Способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах
Патент 2460790
Авторы
Правообладатели
Классы МПК
Способ иммобилизации l-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах
Изобретение относится к биохимии. Предложен способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах оксидов металлов в присутствии конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида. Способ позволяет повысить удельную активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы и сохранить от 64% до 75% ее активности. 6 табл., 3 пр.
Реферат
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу иммобилизации на поверхностно-модифицированных магнитных наночастицах фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы, осуществляющего биотрансформацию L-фенилаланина до аммиака и транс-циннамовой кислоты. Изобретение может быть использовано в качестве терапевтических композиций, а также для создания специализированных продуктов питания для больных фенилкетонурией.
Иммобилизованные ферменты обладают рядом очевидных преимуществ перед нативными: легкость отделения гетерогенного биокатализатора от реакционной среды; непрерывность проведения ферментативного процесса с возможностью регулирования скорости катализируемой реакции и выхода продукта; направленное изменение свойств фермента (специфичность, зависимость каталитической активности от рН и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям); возможность регулирования каталитической активности иммобилизованных ферментов путем изменения свойств носителя.
В данной области предложено множество технических решений, среди которых наибольшее распространение получили химические способы иммобилизации ферментных препаратов, суть которых заключается в ковалентном связывании биомолекул с инертным носителем, модифицированным реакционно-способными функциональными группами (амино-, азидо-, карбоксильные, гидроксильные и др.). Однако в большинстве своем эти способы иммобилизации имеют ряд недостатков, а именно использование дорогостоящих материалов и реактивов для иммобилизации, трудоемкость и многостадийность методик.
Известен способ иммобилизации (см. пат. US №WO 2009120916 (A1), МПК С08K 3/08, заявл. 28.03.2008, опубл. 10.01.2009) биообъектов на поликарбонатных нанокомпозитах, представляющих собой металлические наночастицы, покрытые слоем поликарбоната полимеризацией в реакционной смеси. В данном случае поликарбонатные нанокомпозиты получают из смеси дигидроксисоединений, активированного карбоната, металлического прекурсора и растворителя. Затем реакционная смесь подвергается полимеризации с образованием поликарбонатного нанокомпозита, представляющего собой поликарбонатную матрицу с распределенными частицами металла. В качестве прекурсоров при этом используют оксиды таких металлов, как золото, платина, палладий, кобальт, железо, никель, магний. Данный способ иммобилизации отличается такими недостатками, как использование дорогостоящих металлов и невысокая удельная активность полученных препаратов.
Также известно изобретение (см. пат. IT №WО 2009040843 (А2), МПК А61K 47/48, заявл. 04.08.2008, опубл. 02.04.2009), описывающее способ получения неорганических микро- и наночастиц оксидов металлов с регулируемой пористостью, используемых в качестве носителей для биомолекул. Данное техническое решение описывает неорганические мицеллярные композиты, функционализированные с использованием различных реагентов с помощью процесса графт-сополимеризации. Данное техническое решение имеет следующие недостатки: многостадийность процесса и невысокая стабильность препаратов.
Известен также способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул (см. пат. РФ №RU 2216547 (С2), заявл. 16.10.2001, опубл. 20.11.2003), описывающий композит для присоединения олигонуклеотидов, белков и нуклеиновых кислот, структура которых включает активные функциональные группы: - амино, сульфгидрильные и т.д. В качестве мономеров в данном техническом решении используются такие соединения, как акриламид, метакриламид, 2-гидроксиэтилэтилметакрилат или производные акриловой, метакриловой, коричной, кретоновой и других ненасыщенных кислот. Недостатки данного изобретения следующие: использование токсических соединений и узкий диапазон оптимальных условий функционирования: рН и температура.
Наиболее близким к заявляемому изобретению - прототипом - является техническое решение (см. пат.US №ЕР 0230649 (А1), МПК C12N 11/10, заявл. 23.12.1986, опубл. 05.08.1987), заключающееся в иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы путем добавления полиамина, хитозана и многофункциональных соединений, содержащих аминогруппы, таких как глутаровый альдегид. Примеры полиаминов, используемых в данном изобретении, включают полиэтилендиамин, полиэтиленимин, полидиэтилентриамин, политриэтилентетрамин, полипентаэтиленгексамин или полигексаметилендиамин. В данном случае глутаровый альдегид выполняет функцию конденсирующего агента, посредством которого происходит образование ковалентной связи между функциональными группами фермента и носителя.
Основными недостатками данного технического решения следует считать относительно низкую удельную активность иммобилизованного препарата и узкий диапазон условий функционирования.
Задачей технического решения является повышение удельной активности и стабильности иммобилизованного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы за счет химического взаимодействия реакционно-способных функциональных групп молекулы фермента с поверхностью магнитных наночастиц, что открывает перспективы многократного использования биокатализатора в технологическом процессе и непрерывного проведения ферментативного процесса с возможностью регулирования скорости катализируемой реакции и выхода продукта. Данные характеристики иммобилизованных препаратов позволят снизить их себестоимость. Использование магнитных наночастиц в получении иммобилизованных ферментных препаратов является перспективным в связи с тем фактом, что они обладают развитой активной поверхностью и высокой сорбционной емкостью, а также способны приближаться к биообъекту и связываться с ним вследствие размеров, сопоставимых с размерами клеток, вирусов, белков, ДНК. Проведенный поиск показал, что в источниках информации отсутствуют технические решения, связанные со всей совокупностью отличительных признаков, изложенных в изобретении.
Технический результат достигается за счет использования в качестве носителя для иммобилизации магнитных наночастиц, представляющих собой оксиды металлов. Выбор в качестве наночастиц оксидов металлов обусловлен их широким распространением и невысокой стоимостью. Данная техническая задача реализуется за счет модификации поверхности магнитных наночастиц функциональными группами с последующим ковалентным присоединением фермента L-фенилаланин-аммоний-лиазы в присутствии конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида.
Способ получения поверхностно-модифицированных магнитных наночастиц для иммобилизации биологических веществ включает выполнение следующих операций. На первом этапе осуществляется получение магнитных наночастиц, содержащих на поверхности электрофильные сложноэфирные группы, путем взаимодействия полиметилметакрилата, соответствующего хлорида металла и диэтиленгликоля. Вторая стадия заключается в формировании на поверхности наночастиц слоя аминопропилтриэтоксисисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Полученные наночастицы служат для последующей иммобилизации ферментов с использованием 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Готовят смесь полиметилметакрилата, хлорида железа (III) и диэтиленгликоля, нагревают при перемешивании до 220°С. Затем к смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле. Через несколько минут образуются наночастицы Fе3O4 с поверхностными сложноэфирными группами, которые отделяют центрифугированием. Образующиеся магнитные наночастицы пригодны для иммобилизации биологических веществ посредством конденсирующего агента.
На второй стадии получения ферментного препарата на поверхности наночастиц Fе3O4 формируют слой аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Важно избегать присутствия воды в системе на этой стадии, поскольку ее наличие приводит к гидролизу аминопропилтриэтоксисилана и образованию олигомерных силанов. Поэтому в отдельной камере объемом 30 см3 наночастицы Fе3O4 (1,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 70°С в течение 30 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см3 и высушивают на воздухе. Далее наночастицы Fе3O4 (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение одного часа при температуре 50°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы Fе3O4 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц Fе3O4 с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).
Далее 200 мкл полученной суспензии инкубируют с 200 мкл 100 мМ 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида в 0,1М фосфатном буфере в течение трех часов при непрерывном перемешивании при комнатной температуре. По окончании инкубации суспензию промывают три раза 0,025М фосфатным буфером и готовят суспензию в 500 мкл 0,1М фосфатного буфера. На следующей стадии смешивают 20 мкл L-фенилаланин-аммоний-лиазы с 500 мкл 0,1М фосфатного буфера и инкубируют полученный раствор с 500 мкл суспензии наночастиц Fе3О4 в 0,1М фосфатном буфере при температуре 30°С в течение двух часов. По окончании иммобилизации наночастицы Fе3O4 промывают 0,025М фосфатным буферным раствором до исчезновения активности в промывных водах. Полученный иммобилизованный препарат хранится в виде суспензии наночастиц с ковалентно связанным ферментом в 1000 мкл 0,1М фосфатного буфера. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах Fе3O4, представлены в табл.1. В качестве контроля в данном случае используют L-фенилаланин-аммоний-лиазу, иммобилизованную на немодифицированных наночастицах Fе3O4 адсорбционным способом.
В табл.2 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах Fе3O4 L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Из табл.2 следует, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах Fе3O4 приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах Fе3O4 L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 65,5% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.
| Таблица 1 | ||||
| Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы | ||||
| Способ иммобилизации | Удельная активность фермента, ед./мг белка | Удельная активность фермента, % от нативного | Оптимум рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах Fе3O4 | 0,53 | 60,9 | 7,5-9,0 | 30±3 |
| Контрольный опыт | 0,33 | 37,9 | 8,0-9,0 | 30±1 |
| Таблица 2 | ||
| Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах Fе3О4, по сравнению с контролем | ||
| Продолжительность хранения, сутки | Остаточная активность фермента, % | |
| L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах Fе3O4 | Контрольный опыт | |
| 5 | 98,0 | 91,5 |
| 10 | 95,6 | 85,0 |
| 15 | 82,4 | 69,8 |
| 20 | 77,6 | 57,0 |
| 25 | 72,0 | 40,5 |
| 30 | 65,5 | 32,9 |
Пример 2
Смесь полиметилметакрилата, хлорида никеля и диэтиленгликоля тщательно перемешивают и нагревают до 180°С. К реакционной смеси добавляют раствор гидроксида натрия в диэтиленгликоле. Образующиеся через несколько минут наночастицы NiO с поверхностными сложноэфирными группами отделяют центрифугированием. Следующей стадией получения ферментного препарата является формирование слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Для этого в отдельной камере объемом 50 см3 наночастицы NiO (5,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (2 см3) при атмосферном давлении и температуре 80°С в течение 20 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см3 и высушивают на воздухе. Далее наночастицы NiO (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение одного часа при температуре 70°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы NiO несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц NiO с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).
Последующая иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы NiO посредством конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида осуществляется аналогично примеру 1. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах NiO, по сравнению с контролем представлены в табл.3.
В табл.4 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах NiO L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Результаты, представленные в табл.4, свидетельствуют о том, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах NiO приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах NiO L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 64,4% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.
| Таблица 3 | ||||
| Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы | ||||
| Способ иммобилизации | Удельная активность фермента, ед./мг белка | Удельная активность фермента, % от нативного | Оптимум рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах NiO | 0,65 | 74,7 | 7,3-9,2 | 30±4 |
| Контрольный опыт | 0,33 | 37,9 | 8,0-9,0 | 30±1 |
| Таблица 4 | ||
| Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах NiO, по сравнению с контролем | ||
| Продолжительность хранения, сутки | Остаточная активность фермента, % | |
| L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах NiO | Контрольный опыт | |
| 5 | 95,0 | 91,5 |
| 10 | 93,2 | 85,0 |
| 15 | 80,1 | 69,8 |
| 20 | 74,0 | 57,0 |
| 25 | 69,5 | 40,5 |
| 30 | 64,4 | 32,9 |
Пример 3
Для получения поверхностно-модифицированных наночастиц ТiO2 готовят смесь хлорида титана (IV), полиметилметакрилата и диэтиленгликоля, после чего нагревают ее при перемешевании до 220°С. Затем к реакционной смеси добавляют гидроксид натрия в диэтиленгликоле. Через несколько минут образуются наночастицы ТiO2, которые отделяют центрифугированием. Следующий этап - образование слоя аминопропилтриэтоксисилана за счет протекания реакции аминолиза электрофильных фрагментов носителя. Для этого в отдельной камере объемом 10 см3 наночастицы TiO2 (1,0 мг) покрывают газообразным 3-аминопропилтриэтоксисиланом (1 см3) при атмосферном давлении и температуре 100°С в течение 60 минут. После остывания образец обрабатывают этиловым спиртом три раза по 5 см3 и высушивают на воздухе. Далее частицы ТiO2 (1,0 мг) обрабатывают 0,5%-ным раствором 3-аминопропилтриэтоксисилана (растворитель - смесь этанол: вода 1:1) в течение двух часов при температуре 90°С. На этом этапе происходит совместная поликонденсация силана с триалкоксисилановыми группами. По окончании процесса модификации наночастицы ТiO2 несколько раз промывают растворителем вода - этиловый спирт (1:1) и готовят суспензию наночастиц с концентрацией 5 мг/см3 в 0,1М фосфатном буфере (рН 7,8).
Иммобилизацию L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицы ТiO2 посредством конденсирующего агента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида осуществляют аналогично примеру 1. Физико-химические характеристики L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах ТiO2, по сравнению с контролем представлены в табл.5.
В табл.6 представлены данные, полученные при исследовании стабильности иммобилизованной на наночастицах TiO2 L-фенилаланин-аммоний-лиазы, по сравнению с контролем при хранении. Результаты, представленные в табл.6, свидетельствуют о том, что иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на наночастицах ТiO2 приводит к стабилизации фермента. Так, по истечении 30 суток хранения иммобилизованная на наночастицах ТiO2 L-фенилаланин-аммоний-лиаза сохраняет 75,0% активности, в то время как в контрольном опыте сохраняется 32,9% активности.
| Таблица 5 | ||||
| Физико-химические параметры иммобилизованной L-фенилаланин-аммоний-лиазы | ||||
| Способ иммобилизации | Удельная активность фермента, ед./мг белка | Удельная активность фермента, % от нативного | Оптимум рН | Температурный оптимум, °С |
| Иммобилизация на модифицированных наночастицах ТiO2 | 0,71 | 81,6 | 7,4-9,1 | 30±4 |
| Контрольный опыт | 0,33 | 37,9 | 8,0-9,0 | 30±1 |
| Таблица 6 | ||
| Стабильность при хранении L-фенилаланин-аммоний-лиазы, иммобилизованной на наночастицах TiO2, по сравнению с контролем | ||
| Продолжительность хранения, сутки | Остаточная активность, % | |
| L-фенилаланин-аммоний-лиаза, иммобилизованная на наночастицах ТiO2 | Контрольный опыт | |
| 5 | 98,7 | 91,5 |
| 10 | 97,2 | 85,0 |
| 15 | 90,3 | 69,8 |
| 20 | 85,4 | 57,0 |
| 25 | 81,5 | 40,5 |
| 30 | 75,0 | 32,9 |
Таким образом, иммобилизация L-фенилаланин-аммоний-лиазы на поверхностно-модифицированных наночастицах оксидов металлов открывает перспективу модуляции каталитических свойств фермента. Данное изобретение обладает рядом преимуществ перед прототипом:
- возможность использования в качестве инертного носителя магнитных наночастиц, имеющих ряд преимуществ перед макрообъектами;
- повышение удельной активности и стабильности иммобилизованных препаратов;
- оптимизация условий функционирования иммобилизованных препаратов;
- упрощение и удешевление технологии получения иммобилизованных препаратов.
Стабилизирующее действие наночастиц оксидов металлов на L-фенилаланин-аммоний-лиазу, очевидно, обусловлено конформационными изменениями в молекуле белка в результате его взаимодействия с наноразмерными объектами. Каталитические свойства полученного иммобилизованного препарата L-фенилаланин-аммоний-лиазы позволяют широко использовать его в биотехнологии.
Способ иммобилизации L-фенилаланин-аммоний-лиазы на магнитных наночастицах, заключающийся в ковалентном связывании молекул фермента с поверхностью носителя посредством конденсирующего агента, отличающийся тем, что в качестве носителя для иммобилизации выступают наночастицы оксидов металлов, а в качестве конденсирующего агента используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид.