Аптамер против мидкина и его применение

Аптамер против мидкина и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к аптамеру против мидкина, способу применения его и подобного ему.

Уровень техники

Мидкин (в дальнейшем сокращаемый как "МК") является фактором роста/дифференцировки, который был впервые обнаружен как продукт гена, транзиентно экспрессирующийся в процессе индукции дифференцировки эмбриональных раковых клеток (EC) ретиноевой кислотой и представляющий собой полипептид с молекулярной массой 13 кДа, богатый основными аминокислотами и цистеином (см., например, непатентный документ 1 и непатентный документ 2).

Стерическая структура МК была определена при помощи ЯМР и опубликована (см., например, непатентный документ 3). По структурным характеристикам МК состоит в основном из двух доменов. В частности, МК состоит из фрагмента в N-концевой части, состоящего из аминокислотных остатков 1-52 (в дальнейшем называемый “N-концевой фрагмент”), фрагмента в C-концевой части, состоящего из аминокислотных остатков 62-121 (в дальнейшем называемый “C-концевой фрагмент”) и области петли, которая соединяет эти фрагменты (аминокислотные остатки 53-61). Связанный с областью за пределами каждого домена находится хвост, который богат основными аминокислотами. В молекуле МК каждый из N-концевого фрагмента и С-концевого фрагмента имеет стерическую структуру, состоящую главным образом из трех структур обратных бета-листов (в дальнейшем называемые "доменами"; домен, состоящий из аминокислотных остатков 15-52 в N-концевом фрагменте, называемый “N-доменом”, домен, состоящий из аминокислотных остатков 62-104 в C-концевом фрагменте, называемый “C-доменом”), и свободно перемещающиеся структуры, не предполагающие определенной структуры (в дальнейшем называемые "хвостами"; хвост, состоящий из аминокислотных остатков 1-14 в N-концевом фрагменте, называемый “N-хвостом”, и хвост, состоящий из аминокислотных остатков 105-121 в C-концевом фрагменте, называемый “C-хвостом”).

Известные рецепторы МК включают белок рецепторного типа тирозиновую фосфатазу ζ (PTPζ), LRP (белок, сходный с рецепторами липопротеинов низкой плотности), ALK (киназа анапластической лейкемии), интегрин и синдекан и т.п. МК является высоко положительно заряженным белком, содержащим большое количество основных аминокислот, таких как лизин (K) и аргинин (R). Он имеет гепарин-связывающий участок в C-домене, и, как известно, сильно связывается с отрицательно заряженными молекулами, такими как гепарин и сульфат хондроитина E. В результате мутагенезного анализа и ЯМР анализа считается, что кластер I, в конфигурации с K79, R81 и K102, и кластер II, в конфигурации с K86, K87 и R89, важны для связывания с гепарином. В то же время имеется публикация, что только кластер I необходим для связывания с сульфатом хондроитина E. В случае, когда R81 кластера I заменен на A, активность связывания с гепарином уменьшается. В результате наблюдается уменьшение активности связывания с PTPζ и подавление вызываемой МК элонгации нейритов и движения нервных клеток.

Ряд факторов роста, таких как фактор роста фибробластов (bFGF) и фактор роста васкулярных эндотелиальных клеток (VEGF), имеют гепарин-связывающий сайт. Предполагается, что эти факторы роста связываются с протеогликан сульфатом гепарина, внеклеточным матриксом, находятся в соответствующих положениях и высвобождаются, когда это необходимо. Известно также, что те же факторы связываются с сульфатом гепарина, экспрессирующимся в нервных клетках и васкулярных эндотелиальных клетках, и способствуют удлинению нейритов и усилению фибринолитической активности. В случае, когда чашка Петри была покрыта МК и на нее высевались нервные клетки эмбриона мыши, происходило удлинение нейритов. В этой ситуации расщепление нервных клеток гепаритиназой подавляет удлинение нейритов. В то же время, когда культивируются васкулярные эндотелиальные клетки и к ним добавляется МК, активность активатора плазминогена в клетках растет. В этом случае также расщепление клеток гепаритиназой подавляет увеличение активности плазминогена.

Считается, что МК связывается с PTPζ по двум сайтам. Один сайт включает в себя высокоафинную связь с сульфатом хондроитина (Кд=0,58 нМ). Эта связь исчезает после расщепления хондроитиназой. Другой сайт включает в себя связь с белком, которая, будучи низкоафинной связью, сохраняется после расщепления с хондроитиназой (Кд=3 нМ). МК способствует миграции эмбриональных нервных клеток, экспрессирующих PTPζ; обработка нервных клеток хондроитиназой ABC препятствует миграции. Остеобласт-подобные клетки UMR106 экспрессируют PTPζ, и, как известно, обладают МК-зависимой миграцией, которая подавляется обработкой хондроитиназой ABC. МК-зависимая миграция макрофага также подавляется обработкой хондроитиназой ABC, хондроитиназой B или гепариназой. Поскольку считается, что макрофаг не экспрессирует PTPζ, предполагается, что в процессе участвует другой рецептор.

Все отрицательно заряженные частицы не связываются с гепарин-связывающим сайтом МК. В случае, когда МК был иммобилизован амино-связыванием и подвергался анализу поверхностного плазмонного резонанса, полученные результаты показали, что сульфат хондроитина E и гепарин сильно связываются с МК, тогда как сульфат хондроитина A, B, C и D с МК не связывается.

Известно, что МК обладает широким спектром биологической активности. Например, известно, что в человеческих раковых клетках экспрессия МК увеличена. Такая увеличенная экспрессия наблюдалась в многочисленных видах рака, включая рак пищевода, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак прямой кишки, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак груди, рак печени, рак легких, рак молочной железы, нейробластому, глиобластому, рак матки, рак яичников и опухоль Вильмса (см., например, патентный документ 1 и непатентный документ 4). Также предполагается, что МК способствует выживанию и перемещению раковых клеток и облегчает неоваскуляризацию, что приводит к прогрессированию рака.

Также известно, что МК является одной из молекул, которые играют центральную роль в процессе развития воспаления. Например, известно, что образование новой интимы после повреждения кровеносного сосуда и начало нефрита при ишемическом повреждении являются ослабленными в нокаутных мышах, не имеющих гена МК. Также известно, что в модели ревматизма послеоперационная адгезия также значительно подавлена в мышах с нокаутом МК (см., например, патентный документ 2, патентный документ 3 и патентный документ 4). Таким образом, известно, что МК участвует в воспалительных заболеваниях, таких как артрит, аутоиммунная болезнь, ревматические артриты (ревматический артрит (РА), остеоартрит), рассеянный склероз, постоперационная адгезия, воспалительный колит, псориаз, волчанка, астма и функциональные отклонения нейтрофилов. Кроме того, известно, что МК способствует движению (миграции) клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, при воспалении. Поскольку это движение необходимо для развития воспаления, считается, что при отсутствии мидкина болезни, основанные на воспалении, скорее всего не будут возникать. (См., например, патентный документ 5).

В связи с тем, что уровень МК увеличивается в перитонеальной жидкости женщин с распространенным эндометриозом, а также потому, что МК стимулирует пролиферацию эндометриальных интерстициальных клеток в культуре, считается, что МК участвует в возникновении и распространении эндометриоза (см., например, патентный документ 6).

Кроме того, в связи с действием на утолщение сосудистой интимы считается, что МК участвует в сосудистых обструктивных заболеваниях, таких как рестеноз после операции сосудистой реконструкции, обструктивное заболевание сердечных коронарных артериальных сосудов, обструктивное заболевание сосудов мозга, обструктивное заболевание сосудов почек, обструктивное заболевание периферических сосудов, артериосклероз и мозговой инфаркт (см., например, патентный документ 2).

Известно, что клеточная миграция важна для механизмов проникновения/метастаз раковых клеток, утолщения интимы в артериосклеротических очагах, при неоваскуляризации и т.д. Также известно, что миграция клеток при воспалении тесно связана с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как стенокардия, инфаркт миокарда, мозговой инфаркт, мозговое кровоизлияние и гипертония.

Плейотропин (PTN или HB-GAM) является единственным белком в семействе МК, имеющим приблизительно 50% гомологии с МК. И МК, и плейотропин являются белками, содержащими большое количество цистеина и основных аминокислот. Все 10 цистеиновых аминокислот являются консервативными в МК и PTN, и структурно оба могут быть разделены на N-домен и C-домен. В результате ЯМР анализа известно, что эти две молекулы имеют очень похожие трехмерные структуры. Каждый домен состоит из трех бета листов, связанных через подвижную линкерную область. Аминокислоты K79, R81 и K102, которые предположительно важны для связывания с сульфатом хондроитина и гепарином, являются консервативными в этих двух белках. K79 и R81 находятся на одном и том же бета листе, в то время как K102 расположена на другом бета листе. Когда МК и PTN образуют пространственную структуру, эти основные аминокислоты располагаются вблизи поверхности белка.

В последние годы внимание привлекали применения РНК аптамеров в терапевтических лекарствах, диагностических реагентах и реактивах для анализа; некоторые РНК аптамеры уже находятся на стадии клинических испытаний или в практическом применении. В декабре 2004 г. первый в мире препарат РНК аптамера, Macugen, был одобрен в качестве терапевтического препарата для возрастной макулярной дегенерации в США. РНК аптамер обозначает РНК, которая специфично связывается с веществом-мишенью, таким как белок, и может быть получен с использованием способа SELEX (Системная Эволюция Лигандов Экспоненциальным Обогащением) (непатентные документы 5, 6). Способ SELEX является способом, при котором РНК, которая специфично связывается с веществом-мишенью, отбирается приблизительно из набора 10¹⁴ РНК, имеющих различные нуклеотидные последовательности. Используемая РНК имеет структуру, в которой случайная последовательность из приблизительно 40 остатков находится между последовательностями праймеров. Этому набору РНК давали возможность связаться с веществом-мишенью, и только та РНК, которая связалась с веществом-мишенью, выделялась с использованием фильтра и т.д. Полученная РНК амплифицировалась ПЦР с обратной транскрипцией, и полученный продукт использовался как матрица для следующего цикла. После повторения этой операции приблизительно 10 раз иногда можно получить РНК аптамер, который специфически связывается с веществом-мишенью.

[патентный документ 1] JP-A-6-172218

[патентный документ 2] WO2000/10608

[патентный документ 3] WO2004/078210

[патентный документ 4] WO2004/085642

[патентный документ 5] WO1999/03493

[патентный документ 6] WO2006/016571

[непатентный документ 1] Kadomatsu, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151:p.1312-1318

[непатентный документ 2] Tomokura, M. et al.: J.Biol. Chem, 265: p.10765-10770

[непатентный документ 3] Iwasaki, W. et al., (1997) EMBO J. 16, p.6936-6946

[непатентный документ 4] Muramatsu, T., (2002) J. Biochem. 132, p.359-371

[непатентный документ 5] Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822

[непатентный документ 6] Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510

Раскрытие изобретения

Задачи, решаемые изобретением

Настоящее изобретение направлено на обеспечение аптамера для мидкина и способа применения его и подобного ему.

Способы решения указанных задач

Авторам настоящего изобретения в результате активных исследований, направленных на решение описанных выше проблем, удалось получить аптамер хорошего качества для мидкина, что привело к разработке настоящего изобретения.

Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает следующее:

(1) аптамер, обладающий ингибирующей активностью против мидкина,

(2) аптамер по п. (1), который не обладает ингибирующей активностью против плейотропина,

(3) аптамер по п. (1), обладающий активностью связывания с N-концевым фрагментом мидкина,

(4) аптамер по п. (1), обладающий активностью связывания с C-концевым фрагментом мидкина,

(5) аптамер по п. (2), обладающий активностью связывания с N-концевым фрагментом мидкина,

(6) аптамер по п. (2), обладающий активностью связывания с C-концевым фрагментом мидкина,

(7) аптамер, который проявляет ингибирующую активность против мидкина посредством ингибирования связывания мидкина и PTPζ,

(8) аптамер по п. (1), который соответствует либо (a), или (b) из описанного ниже:

(a) аптамер, включающий нуклеотидные последовательности, выбираемые из SEQ ID NO: 1-70 (с условием, что урацил может быть тимином), в которых нуклеотиды, содержащиеся в аптамере, такие, что

(i) в 2'-положениях пиримидиновых нуклеотидов, одинаковых или различных, находятся атомы фтора или замещены на атомы или группы, выбираемые из группы, состоящей из атомов водорода, гидроксильных групп и метоксильных групп, и

(ii) в 2'-положениях пуриновых нуклеотидов, одинаковых или различных, находятся гидроксильные группы или замещены на атомы или группы, выбираемые из группы, состоящей из атомов водорода, метоксильных групп и атомов фтора;

(b) аптамер, включающий в себя нуклеотидные последовательности, выбираемые из SEQ ID NO: 1-70 (с условием, что урацил может быть тимином), в которых один или несколько нуклеотидов замещены, удалены, вставлены или добавлены, в которых нуклеотиды, содержащиеся в аптамере, такие, что

(i) в 2'-положениях пиримидиновых нуклеотидов, одинаковых или различных, находятся атомы фтора или замещены на атомы или группы, выбираемые из группы, состоящей из атомов водорода, гидроксильных групп и метоксильных групп, и

(ii) в 2'-положениях пуриновых нуклеотидов, одинаковых или различных, находятся гидроксильные группы или замещены на атомы или группы, выбираемые из группы, состоящей из атомов водорода, метоксильных групп и атомов фтора;

(9) аптамер по любому из пп. (1)-(8), в которых нуклеотид, содержащийся в аптамере, модифицирован,

(10) комплекс, включающий аптамер по любому из пп. (1)-(9) и функциональное вещество,

(11) комплекс по п. (10), в котором функциональным веществом является вещество аффинности, вещество для мечения, фермент, носитель для доставки лекарственных средств или лекарственное средство,

(12) фармацевтический препарат, включающий аптамер по любому из пп. (1)-(9) или комплекс по п. (10) или (11),

(13) ингибитор миграции клеток, включающий аптамер по любому из пп. (1)-(9) или комплекс по п. (10) или (11),

(14) реактив для диагностики, включающий аптамер по любому из пп. (1)-(9) или комплекс по п. (10) или (11),

(15) агент для мечения, включающий аптамер по любому из пп. (1)-(9) или комплекс по п. (10) или (11), и

(16) способ детектирования аптамера по любому из пп. (1)-(9) или комплекс по п. (10) или (11).

Применение изобретения

Аптамер или комплекс настоящего изобретения может использоваться как фармацевтические препараты или реактивы, такие как диагностические реактивы для различных болезней, таких как аутоиммунная болезнь, рак, послеоперационная адгезия и эндометриоз. Аптамер или комплекс настоящего изобретения может также использоваться в очистке и концентрировании МК, и детектировании и количественном определении МК.

Краткое описание фигур

Фиг.1A показывает одну из двух вторичных структур РНК, представленных SEQ ID NO:1, предсказанную программой MFOLD.

Фиг.1B показывает вторую вторичную структуру РНК, представленную SEQ ID NO:1, предсказанную программой MFOLD.

Фиг.2A показывает одну из двух вторичных структур РНК, представленную SEQ ID NO:2, предсказанную программой MFOLD, в которой часть, заключенная в квадрат, показывает консенсусную область.

Фиг.2B показывает другую вторичную структуру РНК, представленную SEQ ID NO:2, предсказанную программой MFOLD, в которой часть, заключенная в квадрат, показывает консенсусную область.

Фиг.3A показывает одну из двух вторичных структур РНК, представленной SEQ ID NO:3, предсказанную программой MFOLD.

Фиг.3B показывает другую вторичную структуру РНК, представленной SEQ ID NO:3, предсказанную программой MFOLD, в которой часть, заключенная в квадрат, показывает консенсусную область.

Фиг.4 показывает вторичную структуру РНК, представленной SEQ ID NO:4, предсказанную программой MFOLD, в которой часть, заключенная в квадрат, показывает консенсусную область.

Фиг.5 показывает вторичную структуру РНК, представленной SEQ ID NO:5, предсказанную программой MFOLD.

Фиг.6 показывает взаимодействия между РНК, представленной SEQ ID NO:5 и мидкином, и между РНК и IgG1 человека (сенсограмма получена с использованием BIAcore2000).

Фиг.7 показывает взаимодействие между РНК, представленной SEQ ID NO:4 и мидкином (сенсограмма получена с использованием BIAcore2000).

Фиг.8 показывает вторичную структуру РНК, представленной SEQ ID NO:20, предсказанную программой MFOLD.

Фиг.9 показывает вторичную структуру РНК, представленной SEQ ID NO:61, предсказанную программой MFOLD.

Наилучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает аптамер, обладающий активностью связывания с мидкином (МК). Аптамеры настоящего изобретения обладают активностью, ингибирующей МК.

Аптамер обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую аффинность связывания со специфической молекулой-мишенью. Кроме того, аптамер может также ингибировать активность специфической молекулы-мишени, связываясь со специфической молекулой-мишенью. Аптамер настоящего изобретения может быть РНК, ДНК, модифицированной нуклеиновой кислотой или их смесью. Аптамер настоящего изобретения может также находиться в линейной или кольцевой форме.

Ингибирующая активность против МК означает ингибирование любой биологической активности МК. В качестве примера биологических активностей МК можно упомянуть миграционную активность клеток (например, макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов, васкулярных гладкомышечных клеток, опухолевых клеток, остеобластов, нервных клеток и их прогениторных клеток) (Takada et al., 1997, J. Biochem. 122, 453-458, Horiba et al., 2000, J. Clin. Invest. 105, 489-495, Maeda et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 12474-12479, Qi et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, 15868-15875), активности, способствующие пролиферации и дифференцировке клеток (например, опухолевых клеток, фибробластов, кератиноцитов, нервных клеток, хондроцитов и их прогениторных клеток) (Muramatsu и Muramatsu, 1991, Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 652-658, Muramatsu et al., 1993, Dev. Biol. 159, 392-402, Takei et al, 2001., Cancer Res. 61, 8486-8491), ингибиторные активности против пролиферации и функций регуляторных T клеток, активности, способствующие элонгации нейритов нервных клеток, ингибиторные активности против апоптоза клеток (например, опухолевых клеток, нервных клеток), активности, вызывающие нейроваскуляризацию (например, опухолевых клеток), активности, вызывающие формирование синапса для миобластов, активности, способствующие действиям фибринолитической системы для сосудистых эндотелиальных клеток, активности, вызывающие продукцию IL-8 для васкулярных гладкомышечных клеток и т.п. Таким образом, в качестве примеров ингибиторных активностей против МК можно упомянуть ингибиторные активности против этих активностей.

Аптамер настоящего изобретения может обладать ингибиторными активностями против МК, полученного из любых видов млекопитающих. В качестве примера таких млекопитающих можно упомянуть приматов (например, люди, обезьяны), грызунов (например, мыши, крысы, морские свинки), а также домашних животных, одомашненных животных и рабочих животных (например, собаки, кошки, лошади, быки, козы, овцы, свиньи).

Аптамеры настоящего изобретения не имеют особенных ограничений при условии, что они способны связываться с произвольно выбранной частью МК для ингибирования соответствующей активности; например, связываясь с N-концевым фрагментом или C-концевым фрагментом МК, аптамеры настоящего изобретения способны к ингибирующим активностям МК. Аминокислотная последовательность человеческого МК содержится в GenBank под номером BC011704, при этом секреторный белок образуется 121 аминокислотами от лизина 23 до аспарагиновой кислоты 143. Как правило, лизин 23 обозначается аминокислотой в положении 1. Человеческий МК состоит из N-концевого фрагмента, состоящего из аминокислот 1-52, C-концевого фрагмента, состоящего из аминокислот 62-121, и области петли, которая соединяет эти фрагменты, но граница N-концевого фрагмента и фрагмента C-концевого фрагмента может быть любой частью петли МК (53-61) и не может быть точно определена.

Длина аптамера настоящего изобретения не ограничена и обычно может быть приблизительно от 15 до 200 нуклеотидов, и может быть, например, не более чем приблизительно 100 нуклеотидов, предпочтительно не более чем приблизительно 80 нуклеотидов, более предпочтительно не более чем приблизительно 60 нуклеотидов, наиболее предпочтительно не более чем приблизительно 45 нуклеотидов. Длина аптамера настоящего изобретения может быть, например, не менее чем приблизительно 18, 20 или 25 нуклеотидов. Если общее количество нуклеотидов является меньшим, химический синтез и массовое производство будет легче, и это дает значительное преимущество с точки зрения стоимости. Также считается, что химическая модификация аптамера является легкой, его стабильность высокой и токсичность низкой.

Каждый из нуклеотидов, содержащихся в аптамере настоящего изобретения, одинаковый или различный, может быть нуклеотидом, включающим гидроксильную группу в 2'-положении рибозы (например, рибозы нуклеотида пиримидина) (то есть незамещенного нуклеотида) или нуклеотидом, имеющим гидроксильную группу, замещенную произвольно выбранным атомом или группой в 2'-положении рибозы. В качестве примера такого произвольно выбранного атома или группы может быть упомянут нуклеотид с замещением на атом водорода, атом фтора или алкил группу (например, -O-Me группу), алкил группу (например, -O-CHO группу), или аминогруппу (например, -NH₂ группу). Аптамер настоящего изобретения может также быть аптамером, в котором, по меньшей мере один тип (например, 1, 2, 3 или 4 типа) нуклеотида включает нуклеотид, содержащий в 2'-положениях рибозы гидроксильную группу, или вышеописанные произвольно выбранные атом или группу, например, по меньшей мере два вида (например, 2, 3 или 4 вида) групп, выбираемых из группы, состоящей из атома водорода, атома фтора, гидроксильной группы и -O-Me группы. В аптамерах настоящего изобретения все нуклеотиды могут быть нуклеотидами, содержащими во 2'-положении рибозы гидроксильную группу или произвольно выбранный атом или группу, описанную выше, например, группу, выбираемую из группы, состоящей из атома водорода, атома фтора, гидроксильной группы и -O-Me группы.

Пример аптамера настоящего изобретения может иметь потенциальную вторичную структуру, включающую одну или более частей, выбираемых из группы, состоящей из одноцепочечных частей (например, gggagaggaac), первых стволовых частей (например, gacg и их комплементарных цепей), внутренних областей петли (например, aggagua и gg), вторых стволовых частей (например, gcc и их комплементарных цепей) и внутренних областей петли (например, ggaaagaa). Другой пример аптамера настоящего изобретения может иметь потенциальную вторичную структуру, включающую одну или более частей, выбираемых из группы, состоящей из одноцепочечных частей (например, gggaaggaggaa), первых стволовых частей (например, gugcac и их комплементарных цепей), внутренних областей петли (например, ag и gg), вторых стволовых частей (например, gg и их комплементарных цепей) и внутренних областей петли (например, guuggug).

Использующийся здесь термин “потенциальная вторичная структура” относится к вторичной структуре, способной к образованию при физиологических условиях; например, присутствует ли или нет потенциальная вторичная структура, может быть определено с использованием программ предсказания структуры, описанных в Примерах. Стволовая область относится к части, в которой двойная цепь образуется парой оснований в двух или более последовательных нуклеотидах (например, G-C, A-U, A-T). Часть внутренней петли обозначает нестволовую область, образованную между двумя различными стволовыми областями. Область шпильки петли относится к частичной структуре, образованной одной стволовой областью, которая является областью петли, образованной на противоположной стороне к 5' концу и 3' концу цепи аптамера. Одноцепочечная область относится к конечной части полинуклеотидной цепи и является областью, которая не соответствует вышеупомянутой стволовой области, внутренней области петли или области шпильки петли.

Аптамер настоящего изобретения может также обладать способностью связывания с N-концевым фрагментом и/или C-концевым фрагментом МК. Аптамер, представленный SEQ ID NO:39, и его измененные формы, как гепарин и сульфат E хондроитина, проявляют высокую активность связывания с C-концевым фрагментом. Предполагается, что гепарин связывается с C-концевым фрагментом в областях кластера I и кластера II. Предполагается, что сульфат хондроитина E связывается с C-концевым фрагментом в области кластера I. Известно, что МК взаимодействует с PTPς, который включает сульфат хондроитина как составляющую молекулу. PTPς экспрессируется в эмбриональных нервных клетках и клетках остеобластной структуры, и в присутствии МК происходит стимуляция миграции этих клеток. В настоящем изобретении описываются аптамер, способный к связыванию с C-концевым фрагментом и ингибирующий миграцию клеток, и другой аптамер, который связывается главным образом с N-концевым фрагментом и ингибирует миграцию клеток.

Аптамеры настоящего изобретения также способны к ингибированию активности МК (например, активности МК в отношении миграции клеток) и могут обладать свойством неспособности ингибировать активность PTN (например, активность PTN в отношении клеточной миграции). PTN является единственным белком в семействе, имеющим гомологию с МК 50%, они имеют очень схожие трехмерные структуры и аминокислоты, которые важны для связывания с сульфатом хондроитина и гепарина, являются консервативными.

Аптамер настоящего изобретения может также быть (a) аптамером, содержащим нуклеотидную последовательность, выбираемую из одного из SEQ ID NO:1-70 (но где урацил может быть тимином), (b) аптамером, содержащим нуклеотидную последовательность, выбираемую из одного из SEQ ID NO:1-70 (но где урацил может быть тимином), имеющим один или несколько нуклеотидов замещенных, удаленных, вставленных или добавленных, или (c) конъюгатом, выбираемым из группы, состоящей из конъюгатов из множества вышеупомянутых единиц (a), конъюгатом из множества вышеупомянутых единиц (b) и конъюгатов из множества вышеупомянутых единиц (a) и (b). В вышеупомянутом (b) количество замещенных, удаленных, вставленных или добавленных нуклеотидов не ограничено специально при условии, что это ограничивается несколькими нуклеотидами, и число нуклеотидов может быть, например, не более чем приблизительно 30, предпочтительно не более чем приблизительно 20, более предпочтительно не более чем приблизительно 10, более предпочтительно не более чем 5, наиболее предпочтительно 4, 3, 2 или 1. В вышеупомянутом (c) конъюгирование может быть достигнуто тандемным связыванием. В этом конъюгировании может использоваться линкер. В качестве линкера можно отметить нуклеотидные цепи (например, от 1 до приблизительно 20 нуклеотидов) и ненуклеотидные цепи (например, линкер -(CH₂)_n-, линкер -(CH₂CH₂O)_n-, линкер гексаэтиленгликоля, TEG линкер, пептид-содержащий линкер, линкер, содержащий -S-S- связи, линкер, содержащий -CONH- связи, линкер, содержащий -OPO₃- связи. Множество, упомянутое в вышеописанном множестве конъюгатов, не является специально ограниченным при условии, что их два или больше, и множество может быть, например, 2, 3 или 4. Каждый из нуклеотидов в упомянутых выше (a)-(c), одинаковый или различный, может быть нуклеотидом, включающим гидроксильную группу в 2'-положении рибозы, или нуклеотидом, имеющим замещенную гидроксильную группу на произвольно выбранную группу (например, атом водорода, атом фтора или группу -O-Me) в 2'-положении рибозы (например, рибозы нуклеотида пиримидина).

В одном конкретном аспекте аптамеры настоящего изобретения можно классифицировать приблизительно на три типа в соответствии своим структурам. Первый тип аптамера - это аптамер, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:61, или его мутированная форма. Аптамер, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:61, когда его вторичная структура предсказана программой MFOLD, имеет потенциальную вторичную структуру, показанную на фиг.9, формируемую одноцепочечной частью, первой стволовой частью, внутренней областью петли, второй стволовой частью и областью шпильки петли. В этом аптамере замена, удаление, вставка и/или добавление нескольких нуклеотидов являются приемлемыми в одноцепочечной части, первой стволовой части, внутренней области петли, второй стволовой части и области шпильки петли. Например, в этом аптамере допускаются вставка нескольких нуклеотидов в одноцепочечную часть, вставка нескольких нуклеотидов в первую стволовую часть и добавление нескольких нуклеотидов к 3' концу одноцепочечной части (например, SEQ ID NO:5). Такой аптамер связывается сильнее с N-концевым фрагментом, чем с C-концевым фрагментом МК.

Вторым видом аптамера является аптамер, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленный SEQ ID NO:20, или его мутантная форма. Аптамер, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:20, когда его вторичная структура предсказана программой MFOLD, имеет потенциальную вторичную структуру, показанную на Фиг.8, формируемую одноцепочечной частью, первой стволовой частью, внутренней областью петли, второй стволовой частью и областью шпильки петли. В этом аптамере замена, удаление, вставка и/или добавление нескольких нуклеотидов являются приемлемыми в одноцепочечной части, первой стволовой части, внутренней области петли, второй стволовой части и области шпильки петли. Например, в этом аптамере допускаются вставка нескольких нуклеотидов в одноцепочечную часть, вставка нескольких нуклеотидов в первую стволовую часть и добавление нескольких нуклеотидов к 3' концу одноцепочечной части (например, SEQ ID NO:4). Такой аптамер почти не проявляет связывания к N-концевому фрагменту МК и связывается сильно с C-концевым фрагментом.

Третьим видом аптамера является аптамер, состоящий из нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, или его мутированная форма.

Аптамер настоящего изобретения может быть аптамером, в котором остаток сахара (например, рибоза) каждого нуклеотида является модифицированным для увеличения активности связывания, стабильности, доставки лекарственных препаратов МК и т.п. В качестве примеров модифицированного участка в остатке сахара можно отметить участок, имеющий атом кислорода во 2'-положении, 3'-положении и/или 4'-положении остатка сахара, замещенные на другие атомы. В качестве примеров модификации можно отметить фторирование, O-алкилирование (например, O-метилирование, O-этилирование), O-арилирование, S-алкилирование (например, S-метилирование, S-этилирование), S-арилирование и аминирование (например, -NH₂). Такие изменения в остатке сахара могут выполняться известным способом (см., например, Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145).

Аптамер настоящего изобретения может также иметь измененную (например, с помощью химического замещения) основу нуклеиновой кислоты (например, пурин или пиримидин) для увеличения активности связывания МК и т.п. В качестве примеров таких изменений можно упомянуть изменение пиримидина в 5 положении, изменение пурина в 6 и/или 8 положениях, изменение с экстрациклическим амином, замещение на 4-тиуридин, замена на 5-бромо или 5-иодоурацил. Фосфатная группа, содержащаяся в аптамере настоящего изобретения, может быть изменена для придания устойчивости к нуклеазам и гидролизу. Например, P(O)O группа может быть замещена на P(O)S (тиоат), P(S)S (дитиоат), P(O)NR₂ (амидат), P(O)R, R(O)OR', CO или CH₂ (формацетал) или 3'-амин (-NH-CH₂-CH₂-) (в котором каждая группа R или R' независимо является H или замещенным или незамещенным алкилом (например, метилом, этилом)).

Группой связывания может, например, быть -O-,-N- или -S-, и нуклеотиды могут связываться с соседним нуклеотидом посредством этих групп связывания.

Изменения могут также включать такие изменения, как кэппинг в 3' и 5'-положениях.

Изменение может также осуществляться добавлением к концу полиэтиленгликоля, аминокислоты, пептида, инвертированного dT, нуклеиновой кислоты, нуклеозидов, миристоила, литоколик-олеила, докозанила, лауроила, стеароила, пальмитоила, олеоила, линолеоила, других липидов, стероидов, холестерина, кофеина, витаминов, пигментов, флуоресцентных веществ, противораковых агентов, токсина, ферментов, радиоактивных веществ, биотина и т.п. Для таких изменений см., например, патенты США 5660985 и 5756703.

Аптамер настоящего изобретения может быть химически синтезирован по описаниям, представленным здесь, и по способу, известному специалисту. Аптамер связывается с веществом-мишенью большим разнообразием способов связывания, таких как ионные связи, основанные на отрицательном заряде фосфатных групп, гидрофобные связи и водородные связи, основанные на рибозе, и водородные связи и связи сжатия, основанные на основаниях нуклеиновой кислоты. В частности, ионные связи, основанные на отрицательном заряде фосфатных групп, которые присутствуют в таком же количестве, как и количество составляющих нуклеотидов, являются сильными связями и связываются с лизином и аргинином, присутствующими на поверхности положительного заряда белка. Поэтому основания нуклеиновой кислоты, не участвующие в прямом связывании с веществом-мишенью, могут быть заменены. В частности, в связи с тем, что в области стволовой структуры пары оснований уже сформированы и направлены внутрь двойной спирали, маловероятно, что основания нуклеиновой кислоты непосредственно связываются с веществом-мишенью. Поэтому часто, даже когда одна пара оснований замещается на другую пару оснований, активность аптамера не уменьшается. В структурах, в которых пары оснований не сформированы (таких как структуры петли), замена оснований возможна при условии, что основания нуклеиновой кислоты не участвуют в прямом связывании с молекулой-мишенью. Что касается модификаций 2'-положений рибозы, функциональная группа во 2'-положении рибозы иногда непосредственно взаимодействует с молекулой-мишенью, но во многих случаях это не является важным, и она может быть замещена другой модифицированной молекулой. Таким образом, аптамер часто сохраняет свою активность при условии, что не изменена или не удалена функциональная группа, участвующая в прямом связывании с молекулой-мишенью. Также важно, чтобы полная стерическая структура не сильно менялась.

Аптамер может быть получен с использованием способа SELEX или его улучшенной модификации (например, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Nature, 249, 505-510). В способе SELEX при увеличении число раундов или использовании конкурирующего вещества концентрируется и отбирается аптамер, проявляющий более сильные силы связывания к веществу-мишени. Следовательно, регулируя число раундов SELEX и/или изменяя условия конкуренции, в ряде случаев могут быть получены аптамеры с различными силами связывания, аптамеры с различными способами связывания и аптамеры с одинаковыми силами связывания и способами связывания, но различными последовательностями оснований. Способ SELEX включает процесс ПЦР амплификации; посредством осуществления мутации ионами марганца и т.п. возможно осуществить SELEX с более высоким многообразием.

Аптамеры, полученные SELEX, являются нуклеиновыми кислотами, которые проявляют высокую аффинность к веществу-мишени, и это не означает его связывания с активным участком вещества-мишени. Поэтому аптамеры, полученные SELEX, не всегда действуют на функцию вещества-мишени. У МК имеется богатая лизином область в области хвоста каждого из N-концов и C-концов; предполагается, что нуклеиновая кислота связывается с ними неспецифически. Предполагается, что эта часть хвоста не является важной для связывания с гепарином или хондроитином сульфатом. Не легко получить аптамер, который эффективно ингибирует активность МК в таких условиях. Фактически в настоящем изобретении были исследованы акт