Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур

Способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к биологическим исследованиям, а именно к способу оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур.

Стремительно развивающиеся исследования свойств наноматериалов и наночастиц, постоянно расширяющиеся области их применения ставят задачу поиска и апробации методов оценки их влияния на живые организмы, как на уровне всего организма, так и на отдельные клетки и клеточные структуры. Оценка клеточных эффектов является особенно важной вследствие наноразмерности действующих агентов, которые непосредственно воздействуют на клеточные структуры. Независимо от пути, по которому наночастицы и наноматериалы попадают в организм человека (например, при нанесении на кожу или при инъекциях в ткань или кровь), происходит их взаимодействие с клеточной системой различных тканей и органов, что влияет на функционирование клеточных органелл, жизнеспособность клеток и может оказывать токсическое действие на них.

Поэтому актуальной и важной является проблема создания тестов для оценки биологической активности наночастиц, их влияния на жизнедеятельность клеточных культур с учетом физико-химических и биологических особенностей, как наночастиц, так и клеточных культур.

Предшествующий уровень техники

Известны методики (тесты) in vitro по определению влияния наночастиц на клеточные культуры, в соответствии с которой рекомендовано использовать:

- в качестве моделей клеточных культур: мышиные макрофагоподобные клетки 774.А1, мышиные фибробласты L929, эмбриональные мышиные фибробласты линии Balb/3Т3 (линия 3Т3), человеческие моноцитарные линии ТНР-1 и HL-60 (периферическая кровь, острая моноцитарная лейкемия, промиелоцитарная лейкемия), человеческую лимфоидную линию К-562 (плевральная жидкость, хроническая миелогенная лейкемия);

- тестируемые наночастицы, диспергированные в растворителе, для введения в соответствующую питательную среду клеточной культуры;

- проведение тестирования in vitro для оценки влияния наночастиц на клеточные культуры по показателям: цитотоксичность, продукция активных форм кислорода (АФК), продукция фактора некроза опухоли-альфа, иммунотропное действие путем использования, в частности, метода проточной цитофлуориметрии по качественным и количественным изменениям в клетках (см. Методические указания МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов». Утверждены 24.05.2010 Главным государственным санитарным врачом РФ).

В техническом решении (см. заявку US №20090269279, публ. 29.10.2009 г.) предложен способ оценки уровня токсичности, стрессовых реакций, повреждений ДНК (DNA) эпителиальных клеток, нормальных человеческих кератиноцитов (NHK), фибробластов человека (HSF) при воздействии на них многослойных углеродных нанотрубок с диаметром от 10 до 50 нм, используемых, в частности, с химико-терапевтическими целями в онкологии. Для оценки влияния названных наноматериалов на указанные клеточные культуры в известном техническом решении используют тесты для измерения клеточной пролиферации, степени апоптоза и некроза с использованием метода цитофлуориметрии.

В техническом решении (см. заявку US №20100279289, публ. 04.11.2010 г.) предложен способ оценки влияния наночастиц, в частности, золота (Au) с размером от 2 до 200 нм на клетки Т- лимфобластного лейкоза человека линии Джуркат (Jurkat) на основе измерения уровня экспрессии генов.

Известен также способ оценки влияния наночастиц на клеточные культуры (см. заявку US №20080295187, публ. 27.11.2008 г.), заключающийся в проведении тестов in vitro на клетки тест-культур, содержащих суспензии тестируемых наночастиц, по определению влияния наночастиц на производство активных форм кислорода, образованию апоптотических и некротических клеток, нарушению функций митохондрий с использованием цитологических флуоресцентных маркеров с последующим анализом на проточном цитофлуориметре, в оценке влияния наночастиц на клеток тест-культуры путем сравнения полученных показателей с соответствующими показателями контрольных образцов клеток тест-культур, не содержащих тестируемые наночастицы.

Данное техническое решение выбрано в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.

В указанном техническом решении в качестве цитологических флуоресцентных маркеров (добавляемых к клеткам для визуализации и контроля функциональных изменений в клеточных структурах) используют стандартные в цитологии красители: дихлорфлуоресцин диацетат (DCFH-DA) - для выявления АФК, пропидий-йодид (PI) - для выявления апоптотических, некротических клеток, 3,3-дигексилоксакарбоцианин йодид (3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6)) - для выявления нарушений функций митохондрий (изменений трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm)), краситель MitoSOX™ red (красный) - для выявления АФК и функциональных изменений в клетках.

В качестве клеток тест-культур в экспериментах по данному техническому решению использовали макрофагоподобные клетки мышей RAW 264.7, при этом в соответствии с данным изобретением в качестве клеток тест-культур предлагается также использовать эпителиальные и эндотелиальные клетки, клетки почек и печени и др., которые выделяют из беспозвоночных, млекопетающих, бактерий и дрожжей.

При определении in vitro влияния наночастиц на клеточные культуры в качестве тестируемых наночастиц используют: ультрадисперсные частицы (UFP) отработанных газов энергетических (тепловых) установок, наночастицы сажи (Carbon black), наночастицы TiO2, фуллерены (Fullerol), микро- и наносферы полистирола (Polystyrene), при этом названные наночастицы при проведении их тестирования выдерживают в клеточных культурах от 1 часа до 4 недель.

В качестве контрольного образца использовались, в частности, макрофагоподобные клетки мышей тест-культуры RAW 264.7 без введения наночастиц.

В данном техническом решении определяют влияния наночастиц на клеточные культуры также по показателям: экспрессия антиоксидантных молекул глутатиона (на основе выявления индукции антиоксидантных ферментов - гемм-оксигеназы-1, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, каталазы); активация провоспалительных каскадов при окислительном стрессе (на основе выявления индукции провоспалительных цитокинов и хемокинов, например, tumour-necrosis factor-α (TNF-α)); клеточное поглощение и внутриклеточная локализация наночастиц (на основе электронной микроскопии макрофагоподобных клеток мышей RAW 264.7 и оценки изменений (повреждений) в митохондриях и вакуолях клеток).

На основании анализа указанных выше технических решений можно сделать следующие выводы:

- не существует системы тестов, способной оценить биологическую активность, токсичность и безопасность существующих наноматериалов и наночастиц по отношению к клеточным культурам;

- разработчики, в основном, предлагают узкоспециализированные и недостаточно стандартизованные методики и тесты;

- в указанных выше технических решениях исследуются определенные культуры клеток (биологических жидкостей, тканей и органов живых организмов) и конкретные виды наноматериалов и наночастиц с целью их прикладного, частного применения в областях биологии, медицины или техники;

- в указанных выше технических решениях не исследованы некоторые важнейшие типы первичных культур клеток, ответственных за физиологическую тканевую регенерации и репарацию тканей после повреждения, определяющих иммунный ответ организма на чужеродные воздействия;

- в указанных выше технических решениях также не исследовано воздействие наночастиц на важнейшие органеллы клеток - лизосомы (ответственные за переваривание захваченных клеткой при эндоцитозе веществ или частиц, аутофагию и автолиз), а также не исследовано воздействие наночастиц в зависимости от их концентрации в клеточной среде на функционирование клеточных органелл в целом.

Сущность изобретения

С позиций современных биологических исследований и нанотехнологии важным представляется решение технической задачи по расширению, совершенствованию системы тестов (способов) определения биологического влияния наночастиц с учетом их физико-химических, биоактивных свойств на исследуемые культуры клеток, которые позволяют имитировать основные функциональные особенности клеточной системы живого организма.

Для решения данного технического результата предложен способ оценки влияния наночастиц на жизнедеятельность клеточных культур, заключающийся в проведении тестов in vitro клеток тест-культур при инкубировании их с суспензиями тестируемых наночастиц для определения влияния наночастиц на производство активных форм кислорода, образование апоптотических и некротических клеток, нарушение функций митохондрий с использованием цитологических флуоресцентных маркеров с анализом на проточном цитофлуориметре и в оценке влияния наночастиц на исследуемые клетки тест-культур путем сравнения полученных показателей с соответствующими показателями контрольных образцов исследуемых клеток тест-культур, не содержащих тестируемые наночастицы, отличающийся тем, что в качестве клеток тест-культур используют первичные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, выделяемых из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека, и мононуклеарных клеток - лимфоцитов, выделяемых из периферической крови человека, дополнительно определяют влияние наночастиц на названые клетки тест-культур по цитотоксичности, состоянию лизосомального компартмента, внутриклеточному накоплению тестируемых наночастиц, при проведении тестов in vitro каждый показатель определения влияния наночастиц на клетки тест-культур исследуют при инкубировании их с суспензиями тестируемых наночастиц в ростовой среде в течение 12-36 часов при изменении концентрации тестируемых наночастиц от 1·10-2 до 1·10-4 мас.%, причем для получения суспензий используют 1,0% водные суспензии наночастиц и ростовые среды при их соотношениях: 1:100; 1:1000; 1:10000, и каждый показатель теста in vitro в зависимости от концентрации нананочастиц сравнивают с соответствующим показателем теста in vitro контрольного образца и оценивают влияние наночастиц на жизнедеятельность клеток по полученным показателям.

По настоящему изобретению в качестве тестируемых наночастиц используют диоксид кремния (SiO2) с размером частиц 5-12 нм; наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированные ионами серебра (Ag+), с размером частиц 20-200 нм, наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированные ионами церия (Ce3+), с размером частиц 20-200 нм.

По настоящему изобретению при проведении тестов in vitro для определения влияния наночастиц на производство активных форм кислорода в клетках тест-культур используют флуоресцентный маркер - дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) с определением количества окрашенных клеток и интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре.

По настоящему изобретению для выявления апоптотических и некротических клеток в клетках тест-культур используют набор маркеров Annexin V с анализом тестируемых клеток на проточном цитофлуориметре.

По настоящему изобретению показатель нарушения функций митохондрий выявляют по изменению трансмембранного потенциала митохондрий клеток тест-культур при использовании флуоресцентного потенциалзависимого маркера МитоТрекер Красный (MitoTracker Red 580) с определением интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре.

По настоящему изобретению показатель цитотоксичности тестируемых наночастиц при воздействии на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки оценивают по методу МТТ-теста с использованием раствора 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида в ростовой среде.

По настоящему изобретению показатель цитотоксичности тестируемых наночастиц при воздействии на мононуклеарные клетки - лимфоциты оценивают по увеличению доли некротических клеток, выявленных при окрашивании маркером - пропидий-йодидом (PI), с анализом на проточном цитофлуориметре.

По настоящему изобретению для определения состояния лизосомального компартмента тестируемых клеток используют флуоресцентный рН-зависимый маркер ЛизоТрекер Зеленый (LysoTracker Green DND-26) с анализом тестируемых клеток на проточном цитофлуориметре.

По настоящему изобретению для оценки внутриклеточного накопления наночастиц используют измерение бокового светорассеяния клетками тест-культур с применением проточного цитофлуориметра.

При реализации настоящего изобретения разработан эффективный способ оценки in vitro биологического влияния перспективных для медицинского и технического применения наночастиц на клеточные культуры, которые имитируют основные функциональные особенности клеточной системы человека, что объясняется:

- комплексной оценкой биологического влияния наночастиц на такие важнейшие типы клеток, как первичные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и мононуклеарных клеток крови (МНК) - лимфоцитов; ММСК - стромальные клетки-предшественники (называемые также мезенхимальными стволовыми клетками) являются принципиальными клеточными элементами физиологической тканевой регенерации и репарации тканей; МНК - это высокоспециализированные, дифференцированные клетки, определяющие иммунный ответ организма на чужеродные воздействия; ММСК и МНК представляют собой популяции, которые распространены по всему организму, таким образом, оценка in vitro воздействия наночастиц на клетки системы тканей внутренней среды позволит охарактеризовать возможный биомедицинский риск использования наночастиц на уровне всего организма в целом;

- целесообразностью разработки способа определения биологического влияния наночастиц на ММСК и МНК посредством оценки in vitro спектра параметров, характеризующих показатели жизнедеятельности клеток: жизнеспособность, пути клеточной гибели, энергетический потенциал и система деградации эндоцитированных продуктов (цитотоксичность; продукция активных форм кислорода (АФК); некротические и апоптотические пути клеточной гибели; нарушение функций митохондрий; изменение лизосомального компартмента, внутриклеточное накопление наночастиц);

- целесообразностью определения биологического влияния на ММСК и МНК наночастиц вида: наночастицы диоксида кремния (SiO2), наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами серебра (Ag+) или ионами церия (Ce3+) (для проявления антимикробного и антиоксидантного эффекта в готовых продуктах), которые используются для медицинских, фармакологических, косметологических и технических целей.

При анализе известного уровня техники не выявлено технических решений с совокупностью признаков, соответствующих настоящему изобретению и обеспечивающих описанный выше результат.

Приведенный анализ известного уровня техники свидетельствует о соответствии заявляемого технического решения критериям изобретения «новизна», «изобретательский уровень».

Настоящее изобретение может быть реализовано при использовании известных технологических процессов, оборудования и материалов, используемых в фармакологии и медицине.

Осуществление изобретения

Изобретение поясняется рисунками и таблицами.

Рис.1. Оценка жизнеспособности ММСК после воздействия наночастиц.

Рис.2. Оценка нарушений функций митохондрий ММСК после воздействия наночастиц.

Рис.3. Оценка производства активных форм кислорода (АФК) в ММСК после воздействия наночастиц.

Рис.4. Оценка состояния лизосомального компартмента ММСК после воздействия наночастиц.

Таблица 1. Оценка соотношения апоптотических и некротических ММСК после воздействия наночастиц.

Таблица 2. Оценка внутриклеточного накопления наночастиц по изменению светорассеяния ММСК.

Рис.5. Оценка жизнеспособности МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.

Рис.6. Оценка нарушений функций митохондрий МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.

Рис.7. Оценка производства активных форм кислорода (АФК) в МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.

Рис.8. Оценка состояния лизосомального компартмента МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.

Таблица 3. Оценка соотношения апоптотических и некротических МНК (лимфоцитов) после воздействия наночастиц.

Таблица 4. Оценка внутриклеточного накопления наночастиц по изменению светорассеяния МНК (лимфоцитами).

Для реализации изобретения используют применяемые в биотехнологии приборы и оборудование: ламинарный шкаф (ВЛ22, Сампо, Россия); CO2-инкубатор (Sanyo, Япония); световой фазово-контрастный инвертированный микроскоп Leica DM IL (Германия); флуоресцентный фазово-контрастный микроскоп Leica DM5000B (Германия), оснащенный ртутной лампой НВО 100АС, наборами фильтров для анализа флуоресценции UV (ВР 340-380, LP 425), UV/V (BP 355-425, LP 470), FITC (BP 450-490, LP 520), TRITC (BP 510-560, LP 590), камерой и системой анализа изображения DC420 (Leica, Германия); встряхиватель Вортекс (Elmi, Латвия); центрифуга Eppendorf 5204 R (Eppendorf, Германия); водяная баня (BioSan); проточный цитофлуориметр Coulter Epics XL (Beckman Coulter, США); автоматические пипетки (Eppendorf, Германия); гемоцитометр (Bright Line, США); холодильник (Indesit, Россия) и низкотемпературный холодильник (Sanyo, Япония).

Для реализации изобретения используют материалы и вещества:

- флуоресцентный маркер - 2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) (Invitrogen GmbH, Германия);

- набор маркеров Annexin V (аннексии V-FITC, пропидий-йодид (PI), связывающий буфер) [фирма Immunotech, Франция, Invitrogen (Molecular Probes), США];

- флуоресцентный потенциал - зависимый маркер МитоТрекер Красный (MitoTracker Red 580) [фирма Invitrogen (Molecular Probes), США, Invitrogen GmbH, Германия];

- реагент МТТ-теста - 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида [фирма ICN Pharmaceutical, США];

- флуоресцентный маркер - пропидий-йодид (Propidium Iodide, PI) [Sigma, США];

- флуоресцентный рН-зависимый маркер ЛизоТрекер Зеленый (LysoTracker Green DND-26) [фирма Invitrogen GmbH, Германия];

- апротонный растворитель - диметилсульфоксид (CH3)2SO (Компания «Биолот», Россия);

- фетальная (эмбриональная) телячья сыворотка (ФТС/FBS) [фирма HyClone, США, PromoCell, Германия];

- ростовая (питательная) среда α-MEM (фирма ICN Pharmaceutical, США) (для культуры ММСК);

- ростовая (питательная) среда RPMI-1640 (ИПВЭ имени М.П.Чумакова РАМН, Россия) (для культуры МНК);

- фосфатно-солевой буфер (ФСБ/PBS) [фирма Gibco, Великобритания];

- раствор: трипсин-ЭДТА (Trypsin-EDTA) [фирма Gibco, Великобритания];

- коллагеназа IA [фирма Sigma-Aldrich, США];

- градиент плотности Ficoll Histopaque [фирма Sigma, США];

- деионизованная вода [Компания «Сигма Тек», Россия].

Для реализации изобретения используют наночастицы:

1. Наночастицы диоксида кремния (SiO2) с размером частиц 5-12 нм

Внешний вид - белый порошок с удельной поверхностью 300±30 m2/g (DIN ISO 9277), гидрофильный, средний размер частиц 7 нм (nm). Торговая марка продукта AEROSIL® 30, производитель - Evonik Degussa GmbH, Германия.

Перед проведением тестов in vitro готовят исходную 1,0%-ную (10 мг/мл) водную суспензию наночастиц диоксида кремния (SiO2). Для приготовления водной суспензии наночастиц используют стерильную деионизованную воду.

2. Наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами серебра (Ag+), с размером частиц 20-200 нм, торговая марка Moonclay®

Наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами серебра (Ag+), получают по способу, согласно патенту RU №2330673 «Способ получения антимикробного препарата» (опубликованному 10.08.2008), разработчик и патентообладатель - ЗАО «Институт прикладной нанотехнологи» (Россия).

Способ получения наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами серебра (Ag+), заключается в модификации неорганического минерала с кремне- и алюмокислородными соединениями, а именно бентонита Na-формы, неорганической солью металла в полярном растворителе.

Перед модификацией бентонит обогащают ионами Na+ путем обработки его 3-10% водным раствором хлористого натрия с последующией промывкой и фильтрованием полученного полуфабриката.

Бентонит модифицируют 10-20% раствором неорганической соли металла, в качестве которого используют нитрат серебра (AgNO3).

Производят выдержку модифицируемого бентонита в указанном солевом растворе в течение 12-24 ч, а затем очистку модифицированного бентонита от солей натрия путем его промывки и фильтрации и после сушки (при температуре не выше 100°С) полученный препарат измельчают до дисперсности частиц 20-150 нм.

Обработку бентонита раствором нитрата серебра (AgNO3) производят при соотношении, вес.ч.: бентонит:раствор, как 1:(10-40).

В качестве бентонита Na-формы используют бентонит Саригюхского месторождения (Армения).

В качестве полярного растворителя используют воду или водно-спиртовой раствор.

Перед проведением тестов in vitro готовят исходную 1%-ную (10 мг/мл) водную суспензию наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами серебра (Ag+). Для приготовления водной суспензии наночастиц использовалась стерильная деионизованная вода.

3. Наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами церия (Ce3+), с размером частиц 20-200 нм

Наночастицы бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами церия (Ce3+), получают при модификации неорганического минерала с кремне- и алюмокислородными соединениями, а именно бентонита Na-формы, неорганической солью металла в полярном растворителе.

Перед модификацией бентонит обогащают ионами Na+ путем обработки его 3-10% водным раствором хлористого натрия с последующей промывкой и фильтрованием полученного полуфабриката.

Бентонит модифицируют 10-20% раствором неорганической соли металла, в качестве которого используют азотнокислую соль церия (Се(NO3)3·6H2O).

Производят выдержку модифицируемого бентонита в указанном солевом растворе в течение 12-24 ч, а затем очистку промодифицированного бентонита от солей натрия путем его промывки и фильтрации и после сушки (при температуре не выше 100°С) полученный препарат измельчают до дисперсности частиц 20-150 нм.

Обработку бентонита раствором азотнокислой солью церия (Се(NO3)3·6H2O) производят при соотношении, вес.ч.: бентонит:раствор, как 1:(10-40).

В качестве бентонита Na-формы используют бентонит Саригюхского месторождения (Армения).

В качестве полярного растворителя используют воду или водно-спиртовой раствор.

Перед проведением тестов in vitro готовят исходную 1%-ную (10 мг/мл) водную суспензию наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного (модифицированного) ионами церия (Се3+). Для приготовления водной суспензии наночастиц использовалась стерильная деионизованная вода.

Заданные по настоящему изобретению исходные 1,0%-ные суспензии тестируемых наночастиц в деионизованной воде наиболее оптимальны по условию образования устойчивых концентрированных дисперсионных систем, необходимых для оценки влияния наночастиц на клетки тест-культур. При увеличении концентрации наночастиц в деионизованой воде возможен процесс осаждения наночастиц, при уменьшении концентрации наночастиц в деионизованой воде усложняется последующий процесс по оценке их биологического влияния на исследуемые клетки тест-культур.

Для проведения тестов in vitro 1,0%-ные водные суспензии наночастиц диоксида кремния (SiO2), наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами серебра (Ag+), наночастиц бентонита (монтмориллонита), интеркалированного ионами церия (Ce3+), добавляют в соответствующие ростовые среды для приготовления суспензий тестируемых наночастиц.

При приготовлении суспензий наночастиц используют исходные 1,0%-ные водные суспензии наночастиц и ростовые среды (α-МЕМ для культуры ММСК и RPMI-1640 для культуры МНК) при их соотношении: 1:100; 1:1000; 1:10000 с получением суспензий наночастиц с концентрацией от 1·10-2 до 1·10-4 мас.%.

Конкретно для получения суспензий вышеназванных наночастиц используют на 10 мл:

- при концентрации наночастиц 1·10-2 мас.%: ростовая среда - 9,9 мл; 1,0%-ная водная суспензия наночастиц - 0,1 мл;

- при концентрации наночастиц 1·10-3 мас.%: ростовая среда - 9,99 мл; 1,0%-ная водная суспензия наночастиц - 0, 01 мл;

- при концентрации наночастиц 1·10-4 мас.%: ростовая среда - 9,999 мл; 1,0%-ная водная суспензия наночастиц - 0,001 мл.

Используемые в среде тест-культур суспензии наночастиц при указанной их концентрации наиболее достоверно определяют процесс влияния тестируемых наночастиц на показатели внутриклеточного метаболизма, что и подтверждается нижеприведенным описанием.

Для реализации изобретения используют клетки тест-культур:

1. Первичные культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК)

ММСК - стромальные клетки-предшественники (называемые также мезенхимальными стволовыми клетками), являются клеточными элементами физиологической тканевой регенерации и репарации тканей. ММСК являются субстратзависимыми (адгезионными) культурами клеток.

ММСК выделяют из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека (из подкожной жировой клетчатки). Для получения первичной культуры ММСК используют способ, изложенный в патенте RU №2351649 «Способ получения культур мезенхимальных стромальных клеток человека, выделенных из липоаспирата» (опубликовано 10.04.2009), разработчик и патентообладатель - ГНЦ РФ «Институт медико-биологических проблем» РАН, и методологию, описанную в работе - Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 2002, Vol.13, pp.4279-4295.

Первоначально жировую ткань дважды отмывают от крови фосфатным буфером. Для этого в центрифужную пробирку помещают жировую ткань и доводят объем пробирки до 50 мл фосфатно-солевым буфером так, чтобы соотношение объема жировой ткани и буфера было 1:2. Полученную смесь центрифугируют в течение 10 мин при ускорении 600 g (1000 об/мин). Затем проводят ферментативную дезагрегацию ткани. Для этого после отмывки жировую ткань взвешивают, добавляют раствор коллагеназы IA до конечной концентрации 0,075% и инкубируют 30 мин на водяной бане при 37°С, периодически встряхивая. Затем фермент инактивируют равным объемом полной ростовой среды, содержащей 10% ФТС, и центрифугируют 10 мин при ускорении 600 g (1000 об/мин).

Получают осадок, представляющий собой стромально-васкулярную фракцию клеток, содержащую ММСК. Осадок ресуспендируют в ростовой среде (α-МЕМ) и пропускают через 100-мкм клеточные фильтры. ММСК из полученной суспензии получают путем их адгезии к пластику. Для этого полученную клеточную суспензию помещают в чашки Петри, плотность посадки составляет 3·103 клеток/см2. Через 24 часа неприкрепившиеся клетки удаляют, первичную культуру промывают фосфатным буфером и добавляют свежую полную среду роста (α-МЕМ + 10% ФТС (FBS)). После достижения 80-90% конфлуентности (степени смыкания монослоя клеток) ММСК пассируют. В исследовании используют клетки 2-4 пассажей.

При субкультивировании полученные ММСК рассаживают в культуральные флаконы с ростовой средой (α-МЕМ + 10% ФТС (FBS)) с плотностью 2·104 клеток/см2 и после достижения 70-80% конфлуентности (степени смыкания монослоя клеток) в них вводят суспензии тестируемых наночастиц.

Клетки без наночастиц, инкубировавшиеся в тех же условиях, используют для определения исходных (контрольных) значений изучаемых показателей.

После 24 часов инкубации готовят пробы для анализа исследуемых показателей (см. ниже).

2. Первичные культуры мононуклеарных клеток крови (МНК) - лимфоциты

МНК - дифференцированные клетки, определяющие иммунный ответ организма на чужеродные воздействия. МНК являются суспензионными культурами клеток.

Лимфоциты (лейкоциты) выделяют из периферической крови человека (здоровых доноров) методом центрифугирования. Процесс получения культуры мононуклеарных клеток крови (МНК) осуществляют по Протоколу фирмы Amersham BioSciences (UK).

Для этого кровь, собранную в пробирки с 3,8% раствором цитрата натрия, центрифугируют 25 мин при ускорении 1800 g (3000 об/мин). Плазму крови сливают, к форменным элементам добавляют фосфатный буфер до исходного объема крови и тщательно ресуспендируют. Полученную суспензию аккуратно наслаивают на Ficoll Pague Plus в соотношении 2,5:1 и центрифугируют 40 мин при 1800 g (3000 об/мин). Интерфазное кольцо, представленное мононуклеарной фракцией клеток крови, собирают и отмывают трижды в фосфатном буфере.

После выделения МНК по Протоколу, описанному выше, подсчитывают количество клеток в гемацитометре, ресуспендируют в ростовой среде RPMI-1640 + 5% ФТС (FBS) из расчета 1×106 клеток/мл, в которые вводят суспензии исследуемых наночастиц. Систему инкубируют 24 часа.

МНК представляют собой суспензионную культуру, в которой клетки достаточно быстро седиментируют на дно культурального флакона. В связи с этим для улучшения контакта клеток с тестируемыми наночастицами порядок инкубации МНК с наночастицами осуществляют в термостате (37°С) на горизонтальном шейкере, обеспечивающем непрерывное перемешивание среды.

Клетки тест-культур без наночастиц, инкубировавшиеся в тех же условиях, используют для определения исходных значений изучаемых показателей. После окончания инкубации готовят пробы для анализа исследуемых показателей (см. ниже).

Для реализации изобретения используют известные при цитологических исследованиях методы и тесты для измерения исследуемых показателей:

1. Метод проточной цитофлуориметрии

Измерение показателей, выбранных для оценки влияния наночастиц на состояние системы клеточных органелл, проводится методом проточной цитофлуориметрии.

Метод проточной цитофлуориметрии основан на пропускании суспензии клеток по капилляру через зону чувствительности прибора, скорость прохождения клеток через капилляр около 1000 клеток/сек, в зоне чувствительности прибора находится не более одной клетки, клетки поочередно пересекают сфокусированный луч света, который используется для возбуждения флуоресценции. При помощи светочувствительных датчиков (фотодиодов и фотоэлектронных умножителей) регистрируются поглощение и рассеивание света (прямое светорассеяние под углом 0,5-2° и угловое (боковое) светорассеяние под углом 90°) клеткой, а также флуоресценция маркеров (красителей), связанных с клеткой. Используется проточный цитофлуориметр Beckman Coulter Epics XL (США).

Полученная информация представляется в виде частотных гистограмм распределения, которые представлены на приведенных в описании рисунках.

2. Оценка цитотоксичности по жизнеспособности клеток методом МТТ-теста и способом маркировки пропидием-йодида (PI)

При тестировании оценивают количество живых клеток (при воздействии наночастиц). Принцип метода МТТ-теста (Протокол фирмы Invitrogen (Molecular Probes), США) основан на способности фермента сукцинатдегидрогеназы митохондриальной мембраны клеток млекопитающих восстанавливать желтую соль 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана фиолетового цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток. По интенсивности накопления кристаллов формазана в цитоплазме судят об уровне митохондриального дыхания клетки, что является показателем ее жизнеспособности. Количество образуемого формазана в клеточном монослое пропорционально имеющемуся количеству живых клеток. Формазан экстрагируется из клеток апротонным растворителем ДМСО - диметилсульфоксидом ((СН3)2SO). Интенсивность окраски раствора пропорциональна количеству живых клеток и определяется колориметрически.

Непосредственно перед использованием готовят рабочий раствор МТТ (1,5 мг/мл 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) на ростовой среде. Клетки инкубируют 2 часа в рабочем растворе МТТ в стандартных условиях (+37°С, 5% CO2). Останавливают реакцию удалением раствора, добавляют ДМСО и помещают клетки на 15 минут на шейкер при 150 об/мин. Интенсивность окраски измеряют на спектрофотометре при λ=540 нм.

Метод МТТ-теста рассчитан на исследование адгезионных клеточных культур, поэтому метод по настоящему изобретению используется для исследования мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК).

Первичная культура мононуклеарных клеток крови (МНК) - лимфоцитов представляет собой суспензию клеток, что усложняет оценку цитотоксичности наночастиц с помощью стандартного МТТ-теста. В связи с этим цитотоксичность оценивают, выявляя живые МНК с помощью маркировки (окраски) клеток пропидием-йодида (PI). Результаты окрашивания МНК оценивают на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (США).

3. Выявление нарушений функций митохондрий клеток

Нарушения функций митохондрий клеток, согласно Протоколу фирмы Invitrogen (Molecular Probes), CШA, выявляют по изменению трансмембранного потенциала митохондрий (ΔΨm) тестируемых клеток с помощью флуоресцентного потенциалзависимого маркера (красителя) МитоТрекер Красный (MitoTracker Red 580) (λвозбуждения=581 нм, λиспускания=644 нм) с определением количества окрашенных клеток и средней интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре. МитоТрекер в конечной концентрации 0,5 мМ добавляют к исследуемым клеткам тест-культур соответственно, содержащих суспензии с тестируемыми наночастицами, и к контрольным образцам исследуемых клеток тест-культур, не содержащих наночастицы. В стандартных условиях (+37°С, 5% CO2) исследуемые образцы инкубируют в течение 1 час, затем трижды отмывают ФСБ, снимают с пластика раствором трипсина - ЭДТА, суспензию центрифугируют 10 мин при 500 g, осадок ресуспендируют в ФСБ и анализируют на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (США).

4. Выявление производства активных форм кислорода (АФК) в клетках

Для выявления производства АФК в клетках при воздействии наночастиц, согласно Протоколу фирмы Invitrogen (Molecular Probes), США, используют флуоресцентный маркер - дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) (10 мкг/мл) с определением количества окрашенных клеток и интенсивности флуоресценции на проточном цитофлуориметре. H2DCF-DA представляет собой бесцветный эфир, который при взаимодействии с АФК превращается во флуоресцирующий продукт - H2DCF. Этот продукт визуализируется и по интенсивности его флуоресценции оценивают количество АФК в клетках. При исследовании внутриклеточного уровня АФК добавляли H2DCF-DA в клеточную среду культивирования за 30 минут до проведения определения уровня АФК, затем клетки дважды промывали средой с сывороткой.

Для анализа на проточном цитофлуориметре мононуклеарные клетки крови (МНК) - лимфоциты ресуспендировали в фосфатном буфере.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) открепляли от пластика раствором трипсина - ЭДТА. Суспензии центрифугировали 10 мин при ускорении 500 g, осадок ресуспендировали в фосфатном буфере.

Методом проточной цитофлуориметрии определяют производство активных форм кислорода (АФК) в клетках после воздействия наночастиц.

5. Определение состояния лизосомального компартмента клеток

Принцип компартментализации клеток свидетельствет о том, что биохимические процессы в клетке локализованы в определенных отсеках - компартментах. Большинство органоидов в клетках являются компартментами, в т.ч. лизосомы.

Выявление лизосом в клетках (при воздействии наночастиц) и оценку интенсивности флуоресценции (свидетельствующей об активности лизосом) проводят с использованием флуоресцентного рН-зависимого маркера (красителя) LysoTracker Green DND-26 (λвозбуждения=504 нм, λиспускания=511 нм) в рабочей концентрации 50 нМ, согласно Протоколу фирмы Invitrogen (Molecular Probes), США. Клетки инкубируют с ЛизоТрекером 1 час в стандартных условиях (+37°С, 5% CO2) и анализируют на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter Epics XL (США).

6. Выявление соотношения апоптотических и некротических клеток

Для оценки воздействия наночастиц на клетки применяется набор маркеров (красителей) Aimexin V (аннексии V-FITC, пропидий-йодид (PI), связывающий буфер), позволяющий выявлять одновременно апоптотические и некротические клетки, согласно Протоколу фирмы Immunotech, Франция. Аннексии V в присутствии ионов Ca2+ и Mg2+ взаимодействует с фосфатидилсерином, который на ранних стадиях апоптоза переходит с внутренней мембраны клетки на наружную. Клеточная мембрана живых клеток непроницаема для пропидий-йодида (PI). Однако при необратимом повреждении клетки (некроз) пропидий-йодид проходит через клеточную мембрану и взаимодействует с малой бороздкой дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Двойное окрашивание аннексином V и пропидий-йодидом свидетельствует о поздних стадиях апоптоза.