка (СНО), NSO клетки, клетки миеломы или растительные клетки. Молекулы согласно изобретению могут также экспрессироваться в клетках прокариотов, например Е.coli.

Изобретение также представляет способы получения антител или их связывающих антиген частей путем экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, в клетках хозяина (например, нуклеиновые кислоты, кодирующие связывающий антиген район антитела). В дополнительном аспекте изобретение представляет гибридому или трансфектому, включающую вышеупомянутые нуклеиновые кислоты.

В другом осуществлении изобретение предоставляет антиген, включающий эпитоп белка ALK, предпочтительно домен связывания лиганда PTN, более предпочтительно фрагмент, включающий, в основном состоящий, или фрагмент района, охватывающий аминокислотные остатки 391±3 и 406±3 (see SEQ. ID No:91, которая показывает аминокислотные остатки от 388 до 409 человеческого белка ALK), наиболее предпочтительно аминокислотные остатки 391-406 (SEQ. ID. No:1). Антиген можно применять для выработки, скрининга или детектирования присутствия антитела против ALK или можно применять в качестве агента для активной иммунотерапии, например вакцины.

В качестве вакцины антиген может применяться сам по себе или в комбинации с подходящим вспомогательным средством или гаптеном, например в смеси или в химическом или генетическом конъюгате. Антиген, применяемый для активной иммунотерапии, можно также применять в комбинации с пассивной иммунотерапией, например с любым из антител против ALK, раскрытых здесь, или в комбинации с моноклональным или поликлональным препаратом антител против ALK, например гаммаглобулином серопозитивного донора.

В другом осуществлении молекулы антитела (или связывающие районы V_L и V_H) являются целиком человеческими. Лечение человека человеческими антителами дает ряд преимуществ. Например, антитела с большой вероятностью являются менее иммуногенными для людей, чем антитела, не относящиеся к человеку. Терапия также является быстрой, потому что инактивация ALK может произойти, как только антитело достигает области рака (где экспрессируется ALK). Поэтому в родственном осуществлении антитело является scFv, например ESBA521 или антителом, включающим V_L и/или V_H районы (или их CDR, например CDR3 V_L (SEQ ID NO:3) и/или CDR3 V_H (SEQ ID NO:2)) ESBA521.

Человеческие антитела также локализуются на нужных участках организма человека более эффективно, чем антитела нечеловеческого происхождения. Дополнительно, лечение является специфическим для ALK, антитело является рекомбинантным и высокоочищенным, и в отличие от традиционных терапий данный подход свободен от возможного загрязнения случайными агентами. Альтернативно, антитела и производные антител согласно настоящему изобретению можно получать путем химического синтеза.

В другом осуществлении изобретение представляет композиции для лечения рака (или получения соответствующих медикаментов), которые могут предотвращать неоплазию у субъекта путем конкурирования с лигандами ALK, например мидкином (МК) и/или плейотрофином (PTN), и таким образом блокирования передачи сигнала ALK, опосредованного такими лигандами. Такую композиции можно вводить саму по себе или в комбинации с известными в данной области техники противораковыми агентами, например метотриксатом и т.п.

Антитело согласно изобретению и/или вакцину ALK можно применять сами по себе или в сочетании с известными терапевтическими, например, противораковыми агентами, например метотриксатом и т.п.

Другие свойства и преимущества изобретения будут ясны из нижеследующего детального описания, а также из формулы изобретения.

Краткое описание фигур

Изобретение станет более понятным и дополнительные его объекты, отличные от вышеописанных, будут очевидны при рассмотрении нижеследующего детального описания. Это описание обращается к приложенным фигурам, где:

Фигура 1 показывает схему применяемого белка ALK человека. Пептид из 16 аминокислотных остатков участка связывания PTN (пунктирная линия) применяют в качестве эпитопа в двухгибридном скрининге связывателей scFv.

Фигура 2 показывает ступенчатую рандомизацию частей CDR3 V_H, CDR3 V_L и CDR2 V_H для получения ESBA521 в качестве вторичного связывателя и набора scFv в качестве третичных связывателей (см. табл.1). Х означает любой аминокислотный остаток.

Фигура 3 показывает эксперимент с применением ELISA, где характеристики связывания улучшенных scFv сравнивают с таковыми окружения (каркаса), из которого они происходят.

Фигура 4 показывает иммуноокрашивание клеток HeLa, подвергнутых переходной трансфекции ESBA521 (левая панель) и поликлональными антителами, специфичными к ALK (правая панель). Средняя панель: те же клетки в световом микроскопе.

Фигура 5 показывает эксперимент с применением ELISA для проведения сравнения ESBA521 с улучшенными третичными связывателями.

Осуществление изобретения

Для облегчения понимания изобретения следует вначале пояснить конкретные термины.

Определения

Термин «ALK» и «AIk-I»включает белок ALK человека, кодируемый геном ALK (киназа анапластической лимфомы), который является мембранным белком тирозинкиназы/рецептора.

Термин «антитело» относится к целым антителам и любому фрагменту, связывающему антиген (например, «связывающей антиген части», «связывающему антиген полипептиду» или «иммуносвязывателю»), или его одиночной цепи. «Антитело» относится к гликопротеину, включающему, по меньшей мере, две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), взаимосвязанные дисульфидными мостиками, или их связывающую антиген часть. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного района тяжелой цепи (сокращенно V_H) и константного района тяжелой цепи. Константный район тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного района легкой цепи (сокращенно V_L) и константного района легкой цепи. Константный райо