Набор реагентов для анализа образца и способ анализа образца

Набор реагентов для анализа образца и способ анализа образца

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к набору реагентов и к способу анализа клеток крови в биологическом образце.

Уровень техники

В области лабораторных тестов анализ компонентов крови в образцах является очень важным, когда диагностируются различные заболевания циркуляторных органов или чего-либо подобного у субъектов. В зависимости от типа заболеваний количество конкретных клеток крови может увеличиваться или уменьшаться или клетки крови, которые обычно не существуют в ней, появляются в периферической крови в некоторых случаях.

В последнее время на рынке появились различные автоматические счетчики клеток крови, в которых применяются принципы проточной цитометрии. При использовании таких автоматических счетчиков клеток крови клетки крови в образцах могут автоматически классифицироваться и подсчитываться.

Обычно лейкоциты могут классифицироваться как пять видов: лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Среди них количество базофилов, содержащихся в образцах крови, является малым. По этой причине точность классификации может быть улучшена посредством измерения базофилов в образцах крови с помощью обработки, эксклюзивной по отношению к измерению базофилов, по сравнению с измерением базофилов с помощью способа, в котором лейкоциты классифицируются как пять видов и базофилы измеряют за одно измерение. Базофилы имеют специфичную характеристику, такую, что они меньше повреждаются при кислотных условиях по сравнению с другими типами лейкоцитов. Дискриминация базофилов от других типов лейкоцитов с помощью обработки, эксклюзивной по отношению к базофилам, посредством использования таких характеристик описана в публикации нерассмотренной заявки на патент Японии № SHO 61(1986)-88896 (патентный документ 1) и нерассмотренной заявки на патент Японии № HEI 7(1995)-294518 (патентный документ 2).

Возникновение нуклеированных эритроцитов иногда вызывает проблемы при измерении лейкоцитов. Нуклеированные эритроциты имеют ядра. При измерении лейкоцитов, даже когда эритроциты обрабатывают с целью лизирования, ядра нуклеированных эритроцитов по-прежнему вызывают сигнал, сходный с лейкоцитами, давая ложную положительную ошибку при измерении количества лейкоцитов. Для устранения этого эффекта и получения точного количества лейкоцитов образец крови обрабатывают с помощью обработки, эксклюзивной по отношению к нуклеированным эритроцитам, для измерения количества нуклеированных эритроцитов, количество лейкоцитов в том же образце крови измеряют с помощью другого способа, а затем количество нуклеированных эритроцитов вычитают из полученного количества лейкоцитов. Публикация нерассмотренной заявки на патент Японии № HEI 10(1998)-339729 (патентный документ 3) описывает дискриминацию нуклеированных эритроцитов от лейкоцитов посредством применения обработки, эксклюзивной по отношению к нуклеированным эритроцитам, к образцам крови.

Однако необходимость обработки, эксклюзивной по отношению к соответствующим клеткам крови, как описано в указанных выше патентных документах 1-3, для классификации базофилов или нуклеированных эритроцитов требует длительного времени и, кроме того, усложняет измерительное устройство или увеличивает его размеры. В дополнение к этому, использование множества реагентов, эксклюзивных по отношению к соответствующим клеткам крови, делает слишком высокой стоимость исследования крови в целом. Соответственно, является предпочтительным, чтобы обработки, эксклюзивной по отношению к клеткам крови, было настолько мало, насколько это возможно.

Как базофилы, так и нуклеированные эритроциты могут измеряться посредством обработки образцов крови при кислотных условиях. По этой причине имеется возможность того, что как базофилы, так и нуклеированные эритроциты смогут измеряться за одно измерение, когда образец крови обрабатывают при кислотных условиях. Публикация нерассмотренной заявки на патент Японии № 2002-148261 (патентный документ 4) описывает, что базофилы и эритробласты (нуклеированные эритроциты) могут измеряться посредством смешивания образца с водным раствором, содержащим поверхностно-активное вещество и агент для лизирования эритроцитов, что позволяет лейкоцитам и аномальным клеткам находиться в состоянии, пригодном для окрашивания, с добавлением окрашивающего агента, содержащего флуоресцентный краситель, для окрашивания клеток и измерения интенсивности флуоресценции и интенсивности рассеянного света с помощью проточного цитометра.

Описание изобретения

Проблемы, которые решает изобретение

Однако при использовании способа, описанного в патентном документе 4, базофилы не отделяются должным образом от лейкоцитов, иных чем базофилы, в особенности в образце крови, для которого прошло некоторое время после его сбора, в некоторых случаях.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание набора реагентов и способа измерения образца, которые позволяют подсчет и более четкую дискриминацию нуклеированных эритроцитов и базофилов от других типов лейкоцитов в образце.

Средства решения проблем

Настоящее изобретение представляет собой набор реагентов для анализа образца для измерения базофилов и/или нуклеированных эритроцитов в образце, содержащий

первый реагент, содержащий катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, которая может лизировать эритроциты и повреждать клеточную мембрану лейкоцитов, так что флуоресцентный краситель может проникать через нее, и

второй реагент, содержащий флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту.

Кроме того, настоящее изобретение представляет собой способ анализа образца, включающий следующие стадии:

лизирования эритроцитов в образце и повреждения клеточной мембраны клеток крови, с тем чтобы флуоресцентный краситель мог проникать через нее, посредством указанного выше первого реагента, и окрашивания поврежденных клеток посредством указанного выше второго реагента,

приложения света к окрашенным клеткам с получением информации от рассеянного света и информации от флуоресценции и

классификации и подсчета базофилов и/или нуклеированных эритроцитов в образце на основе информации от рассеянного света и информации от флуоресценции.

Результат изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, нуклеированные эритроциты и базофилы могут дискриминироваться более четко от других клеток крови и могут подсчитываться даже в образце крови, для которого прошло некоторое время после его сбора, что делает возможными более точные исследования и диагностику заболеваний. Хотя настоящее изобретение делает возможным подсчет нуклеированных эритроцитов и базофилов за одно измерение, в некоторых случаях может оказаться достаточным измерение любого объекта из нуклеированных эритроцитов и базофилов, в зависимости от цели исследования. В таком случае настоящее изобретение также позволяет проводить такие измерения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой схематическую форму диаграммы рассеяния, когда образец анализируют с использованием реагента для анализа образца по настоящему изобретению.

Фиг.2 представляет собой схематическую форму диаграммы рассеяния, когда образец анализируют с использованием реагента для анализа образца по настоящему изобретению.

Фиг.3 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 1.

Фиг.4 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 1.

Фиг.5 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 2.

Фиг.6 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 2.

Фиг.7 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 3.

Фиг.8 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 3.

Фиг.9 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 3.

Фиг.10 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 3.

Фиг.11 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 4.

Фиг.12 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 4.

Фиг.13 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 4.

Фиг.14 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 4.

Фиг.15 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 5.

Фиг.16 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 5.

Фиг.17 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 5.

Фиг.18 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 6.

Фиг.19 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 6.

Фиг.20 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 6.

Фиг.21 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 7.

Фиг.22 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 7.

Фиг.23 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 8.

Фиг.24 показывает вид примерного набора реагентов по настоящему изобретению. A: второй реагент и B: первый реагент.

Фиг.25 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 9.

Фиг.26 представляет собой диаграммы рассеяния, когда образцы анализируют с использованием реагентов для анализа образца в примере 9.

Фиг.27 показывает графики, представляющие корреляцию между результатами анализа образца с использованием реагентов для анализа образца из примера 9 и результатами анализа образца с использованием обычного способа анализа образца. (A) Корреляция количества лейкоцитов в целом; (B) корреляция отношения базофилов и (C) корреляция отношения нуклеированных эритроцитов.

Наилучший способ осуществления изобретения

Базофилы представляют собой один из видов лейкоцитов и имеют большие кислотные гранулы, которые окрашиваются основными красителями. Нуклеированные эритроциты также обычно называют эритробластами, и они включают в себя проэритробласты, базофильные эритробласты, полихроматофильные эритробласты и ортохроматофильные эритробласты.

Как используется в настоящем документе, "образец" относится к образцу жидкости, отобранной из организма у млекопитающих, предпочтительно у людей включая кровь, спинномозговую жидкость, мочу, образец, отобранный при аферезе, и тому подобное.

Авторы настоящего изобретения, в результате обширных исследований, обнаружили, что нуклеированные эритроциты и базофилы могут более четко дискриминироваться от других типов лейкоцитов посредством использования первого реагента, содержащего катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, и второго реагента, содержащего флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту.

В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, набор реагентов для анализа образца представляет собой набор реагентов, содержащий первый реагент, содержащий катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, и второй реагент, содержащий флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту. Посредством обработки образца первым реагентом, содержащим катионное поверхностно-активное вещество, неионное поверхностно-активное вещество и ароматическую карбоновую кислоту, эритроциты в образце могут лизироваться, и клеточные мембраны лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов могут повреждаться до такой степени, что флуоресцентный краситель может проникать через мембраны. Благодаря этому лейкоциты, иные чем базофилы, и нуклеированные эритроциты повреждаются на клеточных мембранах и сморщиваются или генерируют голые ядра, в то время как базофилы меньше повреждаются на клеточных мембранах, чем лейкоциты, иные чем базофилы, и нуклеированные эритроциты. По этой причине считается, что базофилы сморщиваются меньше по сравнению с лейкоцитами, иными чем базофилы, и нуклеированными эритроцитами. Соответственно, базофилы могут дискриминироваться от лейкоцитов, иных чем базофилы, и нуклеированных эритроцитов на основе различий в размере или форме клеток. Кроме того, посредством обработки образца вторым реагентом, содержащим флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту, нуклеированные эритроциты могут дискриминироваться от лейкоцитов, иных чем базофилы, и базофилов на основе различий в свойствах окрашивания флуоресцентным красителем.

Катионное поверхностно-активное вещество может лизировать эритроциты и повреждать клеточные мембраны лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов. Катионное поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой тип соли четвертичного аммония или соли пиридиния. Катионное поверхностно-активное вещество типа соли четвертичного аммония предпочтительно представляет собой соль четвертичного аммония, имеющую следующую общую формулу (III):

В указанной выше формуле (III) R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ могут быть одинаковыми или различными и представляют собой атом водорода, C_1-8 алкильную группу или C_6-8 аралкильную группу. R¹⁶ представляет собой C_8-18 алкильную группу, C_8-18 алкенильную группу или C_6-18 аралкильную группу. X^- представляет собой анион.

C_1-8 алкильная группа для R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ включает в себя метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил и тому подобное. C_6-8 аралкильная группа для R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ включает в себя бензил, фенэтил и тому подобное. Предпочтительно, R¹³, R¹⁴ и R¹⁵ представляют собой C_1-8 алкильную группу, такую как метил, этил и тому подобное.

C_8-18 алкильная группа для R¹⁶ включает в себя октил, децил, додецил, тетрадецил и тому подобное. C_8-18 алкенильная группа для R¹⁶ включает в себя октенил, деценил, олеил и тому подобное. C_6-18 аралкильная группа для R¹⁶ включает в себя бензил, фенэтил и тому подобное. Предпочтительно, R¹⁶ представляет собой C_10-18 алкильную группу с прямой цепью, такую как децил, додецил, тетрадецил и тому подобное.

Анион X^- включает в себя ионы галогена, такие как F^-, Cl^-, Br^- и I^-, CF₃SO₃-, BF₄ ^-, ClO₄ ^- и тому подобное.

Катионное поверхностно-активное вещество типа соли пиридиния предпочтительно представляет собой соль пиридиния, имеющую следующую формулу (IV):

В указанной выше формуле (IV) R¹⁷ представляет собой C_8-18 алкильную группу. X^- представляет собой анион.

C_8-18 алкильная группа включает в себя C_10-18 алкильную группу с прямой цепью, такую как децил, додецил, тетрадецил и тому подобное. Анион X^- включает в себя ионы галогена, такие как F^-, Cl^-, Br^- и I^-, CF₃SO₃ ^-, BF₄ ^-, ClO₄ ^- и тому подобное.

Конкретные примеры катионного поверхностно-активного вещества включают в себя децилтриметиламмоний бромид, додецилтриметиламмоний хлорид, октилтриметиламмоний бромид, октилтриметиламмоний хлорид, лаурилтриметиламмоний бромид, лаурилтриметиламмоний хлорид, миристилтриметиламмоний бромид, миристилтриметиламмоний хлорид, лаурилпиридиний хлорид и тому подобное.

Катионное поверхностно-активное вещество используют при концентрации, которая является достаточной для лизирования эритроцитов и повреждения клеточных мембран лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов. Такая предпочтительная концентрация может легко определяться, например, с помощью наблюдения состояния клеточных мембран или чего-либо подобного под обычным оптическим микроскопом. Конкретно, концентрация катионного поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет от 300 до 9000 мг/л, более предпочтительно от 400 до 8000 мг/л, а наиболее предпочтительно от 500 до 7000 мг/л. Однако концентрация может регулироваться соответствующим образом в соответствии с типом используемого катионного поверхностно-активного вещества.

Когда концентрация катионного поверхностно-активного вещества является слишком низкой, точная дискриминация между базофилами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях может быть невозможной. Причиной этого считается то, что лейкоциты не повреждаются в достаточной степени, когда концентрация катионного поверхностно-активного вещества является слишком низкой, так что различие по размеру или форме между базофилами и лейкоцитами, иными чем базофилы, является маленьким. С другой стороны, когда концентрация катионного поверхностно-активного вещества является слишком высокой, точная дискриминация между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях может быть невозможной. Причиной этого считается то, что клеточные мембраны, в частности, нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов, иных чем базофилы, чрезмерно повреждаются, когда концентрация катионного поверхностно-активного вещества является слишком высокой, так что точная дискриминация между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, является невозможной. Соответственно, когда концентрация находится в указанном выше диапазоне, эритроциты могут эффективно лизироваться без чрезмерного повреждения клеточных мембран лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов. Способность к гемолизу для катионного поверхностно-активного вещества зависит от длины основной цепи. Катионные поверхностно-активные вещества, имеющие длинную основную цепь, имеют большую способность к гемолизу, обеспечивая, таким образом, достаточное воздействие при меньшем количестве по сравнению с теми, которые имеют короткую цепь.

В образце крови, для которого прошло некоторое время после его сбора, клетки крови, такие как лейкоциты, склонны к повреждениям из-за их морфологических изменений. Когда для такого образца используют катионное поверхностно-активное вещество, клеточные мембраны, в частности, нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов, иных чем базофилы, чрезмерно повреждаются, так что точная дискриминация между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях является невозможной. В таких случаях использование неионного поверхностно-активного вещества вместе с катионным поверхностно-активным веществом позволяет более точную дискриминацию между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, посредством подавления чрезмерного повреждения лейкоцитов и тому подобное. Неионное поверхностно-активное вещество предпочтительно представляет собой простой полиоксиэтиленалкиловый эфир, простой полиоксиэтиленполиоксипропиленалкиловый эфир, полиоксиэтиленкасторовое масло, гидрированное полиоксиэтиленкасторовое масло, полиоксиэтиленстерин или гидрированный полиоксиэтиленстерин.

Неионное поверхностно-активное вещество типа простого полиоксиэтиленалкилового эфира предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (V):

R ¹⁸ -O-(CH ₂ CH ₂ O) _n -H (V)

В указанной выше формуле R¹⁸ представляет собой C_12-22 алкильную группу или C_12-22 алкенильную группу. n равно 10-30.

Неионное поверхностно-активное вещество типа простого полиоксиэтиленполиоксипропиленалкилового эфира предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (VI):

В указанной выше формуле R¹⁹ представляет собой C_10-30 алкильную группу или C-алкенильную группу. m равно 1-10. n равно 10-30.

Неионное поверхностно-активное вещество типа полиоксиэтиленкасторового масла предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (VII):

В указанной выше формуле сумма k, n, m, x, y и z равна 10-60.

Неионное поверхностно-активное вещество типа гидрированного полиоксиэтиленкасторового масла предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (VIII):

В указанной выше формуле сумма k, n, m, x, y и z равна 10- 60.

Неионное поверхностно-активное вещество типа полиоксиэтиленстерина предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (IX):

В указанной выше формуле n равно 10-30.

Неионное поверхностно-активное вещество типа гидрированного полиоксиэтиленстерина предпочтительно представляет собой соединение, имеющее следующую формулу (X) или (XI):

где n равно 20-30;

где n рано 20-30;

C_12-22 алкильная группа включает в себя додецил, гексадецил и подобные группы. C_12-22 алкенильная группа включает в себя олеил и подобные группы. Когда n в указанных выше формулах (V), (VI) и (IX)-(XI) является слишком малым, мембраны клеток крови чрезмерно повреждаются, а когда n является слишком большим, мембраны клеток крови не повреждаются в достаточной степени. Подобным же образом, когда сумма k, n, m, x, y и z в указанных выше формулах (VII) и (VIII) является слишком малой, мембраны клеток крови чрезмерно повреждаются, а когда она является слишком большой, мембраны клеток крови не повреждаются в достаточной степени.

Неионное поверхностно-активное вещество конкретно включает в себя простой полиоксиэтилен(16) олеиловый эфир, простой полиоксиэтилен(20) цетиловый эфир, простой полиоксиэтилен(20) полиоксипропилен(8) цетиловый эфир, простой полиоксиэтилен(30) полиоксипропилен(6) децилтетрадециловый эфир, полиоксиэтилен(20) касторовое масло, гидрированное полиоксиэтилен(20) касторовое масло, гидрированное полиоксиэтилен(50) касторовое масло, полиоксиэтилен(25) фитостанол и тому подобное. Среди них особенно предпочтительными являются простой полиоксиэтилен(16) олеиловый эфир и простой полиоксиэтилен(20) полиоксипропилен(8) цетиловый эфир.

Концентрация неионного поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет от 500 до 7000 мг/л, более предпочтительно от 800 до 6000 мг/л, а наиболее предпочтительно от 1000 до 5000 мг/л. Однако концентрация может регулироваться соответствующим образом в соответствии с типом используемого неионного поверхностно-активного вещества.

Когда концентрация неионного поверхностно-активного вещества является слишком низкой, точная дискриминация, в частности, между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях может быть невозможной, поскольку чрезмерное повреждение клеточных мембран лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов с помощью катионного поверхностно-активного вещества не может быть подавлено. С другой стороны, когда концентрация неионного поверхностно-активного вещества является слишком высокой, точная дискриминация, в частности, между базофилами и лейкоцитами, иными чем базофилы, может быть невозможной в некоторых случаях, поскольку повреждение с помощью катионного поверхностно-активного вещества клеточных мембран лейкоцитов и нуклеированных эритроцитов подавляется. Соответственно, когда концентрация находится в указанном выше диапазоне, нуклеированные эритроциты и лейкоциты, иные чем базофилы, могут точно дискриминироваться, даже для образца крови, для которого прошло некоторое время после его сбора.

Первый реагент предпочтительно содержит, по меньшей мере, одну карбоновую кислоту, имеющую, по меньшей мере, одно ароматическое кольцо в молекуле (далее упоминается в настоящем документе как "ароматическая карбоновая кислота") или ее соль. Посредством использования ароматической карбоновой кислоты эритроциты могут эффективно лизироваться за короткое время.

Когда при измерениях используют первый реагент без ароматической карбоновой кислоты, в некоторых случаях базофилы детектируются в слишком высоких количествах, в зависимости от образцов крови. Причина для этого слишком высокого значения неизвестна, однако можно предположить, что клетки крови, иные чем базофилы, или другие компоненты в образцах крови имеют размер, форму или интенсивность флуоресценции, сходную с базофилами. Посредством исследования образцов крови с помощью первого реагента, содержащего ароматическую карбоновую кислоту, такие явления слишком высокого значения могут предотвращаться.

Используемая ароматическая карбоновая кислота произвольным образом выбирается из органических кислот, имеющих, по меньшей мере, одно ароматическое кольцо в молекуле, или их солей. Предпочтительная ароматическая карбоновая кислота включает в себя салициловую кислоту, фталевую кислоту, бензойную кислоту, гидроксибензойную кислоту, аминобензойную кислоту и их соли.

Концентрация ароматической карбоновой кислоты или ее соли в первом реагенте не является конкретно ограниченной, пока pH первого реагента находится в пределах, описанных ниже, и предпочтительно составляет от 0,1 до 100 мМ, а более предпочтительно от 0,5 до 50 мМ.

Когда концентрация ароматической карбоновой кислоты является слишком низкой, точная дискриминация базофилов может быть невозможной, поскольку указанное выше воздействие не прикладывается в достаточной степени. С другой стороны, когда концентрация ароматической карбоновой кислоты является слишком высокой, точная дискриминация между нуклеированными эритроцитами и лейкоцитами, иными чем базофилы, в некоторых случаях может быть невозможной. Соответственно, когда концентрация находится в указанных выше диапазонах, нуклеированные эритроциты и базофилы точно дискриминируются от других клеток крови.

Когда образец обрабатывают первым реагентом, эритроциты предпочтительно лизируются, что мешает измерению нуклеированных эритроцитов и базофилов. Как правило, клеточные мембраны эритроцитов прорываются при осмотическом давлении примерно 150 мОсм/кг или ниже и становятся оптически прозрачными после утечки гемоглобина из внутреннего пространства эритроцитов (гемолиза). Оптически прозрачные эритроциты существенно не мешают измерению с использованием проточной цитометрии. Условия с низким осмотическим давлением и низким pH являются предпочтительными для лизиса эритроцитов. Осмотическое давление, удовлетворяющее двум этим требованиям, составляет от 20 мОсм/кг до 150 мОсм/кг. При установлении осмотического давления первого реагента в этом диапазоне эритроциты могут эффективно лизироваться, что мешает измерению нуклеированных эритроцитов и базофилов.

Базофилы имеют ту характеристику, что их трудно разрушить по сравнению с другими лейкоцитами при кислотных условиях. Соответственно, pH первого реагента предпочтительно составляет от 2,0 до 4,5, более предпочтительно от 2,0 до 3,5. В этом диапазоне pH гранулы базофилов являются стабильными. В дополнение к этому в этом диапазоне pH эритроциты могут эффективно лизироваться без чрезмерного влияния на лейкоциты, нуклеированные эритроциты и тому подобное. Благодаря этому рассеяние света и флюоресценция от эритроцитов без ядра может быть низкой, так что эритроциты по существу не влияют на измерения нуклеированных эритроцитов и лейкоцитов.

pH первого реагента может устанавливаться с помощью буферного агента. Предпочтительный буферный агент представляет собой такой буферный агент, который имеет pKa в пределах ±2,0 от желаемого pH и включает в себя, например, яблочную кислоту, винную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту, дигликолевую кислоту и тому подобное. Концентрация буферного агента в первом реагенте не является конкретно ограниченной, постольку поскольку может поддерживаться указанный выше диапазон значений pH.

Кроме того, удобно объединять ароматическую карбоновую кислоту и буферный агент, поскольку могут быть улучшены рабочие характеристики дискриминации нуклеированных эритроцитов. Сочетание буферного агента и ароматической карбоновой кислоты включает в себя, например, яблочную кислоту и салициловую кислоту или ее соль, яблочную кислоту и фталевую кислоту или ее соль, лимонную кислоту и салициловую кислоту или ее соль, лимонную кислоту и фталевую кислоту или ее соль, яблочную кислоту и бензойную кислоту или ее соль, яблочную кислоту и фталевую кислоту или ее соль и бензойную кислоту или ее соль.

Для установления осмотического давления первого реагента в пределах, пригодных для лизирования эритроцитов, может использоваться электролит, такой как NaCl, KCl или сахарид. Осмотическое давление может также устанавливаться с помощью концентрации буферного агента.

Первый реагент может быть получен посредством растворения поверхностно-активных веществ и ароматической карбоновой кислоты или ее соли, а также необязательного буферного агента в соответствующем растворителе, так что могут быть получены указанные выше концентрации, и необязательного установления pH с помощью NaOH, HCl или чего-либо подобного. Соответствующий растворитель не является конкретно ограниченным, постольку поскольку он может растворять указанные выше компоненты и включает в себя, например, воду, органические растворители, их смеси и тому подобное. Органические растворители включают в себя спирты, этиленгликоль и диметилсульфоксид (далее упоминаемый как "ДМСО").

Второй реагент содержит флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту. Когда клетки крови, обработанные первым реагентом, окрашиваются флуоресцентным красителем, способным окрашивать нуклеиновую кислоту, лейкоциты интенсивно окрашиваются и испускают интенсивную флюоресценцию. С другой стороны, нуклеированные эритроциты слабо окрашиваются и испускают слабую флюоресценцию. Благодаря различию в склонности к окрашиванию флуоресцентным красителем нуклеированные эритроциты могут дискриминироваться от базофилов или лейкоцитов, иных чем базофилы. Механизм получения различий в интенсивности флуоресценции между лейкоцитами и нуклеированными эритроцитами не выяснен, однако это может происходить потому, что инкорпорирование красителя в ядро клетки ингибируется из-за конденсации ядра (ДНК) нуклеированных эритроцитов.

Флуоресцентный краситель не является конкретно ограниченным, постольку поскольку он может окрашивать нуклеиновую кислоту, и включает в себя красители, которые обычно используют в данной области. Флуоресцентный краситель, содержащийся во втором реагенте, включает в себя флуоресцентные красители следующих формул (I) и (II):

где R¹ и R² являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой алкильную группу;

R³, R⁴, R⁵ и R⁶ являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой атом водорода или алкильную группу; и X^- представляет собой анион;

где R⁷ и R⁸ являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой алкильную группу, необязательно содержащую кислотную группу;

и R⁹, R¹⁰, R¹¹ и R¹² являются одинаковыми или отличными друг от друга и представляют собой атом водорода или кислотную группу, при условии что любой из R⁷-R¹² представляет собой/имеет кислотную группу; и кислотная группа, которая может присутствовать в R⁷-R¹², может образовывать соль, при условии что любая из кислотных групп, которые могут присутствовать в R⁷-R¹², представляет собой группу, из которой высвобождается протон.

В настоящем описании алкильная группа в указанных выше формулах (I) и (II) может иметь либо прямую цепь, либо разветвленную цепь. Количество атомов углерода в алкильной группе, как правило, составляет 1-20, а предпочтительно 1-10. Более предпочтительно, с точки зрения растворимости в воде флуоресцентного красителя оно равно 1-6. Предпочтительные примеры алкильной группы включают в себя метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил и тому подобное.

X^- в формуле (I) включает в себя ионы галогена, такие как F^-, Cl^-, Br^-- и I^-, CF₃SO₃ ^-, BF₄ ^-, ClO₄ ^- и тому подобное.

Как используется в настоящем описании, кислотная группа, которая может присутствовать в формуле (II), включает в себя как группу, способную к высвобождению протона, так и группу, способную к высвобождению группы, из которой высвобождается протон. Группа, способная к высвобождению протона, включает в себя карбоксильную, сульфоновую, фосфорную или сходную группу, а предпочтительно представляет собой сульфоновую группу.

Кислотная группа может образовывать соль. Соль включает в себя соль щелочных металлов, таких как натрий, калий или сходную соль. Предпочтительной является соль натрия.

Используемый флуоресцентный краситель формул (I) и (II) может принадлежать к одному или нескольким видам. Флуоресцентный краситель может быть получен от Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.

Концентрация красителя в реагенте для анализа образца по настоящему изобретению может выбираться соответствующим образом в соответствии с типом красителя и, как правило, составляет от 0,01 до 100 мг/л, предпочтительно от 0,1 до 10 мг/л, а более предпочтительно от 0,2 до 6,0 мг/л.

Флуоресцентный краситель формул (I) и (II), содержащийся во втором реагенте, интенсивно окрашивает лейкоциты, поскольку он имеет более высокое сродство по отношению к лейкоцитам, чем к нуклеированным эритроцитам. Соответственно, на основе различий во флюоресценции, испускаемой клетками, окрашенными флуоресцентным красителем, нуклеированные эритроциты могут более точно дискриминироваться от лейкоцитов, иных чем базофилы, и от базофилов.

Второй реагент может быть получен посредством растворения флуоресцентного красителя в соответствующем растворителе, так что может быть получена указанная выше концентрация. Соответствующий растворитель не является конкретно ограниченным, постольку поскольку он может растворять флуоресцентный краситель, и включает в себя воду, органические растворители, их смесь и тому подобное. Органические растворители включают в себя спирты, этиленгликоль, ДМСО и тому подобное. Некоторые флуоресцентные красители имеют низкую долговременную стабильность в водных растворах, и в таких случаях они предпочтительно раств