Снижение содержания белковых примесей в композициях, содержащих интересующий витамин к-зависимый белок

Снижение содержания белковых примесей в композициях, содержащих интересующий витамин к-зависимый белок

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям витамин К-зависимых белков, имеющим очень низкое или пренебрежимо малое содержание белков-контаминантов. Настоящее изобретение также относится к способу, пригодному в приготовлении таких композиций витамин К-зависимых белков. Такие способы можно применять как по одному, так и в последовательной комбинации с целью уменьшения относительного содержания белков-контаминантов. Настоящее изобретение имеет значение особенно в приготовлении композиций факторов свертывания крови, выбранных из полипептидов фактора Х (FX/FXa), полипептидов фактора IX (FIX/FIXa), полипептидов фактора VII (FVII/FVIIa) и антикоагулирующего белка С, в частности полипептидов фактора VII.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

При получении рекомбинантных белков из культур микроорганизмов или клеточных линий конечная стадия получения представляет собой выделение и возможно концентрацию представляющего интерес продукта. Культуральная среда, в которой выращены клетки и которая содержит секретируемые белки, и, в частности, клеточные лизаты, содержащие внутриклеточные белки, представляющие интерес, также содержат в большей или меньшей степени другие белки, продуцируемые клетками, не считая других контаминантов, таких как компоненты среды, нуклеиновые кислоты и тому подобное. Поэтому, для того чтобы получить очищенный белковый продукт, необходимо отделить белок, представляющий интерес, от других белков и полипептидов и других примесей в неочищенном веществе, содержащем белок, представляющий интерес.

Часто трудно удалить белок-контаминант, содержащий домены такой же природы, как и полипептид, представляющий интерес.

Витамин К-зависимые белки отличаются от других белков тем, что имеют общую структурную особенность в амино-концевой части молекулы. N-конец этих белков, также называемый Gla-доменом, имеет высокое содержание необычной аминокислоты, γ-карбоксиглутаминовой кислоты, которая синтезируется из глутамата путем витамин К-зависимой реакции, катализируемой ферментом γ-глутамилкарбоксилазой. Из-за присутствия приблизительно 2-12 Gla-остатков Gla-домен характеризуется способностью связывать двухвалентные катионы, такие как Са²⁺. При связывании ионов металла эти белки подвергаются конформационным изменениям, которые могут быть измерены с помощью нескольких методик, таких как методики, основанные на явлениях циркулярного дихроизма и флуоресценции.

Открытие индуцированных металлом конформационных изменений Gla-содержащих белков (Nelsestuen et al., J. Biol. Chem. 1976; 251, 6886-6893) вместе с идентификацией конформационно-специфических поликлональных антител (Furie et al., J. Biol. Chem. 1978; 253, 8980-8987) открыло путь для использования конформационно-специфической иммуноаффинной хроматографии. Данные антитела могли узнавать и связывать Gla-домен в присутствии ионов Са²⁺ и высвобождать белок при удалении ионов Са²⁺ с использованием Са²⁺-хелатирующего агента, такого как ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) или цитрат.

В 1980-х годах была разработана конформационно-специфическая псевдоаффинная хроматография, использующая уникальное свойство Gla-содержащих белков подвергаться конформационным изменениям, индуцированным металлом. Псевдоаффинная хроматография отличается от традиционной аффинной хроматографии тем, что в ней не используется иммобилизованный аффинный лиганд и ее выполняют на традиционной хроматографической матрице (Yan S.В., J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218). Gla-белок может быть адсорбирован на анионообменном веществе путем удаления ионов двухвалентного металла. Последующую элюцию выполняют путем добавления к буферу для элюции Са²⁺.

В 1986 году Bjørn и Thim описали очистку рекомбинантного фактора VII на анионообменном веществе, основанную на использовании свойства Gla-домена фактора VII связывать Са²⁺ (Bjørn S. and Thim L., Research Dislosure, 1986, 26960-26962). Адсорбцию выполняли в буфере без Са²⁺, а элюцию фактора VII осуществляли с использованием Са²⁺-содержащего буфера с низкой ионной силой и в мягких условиях.

Yan с соавт. использовали те же самые принципы для очистки рекомбинантного человеческого белка С (Yan S.В. et al., Bio/technology. 1990; 8, 655-661).

Хотя присутствие Gla-домена дает преимущество при отделении Gla-содержащих белков от других белков, авторы настоящего изобретения заметили, что сходные свойства и поведение Gla-содержащих белков затрудняет их отделение друг от друга. Некоторые конформационно-специфические антитела против одних Gla-белков показывают перекрестную реактивность в отношении других Gla-белков (Furie В. and Furie В., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771; Church et al., J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267).

Brown с соавт. (Brown et al., J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802) описали моноклональные антитела, специфичные к Gla-остаткам. Данные антитела могли узнавать все протестированные Gla-белки: фактор VII, фактор IX, фактор II, белок С, белок S, GAS-6, Gla-белок костного матрикса, конантокин G.

Белки с GLA-доменом включают следующие белки: GAS-6, белок S, фактор II (протромбин), тромбин, фактор Х/Ха, фактор IX/IXa, белок С, фактор VII/VIIa, белок Z, трансмембранный Gla-белок 1 (transmembrane gamma-carboxyglutamic acid protein 1), трансмембранный Gla-белок 2 (transmembrane gamma-carboxyglutamic acid protein 2), трансмембранный Gla-белок 3 (transmembrane gamma-carboxyglutamic acid protein 3), трансмембранный Gla-белок 4 (transmembrane gamma-carboxyglutamic acid protein 4), матриксный Gla-белок и остеокальцин, но не ограничены ими.

В US 5633350 описан способ отделения витамин К-зависимых белков от сопутствующих белков, не являющихся витамин К-зависимыми.

Необходимость в эффективном отделении представляющего интерес витамин К-зависимого белка, такого как представляющий интерес содержащий Gla-домен полипептид, от белков-контаминантов является особенно важной проблемой, когда имеют дело с очисткой таких полипептидов, продуцированных в клеточных культурах, так как клетка-хозяин (которая может не относиться к линии клеток человека) может продуцировать значительные количества белков-контаминантов, которые могут вызывать нежелательные иммуногенные реакции при использовании данного полипептида.

Соответственно, задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить подходящие методики уменьшения содержания белков-контаминантов в композициях, содержащих представляющий интерес витамин К-зависимый белок, или даже их удаления. Другая задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить композиции, содержащие представляющий интерес витамин К-зависимый белок, с очень низким или даже пренебрежимо малым содержанием белков-контаминантов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к различным способам уменьшения содержания белка(ов)-контаминанта(ов) в композициях, содержащих представляющий интерес витамин К-зависимый белок, или даже их удаления.

Представляющие интерес витамин К-зависимые белки

Настоящее изобретение в широком аспекте относится к очистке представляющего интерес витамин К-зависимого белка и к конкретным очищенным композициям, содержащим такие белки. Термин "представляющий интерес" использован в данном описании в качестве указателя для конкретного вида (витамин К-зависимого белка), который является существенным для получения его в наиболее чистой форме, например, с целью применения данного витамин К-зависимого белка в терапевтическом контексте.

Приведенные в данном описании способы в принципе можно применять для очистки любого из витамин К-зависимых белков, включающих GAS-6, белок S, фактор II (протромбин), тромбин, фактор Х/Ха, фактор IX/IXa, белок С, фактор VII/VIIa, белок Z, трансмембранный Gla-белок 1, трансмембранный Gla-белок 2, трансмембранный Gla-белок 3, трансмембранный Gla-белок 4, матриксный Gla-белок и остеокальцин, но не ограниченных ими, в частности для очистки витамин К-зависимых факторов свертывания крови, выбранных из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С. В одном конкретном воплощении данный способ применен для очистки представляющих интерес рекомбинантных витамин К-зависимых белков, продуцированных в условиях клеточной культуры, в частности в условиях культур клеток, не принадлежащих человеку.

В одном конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX, такой как FIX или FIXa.

В другом конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII, такой как полипептид, родственный фактору VII, или производное фактора VII, или конъюгат фактора VII, в частности полипептид человеческого фактора VII, в частности человеческий фактор VII дикого типа или человеческий фактор VIIa дикого типа.

В контексте данного описания термины "полипептид фактора VII" и "FVII-полипептид" означают любой белок, содержащий аминокислотную последовательность 1-406 человеческого фактора VIIa дикого типа (например, полипептид, имеющий данную аминокислотную последовательность, раскрыт в патенте США №4784950), его варианты, а также полипептиды, родственные фактору VII, производные фактора VII и конъюгаты фактора VII. Они включают варианты фактора VII, полипептиды, родственные фактору VII, производные фактора VII и конъюгаты фактора VII, проявляющие по существу такую же биологическую активность, как человеческий фактор VIIa дикого типа, или улучшенную по сравнению с ним биологическую активность.

Термины "фактор VII" или "FVII" предназначены охватить полипептиды фактора VII в их нерасщепленной (зимогенной) форме, а также полипептиды фактора VII, которые подверглись протеолитическому процессингу с получением их соответствующих биоактивных форм, которые могут быть названы фактором VIIa. Обычно фактор VII расщепляется между остатками 152 и 153 с получением фактора VIIa. Такой вариант фактора VII может проявлять другие свойства по сравнению с человеческим фактором VII, включая стабильность, связывание с фосфолипидами, измененную специфическую активность и тому подобное.

В контексте данного описания "человеческий фактор VIIa дикого типа" представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, раскрытую в патенте США №4784950.

В контексте данного описания термин "полипептиды, родственные фактору VII" охватывает полипептиды, включая варианты (или аналоги), биологическая активность которых по отношению к фактору VIIa по существу модифицирована, например уменьшена относительно активности фактора VIIa дикого типа. Эти полипептиды включают фактор VII или фактор VIIa, в аминокислотную последовательность которых введены конкретные изменения, которые модифицируют или нарушают биоактивность полипептида, но не ограничены ими.

Термин "производное фактора VII" в контексте данного описания предназначен для обозначения полипептида фактора VII, проявляющего по существу такую же биологическую активность, как фактор VII дикого типа, или улучшенную по сравнению с ним биологическую активность, в котором одна или более чем одна аминокислота родительского пептида генетически, и/или химически, и/или ферментативно модифицирована, например путем алкилирования, гликозилирования, ПЭГилирования, гликоПЭГилирования, ацилирования, образования эфира или образования амида или тому подобного. Он включает ПЭГилированный человеческий фактор VIIa, цистеин-ПЭГилированный человеческий фактор VIIa и их варианты, но не ограничен ими. Неограничивающие примеры производных фактора VII включают гликоПЭГилированные производные фактора VII, такие как раскрыто в WO 03/31464 и заявках на патент США US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557 и US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); конъюгаты фактора VII, такие как раскрыто в WO 01/04287, заявке на патент США 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) и WO 02/02764, заявке на патент США 20030211094 (University of Minnesota).

Термин "улучшенная биологическая активность" относится к полипептидам фактора VII (1) по существу с такой же протеолитической активностью, как у рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа, или увеличенной по сравнению с ним протеолитической активностью, или (2) к полипептидам фактора VII по существу с такой же TF-связывающей активностью, как у рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа, или увеличенной по сравнению с ним TF-связывающей активностью, или (3) к полипептидам фактора VII по существу с таким же временем полужизни в плазме крови, как у рекомбинантного человеческого фактора VIIa дикого типа, или увеличенным по сравнению с ним временем полужизни. Термин "ПЭГилированный человеческий фактор VIIa" означает человеческий фактор VIIa, содержащий молекулу PEG, конъюгированную с полипептидом человеческого фактора VIIa. Необходимо понимать, что молекула PEG может быть присоединена к любой части полипептида фактора VIIa, включая любой аминокислотный остаток или углеводную группировку полипептида фактора VIIa. Термин "цистеин-ПЭГилированный человеческий фактор VIIa" означает фактор VIIa, содержащий молекулу PEG, конъюгированную с сульфгидрильной группой цистеина, введенного в человеческий фактор VIIa.

Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих по существу такую же протеолитическую активность, как рекомбинантный человеческий фактор VIIa дикого типа, или увеличенную по сравнению с ним протеолитическую активность, включают S52А-фактор VIIa, S60А-фактор VIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); варианты фактора VIIa, проявляющие увеличенную протеолитическую стабильность, такие как раскрыто в патенте США №5580560; фактор VIIa, который протеолитически расщеплен между остатками 290 и 291 или между остатками 315 и 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); окисленные формы фактора VIIa (Kornfelt et at., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); варианты фактора VII, такие как раскрыто в PCT/DK02/00189 (соответствует WO 02/077218); и варианты фактора VII, проявляющие увеличенную протеолитическую стабильность, такие как раскрыто в WO 02/38162 (Scripps Research Institute); варианты фактора VII, содержащие модифицированный Gla-домен и проявляющие повышенное связывание с мембраной, такие как раскрыто в WO 99/20767, патентах США US 6017882 и US 6747003, заявке на патент США 20030100506 (University of Minnesota) и WO 00/66753, заявках на патент США US 20010018414, US 2004220106 и US 200131005, патентах США US 6762286 и US 6693075 (University of Minnesota); и варианты фактора VII, такие как раскрыто в WO 01/58935, патенте США US 6806063, заявке на патент США 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS) и WO 04/029091 (Maxygen ApS).

Неограничивающие примеры вариантов фактора VII, имеющих увеличенную биологическую активность по сравнению с фактором VIIa дикого типа, включают варианты фактора VII, такие как раскрыто в WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (соответствует WO 03/027147), заявке на патент Дании РА 200201423 (соответствует WO 04/029090), заявке на патент Дании РА 200101627 (соответствует WO 03/027147); WO 02/38162 (Scripps Research Institute); и варианты фактора VIIa с повышенной активностью, такие как раскрыто в JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.).

Соответственно, варианты замен в полипептиде фактора VII включают замены в позициях Р10, К32, L305, М306, D309, L305, L305, F374, V158, М298, V158, Е296, К337, М298, М298, S336, S314, К316, К316, F374, S52, S60, R152, S344, Т106, К143, N145, V253, R290, А292, G291, R315, V317 и замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от Т233 до N240, или от R304 до С329; или от I153 до R223, или их комбинации, в частности такие варианты, как P10Q, К32Е, L305V, M306D, D309S, L305I, L305T, F374P, V158T, M298Q, V158D, E296V, К337А, M298Q, М298К, S336G, S314E, К316Н, K316Q, F374Y, S52A, S60A, R152E, S344A, T106N, K143N, N145T, V253N, R290N, А292Т, G291N, R315N, V317T и замены, вставки или делеции в аминокислотной последовательности от Т233 до N240, или от R304 до С329, или от I153 до R223, или их комбинации; но не ограничены ими.

Выражение "полипептиды" в связи с терминами "полипептиды фактора X" и "полипептиды фактора IX" предназначено охватывать любой белок, содержащий аминокислотную последовательность человеческого фактора Х дикого типа и человеческого фактора IX дикого типа соответственно, а также их соответствующие "аналоги", "варианты", "родственные полипептиды", "производные" и "конъюгаты", где выражения "варианты", "родственные полипептиды", "производные" и "конъюгаты" являются такими, как определено для фактора VII, с соответствующими изменениями.

Композиции

В контексте данного описания выражение "композиция" предназначено для обозначения жидкой композиции, такой как водная жидкая композиция, то есть композиция, содержащая менее 5% неводных растворителей.

Термин "исходная композиция" относится к композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, до обработки, такой как стадия очистки, согласно настоящему изобретению. Данный термин использован для того, чтобы отличить "исходную композицию" от "вторичной композиции", которая относится к той же самой композиции, но после такой обработки, например после стадии очистки.

Представляющий интерес витамин К-зависимый белок чаще всего представляет собой рекомбинантный белок, продуцированный в условиях клеточной культуры, то есть представляющий интерес витамин К-зависимый белок либо получен прямо в виде компонента супернатанта клеточной культуры, либо получен из супернатанта клеточной культуры после одной или более чем одной стадии предварительной обработки. При применении настоящего изобретения на практике клетки представляют собой эукариотические клетки, такие как стабильная линия эукариотических клеток, включая клеточные линии СНО (например, АТСС CCL 61), COS-1 (например, АТСС CRL 1650), почек детеныша хомяка (ВНК) и НЕК293 (например, АТСС CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), но без ограничения ими. Предпочтительной клеточной линией ВНК является клеточная линия tk^- ts13 ВНК (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982), называемая далее в данном описании клетки ВНК 570. Клеточная линия ВНК 570 доступна в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) под АТСС-регистрационным номером CRL 10314. Клеточная линия tk^- ts13 ВНК также доступна в АТСС под регистрационным номером CRL 1632. Предпочтительной клеточной линией СНО является клеточная линия СНО К1, доступная в АТСС под регистрационным номером ССI61.

Другие подходящие клеточные линии включают Rat Hep I (гепатома крыс; АТСС CRL 1600), Rat Hep II (гепатома крыс; АТСС CRL 1548), ТСМК (АТСС CCL 139), Human lung (АТСС НВ 8065), NCTC 1469 (АТСС CCL 91); клетки DUKX (клеточная линия СНО) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) (клетки DUKX также называются клетки DXB11) и DG44 (клеточная линия СНО) (Сеll, 33: 405, 1983 и Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986), но не ограничены ими. Полезными являются также клетки 3Т3, клетки Namalwa, миеломы и клетки, полученные от слияния миелом с другими клетками. В некоторых воплощениях клетки могут представлять собой мутантные или рекомбинантные клетки, такие как, например, клетки, которые экспрессируют качественно или количественно другой спектр ферментов, которые катализируют посттрансляционную модификацию белков (например, ферментов гликозилирования, таких как гликозилтрансферазы и/или гликозидазы, или ферментов процессинга, таких как пропептиды), по сравнению с типом клеток, от которого они произошли. Подходящие линии клеток насекомых также включают клеточные линии Lepidoptera, такие как клетки Spodoptera frugiperda или клетки Trichoplusia ni (смотри, например, US 5077214), но не ограничены ими.

Обычно общее содержание белков-контаминантов в исходной (например, в неочищенной) композиции составляет по меньшей мере 200 млн^-1, например по меньшей мере 300 млн^-1, например по меньшей мере 400 млн^-1 или по меньшей мере 500 млн^-1.

Общее содержание контаминантов белка S в исходной (например, в неочищенной) композиции также обычно составляет по меньшей мере 200 млн^-1, например по меньшей мере 300 млн^-1, например по меньшей мере 400 млн^-1 или по меньшей мере 500 млн^-1.

Типичные белки-контаминанты

В контексте данного описания термины "белок-контаминант" и "белки-контаминанты" и тому подобные предназначены для обозначения белковых или полипептидных компонентов, составляющих примеси по отношению к представляющему интерес витамин К-зависимому белку. Соответственно, представляющий интерес витамин К-зависимый белок, очевидно, не должен рассматриваться в качестве белка-контаминанта, хотя определения "витамин К-зависимого белка" как такового и "белков-контаминантов" соответственно частично перекрываются. В одном воплощении белок-контаминант представляет собой витамин К-зависимый белок (но не представляющий интерес витамин К-зависимый белок).

Так как витамин К-зависимые белки обычно продуцируются в клеточных культурах, конкретные группы белков-контаминантов представляют собой белки клетки-хозяина. "Белки клетки-хозяина" представляют собой белки, продуцируемые клеткой-хозяином, экспрессирующей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, и обычно рассматриваются как примеси. Белки клетки-хозяина могут представлять собой белки человека, если для получения представляющего интерес витамин К-зависимого белка использована линия клеток человека, или белки, не принадлежащие человеку, если для получения белка, представляющего интерес, использована линия клеток, не принадлежащих человеку. Соответственно, в одном аспекте изобретения белок-контаминант представляет собой белок клетки-хозяина, такой как витамин К-зависимый белок.

Конкретный важный класс белков клетки-хозяина представляют собой белки, содержащие Gla-домен, такие как GAS-6, белок S, фактор II (протромбин), тромбин, фактор Х/Ха, фактор IX/IXa, белок С, фактор VII/VIIa, белок Z, трансмембранный Gla-белок 1, трансмембранный Gla-белок 2, трансмембранный Gla-белок 3, трансмембранный Gla-белок 4, матриксный Gla-белок и остеокальцин. Количество Gla-остатков в этих белках находится в диапазоне от 2 до 12. Так как синтез Gla-остатков требует витамина К, белки, содержащие Gla-остатки, также называются витамин К-зависимыми белками.

В контексте настоящего изобретения конкретный важный белок клетки-хозяина представляет собой белок S. В конкретном воплощении белок S представляет собой белок S хомяка. Соответственно, способы и композиции, определенные в данном описании, в особенности сфокусированы на уменьшении содержания белка S.

Уменьшение содержания белков-контаминантов

Основной аспект настоящего изобретения составляют способ(ы), обеспечивающие удаление белка-контаминанта (в частности, белка S) из композиций, содержащих представляющий интерес витамин К-зависимый белок (в частности, полипептид фактора VII).

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу уменьшения содержания одного или более чем одного белка-контаминанта в композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, включающему по меньшей мере стадии (1) контактирования композиции с твердофазным веществом, которое способно связывать один или более чем один белок-контаминант и/или представляющий интерес витамин К-зависимый белок, и (2) сбора получающейся композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, в результате чего уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, уменьшен по меньшей мере в 5 раз.

В наиболее важных воплощениях общее содержание белков-контаминантов в получающейся вторичной (например, очищенной) композиции, содержащей представляющий интерес витамин К-зависимый белок, уменьшено настолько, что составляет самое большее 100 млн^-1.

Как отмечено выше, представляющий интерес витамин К-зависимый белок обычно представляет собой витамин К-зависимый фактор свертывания крови, выбранный из полипептидов фактора VII, полипептидов фактора IX, полипептидов фактора Х и активированного белка С. В еще одном конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX. В еще одном конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII. В другом конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора X.

В конкретном воплощении преобладающее количество белков-контаминантов составляют полипептиды, содержащие Gla-домен, в частности белок S, а представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора VII. В одном воплощении белок-контаминант представляет собой белок S хомяка. В другом воплощении белок-контаминант представляет собой белок S и представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой полипептид фактора IX. В одном воплощении белок-контаминант представляет собой белок S хомяка.

В одном воплощении изобретение относится к способам отделения представляющего интерес витамин К-зависимого белка, содержащего 2-16 Gla-остатков, от других витамин К-зависимых белков-контаминантов, содержащих 2-16 Gla-остатков.

В другом воплощении изобретения предложен способ отделения белков с антикоагулянтным действием, таких как белок S и белок С, от белков с коагулянтным действием. В одном аспекте представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой фактор свертывания крови, а белок-контаминант с антикоагулянтным действием представляет собой белок S.

В другом воплощении изобретения предложен способ отделения белков-контаминантов, не принадлежащих человеку, от витамин К-зависимого белка человека. В одном аспекте изобретения данные белки-контаминанты, не принадлежащие человеку, также представляют собой витамин К-зависимые белки. В еще одном аспекте данные белки-контаминанты, не принадлежащие человеку, представляют собой белки хомяка.

Таким образом, способ по изобретению позволяет получить уровень белка(ов)-контаминанта(ов), выраженный в виде миллионных долей относительно представляющего интерес витамин К-зависимого белка, который уменьшен по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 25 раз, или по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 250 раз, или по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 750 раз, или по меньшей мере в 1000 раз, или по меньшей мере в 2000 раз.

В частности, общее содержание белков-контаминантов в получающейся вторичной (например, очищенной) композиции, такой как обработанный супернатант клеточной культуры, составляет самое большее 100 млн^-1, например самое большее 90 млн^-1, или самое большее 80 млн^-1, или самое большее 70 млн^-1, или самое большее 60 млн^-1, или самое большее 50 млн^-1, или самое большее 40 млн^-1, или самое большее 30 млн^-1, или самое большее 20 млн^-1, или самое большее 10 млн^-1, или самое большее 5 млн^-1; или общее содержание контаминантов белка S в получающейся вторичной (например, очищенной) композиции, такой как обработанный супернатант клеточной культуры, представляет собой самое большее 100 млн^-1, например самое большее 90 млн^-1, или самое большее 80 млн^-1, или самое большее 70 млн^-1, или самое большее 60 млн^-1, или самое большее 50 млн^-1, или самое большее 40 млн^-1, или самое большее 30 млн^-1, или самое большее 20 млн^-1, или самое большее 10 млн^-1, или самое большее 5 млн^-1, или самое большее 1 млн^-1.

Типичные супернатанты клеточных культур могут содержать значительное количество белков-контаминантов (в частности, белка S), соответственно, общее содержание белков-контаминантов в (например, неочищенном) супернатанте клеточной культуры обычно составляет по меньшей мере 500 млн^-1, например по меньшей мере 750 млн^-1, или по меньшей мере 1000 млн^-1, или по меньшей мере 2000 млн^-1; или общее содержание контаминантов белка S (примесей белка S) в (например, неочищенном) супернатанте клеточной культуры составляет по меньшей мере 500 млн^-1, например по меньшей мере 750 млн^-1, или по меньшей мере 1000 млн^-1, или по меньшей мере 2000 млн^-1.

Соответственно, в одном аспекте вышеизложенное относится к способу уменьшения содержания одного или более чем одного контаминанта белка S (примеси белка S) в композиции, содержащей полипептид фактора VII, включающему по меньшей мере стадии (1) контактирования композиции с твердофазным веществом, которое способно связывать контаминант(ы) белка S (примеси белка S) и/или полипептид фактора VII, и (2) сбора получающейся композиции, содержащей полипептид фактора VII, в результате чего уровень контаминанта(ов) белка S (примеси белка S), выраженный в виде миллионных долей относительно полипептида фактора VII, уменьшен по меньшей мере в 2 раза, например по меньшей мере в 5 раз.

Твердофазные вещества, полезные в данном изобретении, представляют собой твердофазные вещества, обычно используемые в хроматографических методиках и процессах, методиках и процессах аффинного захвата и в их конкретных вариантах, как будет очевидно далее.

В одном основном варианте вышеизложенного твердофазное вещество связывает относительно большее количество белка-контаминанта по сравнению с представляющим интерес витамин К-зависимым белком. В одном аспекте представляющий интерес витамин К-зависимый белок не связывается с твердой фазой и проскакивает через хроматографическую колонку, тогда как белок-контаминант связывается с твердой фазой, что приводит к отделению представляющего интерес витамин К-зависимого белка от белка-контаминанта. В частности, твердофазное вещество специфически связывает по меньшей мере один из контаминантов, например, за счет высокого аффинитета или путем ковалентного связывания указанного(ых) контаминанта(ов), например путем образования дисульфидных связей с тиольными группировками указанного(ых) контаминанта(ов).

В одном воплощении твердофазное вещество представляет собой ионообменную смолу, такую как анионообменная смола. Обычно используемые анионообменные смолы включают Q-смолу, четвертичный амин и DEAE-смолу, ДиЭтилАминоЭтан. Анионообменные смолы имеются в продаже, например Mono Q (Amersham Biosciences), Source 15Q или 30Q (Amersham Biosciences), Poros 20HQ или 50HQ (Perseptive Biosystems), Toyopearl Q650S (Toso Haas) и другие.

Элюция с анионообменной смолы может быть выполнена путем увеличения электропроводности буфера для элюции, например путем увеличения концентрации солей в буфере для элюции или путем уменьшения рН буфера для элюции. В одном конкретном воплощении изобретения элюцию выполняют путем увеличения концентрации СаСl₂. В другом конкретном воплощении элюцию выполняют путем увеличения концентрации МgСl₂. Элюция может быть осуществлена с использованием ступенчатого или градиентного элюирования.

Наиболее широко используемая катионообменная смола содержит карбоксиметильную (СМ) или сульфопропильную (SP) группу. Примеры таких катионообменников включают Toyopearl СМ-650 или Toyopearl SP-650 (Toso Haas), Source 15 S или 30 S, CM или SP Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences), Obelix (Amersham Biosciences), но не ограничены ими.

В другом воплощении твердофазное вещество представляет собой матрикс, замещенный гидрофобными лигандами, такими как этил-, бутил-, фенил- или гексил-группы. Данный тип хроматографии называется хроматографией гидрофобного взаимодействия (НIС) и использует гидрофобные свойства белков. Адсорбция стимулируется гидрофобными взаимодействиями между неполярными областями на белке и иммобилизованными на твердофазном носителе гидрофобными лигандами. Адсорбцию выполняют при высокой концентрации соли в водной подвижной фазе, а элюцию осуществляют путем уменьшения концентрации соли. В одном конкретном воплощении вещество представляет собой матрикс, замещенный бутильным или фенильным лигандом.

В другом аспекте изобретения твердофазное вещество несет аффинные лиганды. В одном воплощении твердофазное вещество несет моноклональные антитела против по меньшей мере одного из белков-контаминантов, в частности против белка S. Это проиллюстрировано в разделе "Примеры". В другом аспекте твердофазное вещество несет иммобилизованные триазиновые лиганды, такие как триазановые лиганды, описанные в WO 97/10887 (например, триазановые лиганды, описание которых приведено, начиная со страницы 5, линия 21, и далее по страницу 13, линия 6) или в US 6117996 (например, в параграфе 4-21), содержание которых включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Белок S циркулирует в плазме либо в свободном состоянии, либо в комплексе с С4bр. В-цепь С4bр содержит сайт для взаимодействия с белком S. Соответственно, он является важным для настоящего изобретения, в котором использованы типы С4bр, содержащие В-цепь. В одном воплощении изобретения для иммобилизации на твердом матриксе использована вся молекула С4bр. В другом воплощении для иммобилизации на твердом матриксе использована В-цепь или последовательность В-цепи, которая способна связывать белок S.

В другом варианте твердофазное вещество несет иммобилизованный белок С. В другом варианте твердофазное вещество несет иммобилизованный триазиновый лиганд. В другом варианте твердофазное вещество несет С4-связывающий белок. Белок S связывается с белком С и С4bр с гораздо большим аффинитетом, чем с другими витамин К-зависимыми белками. Поэтому содержание белка S может быть уменьшено путем связывания белка S с иммобилизованным белком С или С4bр. Альтернативно, для иммобилизации на твердой фазе можно использовать выбранные последовательности белка С и С4bр, ответственные за связывание с белком S.

С4b-связывающий белок (С4bр) участвует в регуляции системы комплемента. Он представляет собой мультимерный белок, содержащий 7 идентичных альфа-цепей и одну бета-цепь. Альфа- и бета-цепи имеют молекулярные массы 70 кДа и 45 кДа соответственно. Обе субъединицы принадлежат суперсемейству белков, состоящих преимущественно из тандемно расположенных коротких консенсусных повторов (SCR), приблизительно 60 аминокислотных остатков в длину.

В другом воплощении твердофазное вещество связывает по меньшей мере один из контаминантов путем ковалентного захвата. Белок S имеет одну свободную цистеиновую группировку, тогда как фактор VII не имеет ни одной. Данная свободная цистеиновая группировка затем может быть селективно присоединена к активированному, содержащему тиольную группу веществу или матриксу путем тиол-дисульфидного обмена с образованием смешанного дисульфида. Таким образом можно было бы уменьшить содержание белка S, например, путем ковалентной хроматографии, размерно-эксклюзионной хроматографии или с помощью методик с использованием мембран. Следует понимать, что вариант данного воплощения представляет собой вариант, где твердофазное вещество не участвует, то есть где образование дисульфида (например, путем образования димеров) позволяет отделить белок-контаминант от представляющего интерес витамин К-зависимого белка другими средствами, например путем размерно-эксклюзионной хроматографии или с помощью методик с использованием мембран.

В одном конкретном воплощении представляющий интерес витамин К-зависимый белок представляет собой компонент супернатанта клеточной культуры, см. раздел "Примеры".

В другом воплощении способа, дополнительно определенного выше, твердофазное вещество связывает относительно большее количество представляющего интерес витамин К-зависимого белка по сравнению с белком(ами)-контаминантом(ами). Более конкретно, твердофазное вещество специфически связывает представляющий интерес витамин К-зависимый белок.

В одном варианте твердофазное веществе несет моноклональные антитела против представляющего интерес витамин К-зависимого белка или его аналога.

В другом варианте твердофазное вещество несет ингибитор указанного представляющего интерес витамин К-зависимого белка, например ингибитор бензамидин- или гуанидин-типа, такой как ингибиторы, содержащие мотив -C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R², где

Z¹ и Z² независимо выбраны из группы, состоящей из -O-, -S-, -NR^H- и одинарной связи, где R^H выбран из группы, состоящей из водорода, C_1-4-алкила, арила и арилметила, и R¹ и R² независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, возможно замещенного C_1-6-алкила, возможно замещенного С_2-6-алкенила, возможно замещенного арила, возможно замещенного гетероциклила, или

Z² и R² являются такими, как определено выше, и -C=N-Z¹-R¹ образует часть гетероциклического кольца, или

Z¹ и R¹ являются такими, как определено выше, и -C-NH-Z²-R² образует часть гетероциклического кольца, или

-C(=N-Z¹-R¹)-NH-Z²-R² образует гетероциклическое кольцо, где -Z¹-R¹-R²-Z²- представляет собой бирадикал