Полипептид, способный блокировать рецептор клеточной поверхности ccr5 и/или вызывать интернализацию и/или подавляющую регуляцию ccr5 в клетке-мишени, кодирующая его нуклеиновая кислота, клетка-хозяин, применение (варианты), фармацевтическая композиция и способ лечения или профилактики вич-инфекции у пациента (варианты)

Полипептид, способный блокировать рецептор клеточной поверхности ccr5 и/или вызывать интернализацию и/или подавляющую регуляцию ccr5 в клетке-мишени, кодирующая его нуклеиновая кислота, клетка-хозяин, применение (варианты), фармацевтическая композиция и способ лечения или профилактики вич-инфекции у пациента (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к производным цитокинов, обладающим активностью против ВИЧ, противовоспалительной или другими видами активности.

Предшествующий уровень техники

Неизвестны лекарственные средства, способные излечить инфекцию вирусом иммунодефицита человека (HIV, ВИЧ) и синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). До настоящего времени нет доступной вакцины, способной предотвратить инфекцию ВИЧ.

С существующими ВИЧ инфекциями можно во многих случаях бороться с использованием высокоактивной антиретровирусной терапии (HAART), которая включает комбинацию трех или более лекарственных средств против ретровирусов. Однако под селективным давлением ингибиторов обратной транскриптазы и протеиназы (RTI и RI), используемых в настоящее время при HAART, постоянно возрастает частота штаммов ВИЧ, устойчивых к одному, двум или трем лекарственным средствам.

Поэтому существует неотложная потребность в новых типах лекарственных средств против ВИЧ. Предпочтительно, такие новые лекарственные средства должны быть нацелены на такие аспекты вируса, которые менее склонны к развитию устойчивости, чем процессы обратной транскрипции и созревания вируса, на которые нацелены указанные выше RTI и RI. В отсутствие ВИЧ вакцины, кроме того, имеется потребность в средствах, которые способны предотвратить передачу ВИЧ во время полового контакта.

Эта потребность может быть потенциально удовлетворена средствами, которые ингибируют проникновение ВИЧ в клетки-мишени, т.е. средства из класса «ингибиторов проникновения» (EI). Такие средства могут, например, локально и местно наноситься на гениталии человека для предотвращения инфицирования клеток ВИЧ во время полового контакта. Средства, которые могут предотвращать передачу ВИЧ во время полового контакта, часто (хотя неуместно) именуются «микробицидами».

Проникновение ВИЧ в клетки-мишени человека зависит от прикрепления вириона ВИЧ к белку CD4 поверхности клеток человека и к так называемому корецептору. Основные корецепторы, используемые ВИЧ, включают семь связанных с трансмембранным G-белком рецепторов CXCR4 и CCR5. Было обнаружено, что природные лиганды хемокинов CCR5, в частности RANTES (CCR5), ингибируют проникновение R5-тропных штаммов ВИЧ (штаммов ВИЧ, которые используют CCR5 в качестве корецептора) в клетки человека [1]. RANTES представляет собой провоспалительный цитокин, который, как известно, способствует накоплению и активации клеток при хронических воспалительных заболеваниях.

Определенные производные RANTES с модификациями на N-конце проявили повышенную активность против ВИЧ, например, AOP-RANTES, аминооксипентаоксим [глиоксилил]¹RANTES(2-68) [2], где «(2-68)» обозначает остатки 2-68 природного пептида RANTES. Другие химически модифицированные производные RANTES с активностью против ВИЧ включают NNY-RANTES (н-нонаноил-RANTES(2-68) [3,4]) и PSC-RANTES [5].

Однако указанные выше химически модифицированные производные RANTES не только ингибируют проникновение ВИЧ в клетки, но также являются относительно сильными агонистами CCR5: AOP-, NNY- и PSC-RANTES вызывают провоспалительный каскад передачи сигналов, вовлекающий цитозольный приток кальция. Применение средств с такой активностью передачи сигналов в качестве лекарственных средств против ВИЧ может привести к нежелательным побочным эффектам, включая, например, воспаление. Индукция воспаления представляет собой очень нежелательный побочный эффект для профилактических средств против ВИЧ, поскольку было признано, что риск инфекции ВИЧ действительно увеличиваться в воспаленной ткани.

Такие средства, как производные RANTES, могут также вызвать передачу сигналов в клетках-мишенях вследствие отсутствия избирательности или специфичности средства к CCR5, т.е. того, что средство связывается также с белками рецепторов CCR1 и CCR3.

Недостаток химически модифицированных полипептидов заключается в том, что их нельзя получить прямыми биотехнологическими средствами (экспрессией и ферментацией). Также сообщалось о полностью кодированных производных RANTES против ВИЧ, т.е. производных, состоящих только из природных кодированных аминокислот [6, 7]. Однако сила действия против ВИЧ всех первоначально описанных полностью кодированных производных RANTES была ниже, чем сила действия химически модифицированного варианта PSC-RANTES [5].

Описание изобретения

Молекулы по изобретению

В настоящее время были идентифицированы полностью кодированные пептидные средства с высокой активностью против ВИЧ. Такие пептидные средства можно легко получить стандартными биотехнологическими способами, избегая расходов и усилий, требуемых для химического синтеза или модификации. Неожиданно было обнаружено, что в предпочтительных вариантах осуществления пептидные средства по настоящему изобретению сочетают в себе высокую активность против ВИЧ со способностью вызывать лишь низкую степень провоспалительной передачи сигналов, таким образом, избегая воспалительных побочных эффектов.

В других вариантах осуществления средства по изобретению ведут к интернализации CCR5 в клетку (секвестрацию, подавляющую регуляцию или подавляющую модуляцию рецепторов). Этот удивительный механизм действия имеет преимущества, поскольку (i) сравнительно длительная защита может быть достигнута одной дозой препарата, и (ii) менее вероятно возникновение устойчивых R5-тропных штаммов ВИЧ, если ни CCR5, ни его связанная с лекарственным средством форма недоступны на поверхности клетки-мишени для взаимодействия с вирусом.

Особенно предпочтительные пептидные средства сочетают в себе высокую активность против ВИЧ как с высокой активностью секвестрации рецепторов, так и с низкой активностью передачи сигналов. Другие предпочтительные пептидные средства по изобретению сочетают в себе по меньшей мере одно желаемое свойство, выбранное из группы, состоящей из высокой активности против ВИЧ, высокой активности секвестрации рецепторов и низкой активности передачи сигналов с высокой селективностью к рецепторам, т.е. предпочтительным связыванием с CCR5 относительно CCR1 и/или CCR3.

Пептидные средства по изобретению включают характерную последовательность, включающую QGP[P или L], т.е. в четвертом положении характерной последовательности может присутствовать или P, или L. Предпочтительно, такая характерная последовательность расположена около N-конца полипептида. Предпочтительно, характерная последовательность расположена так, что начало характерной последовательности лежит в пределах 15 остатков N-конца полипептида, предпочтительно, в пределах 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, 1 остатка N-конца. В настоящем описании выражение «начало характерной последовательности» относится к N-концу характерной последовательности. Характерная последовательность может быть также расположена на краю N-конца полипептида, т.е. N-концы полипептида, как в целом и характерная последовательность, могут совпадать.

Таким образом, изобретение относится к полипептиду, включающему N-концевую часть и С-концевую часть, где указанная N-концевая часть включает характерную последовательность QGP[P или L], и аминокислотная последовательность указанной С-концевой части по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1.

Предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой

QGP[P или L][L или G, или S, или M][M или D, или S, или Q, или G] или в еще одном предпочтительном варианте осуществления

QGP[P или L][L или G][M или D, или S].

Предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой

QGP[P или L][L или G, или S, или M][M или D, или S, или Q, или G]XX[Q или G, или L, или A, или T, или S]X или в еще одном предпочтительном варианте осуществления

QGP[P или L][L или G][M или D, или S]XX[Q или L]X, где Х означает любую природную или модифицированную аминокислоту.

Более предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой QGP[P или L]LM или QGPPG[D или S].

Более предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой QGPPLM или QGPPGD.

В одном варианте осуществления указанная характерная последовательность представляет собой

QGP[P или L][L или M][M или Q][A или W, или G, или Q, или N]X[Q или G, или L][S или V, или T, или G] или в других предпочтительных вариантах осуществления

QGP[P или L][L или M][M или Q][A или W, или G, или Q, или N][L или T, или M, или S, или G, или Q,или R, или Y][Q или G, или L] [S или V, или T, или G] или

QGP[P или L]LM[A или W][L или T, или M][[Q или G][S или V, или T, или G].

Предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой QGPPLM[A или W][L или T, или M] [Q или G][S или V, или T, или G].

В дополнительном варианте осуществления указанная характерная последовательность представляет собой

QGP[P или L][L или G, или S][D или S, или G, или Q]XX[L или A, или T, или Q][W или A, или V] или в других вариантах осуществления

QGP[P или L][L или G, или S][D или S, или G, или Q][T или I, или S, или W, или Q][V или L, или A, или S, или G][L или A, или T, или Q][W или A, или V] или

QGPPG[D или S][T или I]VL[W или A].

Предпочтительно, указанная характерная последовательность представляет собой QGPPGD[T или I]VL[W или A].

В еще одном варианте осуществления указанная характерная последовательность представляет собой

QGPP[G или L][M или Q]XX[Q или S][S или V] или в других вариантах осуществления

QGPP[G или L][M или Q][S или G, или W, или A, или T][L или F, или T, или S, или G, или Y][Q или S][S или V] или

QGPPLM[S или G][L или F, или T]Q[S или V].

В соответствии с предпочтительными вариантами осуществления полипептид по настоящему изобретению включает характерную последовательность, выбранную из группы QGPPLMALQS, QGPPLMWMQV, QGPPLMWLQV, QGPPLMWTQS, QGPPLMWLQT, QGPPLMWTQV, QGPPLMWMQS, QGPPLMATQS, QGPPLMWLQS, QGPPLMALQV, QGPPLMWLGG, QGPPLMWRGS, QGPLLMWLQV, QGPPLMQTTP, QGPPLSWLQV, QGPPLSWLQS, QGPPGQWSQV, QGPPMMAGLS, QGPPLSWQQS, QGPPGMWSQS, QGPPLQWRQS, QGPPLMGTQS, QGPPLMQLQV, QGPPLSWSQV, QGPPMSWSQS, QGPPLMNLQV, QGPPMSAYQV и QGPPMQGGLS.

В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления полипептид по настоящему изобретению включает характерную последовательность, выбранную из группы QGPPGDTVLW, QGPPGDIVLA, QGPPGSYDYS, QGPPGDGGSV, QGPLSGQSTP, QGPPGDWLQV, QGPPLMSLAV, QGPPLMSLTV, QGPLSGWAQV, QGPLSQSSQV, QGPLSSQSQV и QGPLGQQGQV.

В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления полипептид по настоящему изобретению включает характерную последовательность, выбранную из группы QGPPLMSFQS, QGPPLMSTQS, QGPPLMSLQV, QGPPLMGLQV, QGPLSGWLQV, QGPPLQWFQV, QGPPLQWTQV, QGPPLMALSV, QGPPLMWSQV, QGPPGQWGQV, QGPPGSWSQV, QGPPLMSSQS, QGPPLMGLSV, QGPPLMTLQV и QGPPGQWYQS.

В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления полипептид по настоящему изобретению включает характерную последовательность, выбранную из группы QGPPLMSVLA, QGPPGSWSSV, QGPPLGSMGP, QGPPLQWMQA, QGPPLQWMQV, QGPPLMSTQV, QGPPLMSLSV, QGPPLMSLQS, QGPPLMSLQA, QGPPLMSVQS, QGPPLMSAQS, QGPPLMSGQS и QGPPLMSGQV.

В еще одном варианте осуществления указанная N-концевая часть состоит из не более чем 15 аминокислот, предпочтительно, не более чем 14, 13, 12, 11, 10 аминокислот. В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления указанная N-концевая часть состоит из 10 аминокислот.

В соответствии с одним вариантом осуществления N-конец С-концевой части непосредственно примыкает к С-концу N-концевой части, т.е. N-концевая часть и С-концевая часть непосредственно примыкают друг к другу.

В еще одном варианте осуществления С-концевая часть полипептидной цепи идентична SEQ ID NO:1.

В еще одном варианте осуществления характерная последовательность расположена на краю N-конца.

Предпочтительные варианты осуществления характерных последовательностей производных RANTES по настоящему изобретению представлены в таблице 1:

Таблица 1
SEQ ID NO	Характерная последовательность
SEQ ID NO:2	QGPPLMALQS
SEQ ID NO:3	QGPPLMWMQV
SEQ ID NO:4	QGPPLMWLQV
SEQ ID NO:5	QGPPLMWTQS
SEQ ID NO:6	QGPPLMWLQT
SEQ ID NO:7	QGPPLMWTQV
SEQ ID NO:8	QGPPLMWMQS
SEQ ID NO:9	QGPPLMATQS
SEQ ID NO:10	QGPPLMWLQS
SEQ ID NO:11	QGPPLMALQV
SEQ ID NO:12	QGPPLMWLGG
SEQ ID NO:13	QGPPLMWRGS
SEQ ID NO:14	QGPLLMWLQV
SEQ ID NO:15	QGPPLMQTTP
SEQ ID NO:16	QGPPGDTVLW
SEQ ID NO:17	QGPPGDIVLA
SEQ ID NO:18	QGPPGSYDYS
SEQ ID NO:19	QGPPGDGGSV
SEQ ID NO:20	QGPLSGQSTP
SEQ ID NO:21	QGPPGDWLQV
SEQ ID NO:22	QGPPLMSFQS
SEQ ID NO:23	QGPPLMSTQS
SEQ ID NO:24	QGPPLMSLQV
SEQ ID NO:25	QGPPLMGLQV
SEQ ID NO:26	QGPLSGWLQV
SEQ ID NO:27	QGPPLMSVLA
SEQ ID NO:28	QGPPGSWSSV
SEQ ID NO:29	QGPPLGSMGP
SEQ ID NO:30	QGPPLSWLQV
SEQ ID NO:31	QGPPLSWLQS
SEQ ID NO:32	QGPPGQWSQV
SEQ ID NO:33	QGPPMMAGLS
SEQ ID NO:34	QGPPLSWQQS
SEQ ID NO:35	QGPPGMWSQS
SEQ ID NO:36	QGPPLQWRQS
SEQ ID NO:37	QGPPLMGTQS
SEQ ID NO:38	QGPPLMQLQV
SEQ ID NO:39	QGPPLSWSQV
SEQ ID NO:40	QGPPMSWSQS
SEQ ID NO:41	QGPPLMNLQV
SEQ ID NO:42	QGPPMSAYQV
SEQ ID NO:43	QGPPMQGGLS
SEQ ID NO:44	QGPPLMSLAV
SEQ ID NO:45	QGPPLMSLTV
SEQ ID NO:46	QGPLSGWAQV
SEQ ID NO:47	QGPLSQSSQV
SEQ ID NO:48	QGPLSSQSQV
SEQ ID NO:49	QGPLGQQGQV
SEQ ID NO:50	QGPPLQWFQV
SEQ ID NO:51	QGPPLQWTQV
SEQ ID NO:52	QGPPLMALSV
SEQ ID NO:53	QGPPLMWSQV
SEQ ID NO:54	QGPPGQWGQV
SEQ ID NO:55	QGPPGSWSQV
SEQ ID NO:56	QGPPLMSSQS
SEQ ID NO:57	QGPPLMGLSV
SEQ ID NO:58	QGPPLMTLQV
SEQ ID NO:59	QGPPGQWYQS
SEQ ID NO:60	QGPPLQWMQA
SEQ ID NO:61	QGPPLQWMQV
SEQ ID NO:62	QGPPLMSTQV
SEQ ID NO:63	QGPPLMSLSV
SEQ ID NO:64	QGPPLMSLQS
SEQ ID NO:65	QGPPLMSLQA
SEQ ID NO:66	QGPPLMSVQS
SEQ ID NO:67	QGPPLMSAQS
SEQ ID NO:68	QGPPLMSGQS
SEQ ID NO:69	QGPPLMSGQV

Настоящее изобретение относится к описанным выше пептидным агентам и, кроме того, к нуклеиновым кислотам, кодирующим указанные пептидные агенты. Указанные нуклеиновые кислоты могут именоваться «нуклеиновыми кислотами в соответствии с настоящим изобретением». В следующем описании термин «агент» охватывает как пептидные агенты по настоящему изобретению, так и нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные пептидные агенты. Специалисту в данной области известно, как осуществить конструирование и идентификацию нуклеиновых кислот, кодирующих указанные пептидные агенты, в соответствии с генетическим кодом.

Таким образом, настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, включающим один или несколько сегментов, кодирующих один или несколько пептидных агентов, в соответствии с настоящим изобретением. Указанная нуклеиновая кислота может представлять собой РНК или ДНК. Указанная нуклеиновая кислота может, кроме того, представлять собой вектор, т.е. нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, могут быть включены внутрь вектора. Нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, могут, кроме того, быть включены в вирус. Таким образом, изобретение также относится к вирусу, который содержит внутри своего генома один или несколько сегментов, кодирующих один или несколько пептидных агентов в соответствии с настоящим изобретением.

Предпочтительно, пептидные агенты по настоящему изобретению являются очень сильнодействующими ингибиторами проникновения ВИЧ в клетки, т.е. обладают высокой активностью против ВИЧ. В соответствии с настоящим изобретением выражения «высокая активность против ВИЧ», «высокая активность» или «высокоактивный» используются в отношении агентов или пептидов, имеющих величину IC50, измеренную анализами слияния клеток и репликации ВИЧ, описанными в разделе «Материалы и методы» 1000 пкМ (1 нМ) или ниже, предпочтительно, менее чем 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или 20 пкМ.

В литературе активность средств иногда выражается с точки зрения величин «IC50», полученных в анализе конкурентного связывания, т.е., обычно, в отношении конкуренции с меченой меткой молекулой, за связывание с представляющим интерес рецептором. В этом случае IC50 определяется как концентрация агента, при которой 50% метки вытесняется с рецептора указанным агентом, и иногда также именуется «видимое сродство». Однако для агентов по настоящему изобретению было обнаружено, что величины IC50 такого видимого сродства, полученные, например, в отношении нативного RANTES или MIP-1бета, не всегда пропорциональны активности молекулы против ВИЧ. Таким образом, предпочтительно использовать величины IC50, полученные в анализах, описанных в разделе «Материалы и методы».

В предпочтительных вариантах осуществления пептидные агенты представляют собой пептиды или полипептиды, которые относятся к пептиду RANTES. Пептидные агенты могут включать последовательность SEQ ID NO:1 или ее вариант, гомолог (ортолог, аллельный вариант, производное, функциональный мутант) или фрагмент. Предпочтительно, указанная последовательность или ее вариант, гомолог или фрагмент составляет или локализуется внутри части пептидного агента, отличной от характерной последовательности. Однако характерная последовательность может также содержаться внутри варианта или гомолога SEQ ID NO:1.

Указанные варианты, гомологи или фрагменты могут содержать замещения, вставки, делеции, добавления или усечения последовательности.

В соответствии с настоящим изобретением считается, что последовательность имеет аналогию или является гомологом SEQ ID NO:1, если указанная последовательность более чем на 70% идентична SEQ ID NO:1. Предпочтительно, указанная последовательность имеет идентичность последовательности SEQ ID NO:1 более чем 70%, предпочтительно, идентичность последовательности SEQ ID NO:1 более чем 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или 99,9%.

Считается также, что последовательность имеет аналогию или является гомологом SEQ ID NO:1, если она содержит одно или несколько консервативных замещений в отношении SEQ ID NO:1. Консервативные замещения представляют собой замещения в последовательности пептидного или полипептидного агента, которые не ведут к значительной потере функции указанного агента или которые ведут лишь к небольшой потере функции. Такая потеря функции вследствие одного или нескольких консервативных замещений может считаться незначительной, если указанная потеря составляет менее чем 20% (предпочтительно, менее чем 15%, 10%, 6% или 4%) относительно функции агента, имеющего незамещенную последовательность. Консервативные замещения часто представляют собой замещения, где боковая цепь аминокислоты заменена боковой цепью аминокислоты, которая связана или аналогична по физико-химическим свойствам замененному остатку. Такие консервативные замещения могут осуществляться, например, в соответствии с представленной ниже таблицей. Аминокислоты в одном и том же блоке в среднем столбце и, предпочтительно, в одной и той же строке в правом столбце могут быть замещены друг другом:

Таблица 2
алифатические	неполярные	G A P
I L V
полярные незаряженные	C S T M
N Q
полярные заряженные	D E
K R H
ароматические		H F W Y

В соответствии с настоящим изобретением считается, что последовательность имеет аналогию или является гомологом SEQ ID NO:1, если более чем 30% остатков в указанной последовательности идентичны или консервативно замещены относительно SEQ ID NO:1. Предпочтительно, более чем 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 98% или 99,9% указанной последовательности идентичны или консервативно замещены относительно SEQ ID NO:1.

Изобретение, кроме того, относится к полипептидам, включающим фрагменты SEQ ID NO:1 или ее указанные гомологи. Фрагменты должны включать по меньшей мере n последовательных аминокислот из SEQ ID NO:1 или ее указанного гомолога, и, в зависимости от конкретной последовательности, n равен 5 или более (предпочтительно, более чем 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32,34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 55, 56, 57).

Пептидные агенты по изобретению предпочтительно имеют низкую активность передачи сигналов, т.е. их введение и/или связывание с CCR5 вызывает лишь низкую степень провоспалительной передачи сигналов в клетках-мишенях. Пептидные агенты с «низкой активностью передачи сигналов» в соответствии с настоящим изобретением ведут к реакции передачи сигналов, составляющей 30% или менее максимальной реакции (E_max), вызванной PSC-RANTES, при испытании в концентрации 300 нМ в анализе передачи сигналов кальциевого тока (см. в разделе «Материалы и методы»). Предпочтительно, пептидные агенты по изобретению обладают активностью передачи сигналов по данным измерения в указанном анализе менее чем 30%, предпочтительно, менее чем 26%, 22%, 20%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1%.

Пептидные агенты по изобретению предпочтительно избирательны к CCR5 относительно CCR1 и CCR3. В соответствии с настоящим изобретением агент, который связывается с CCR1 и/или CCR3, все же считается имеющим избирательность к CCR5 относительно CCR1 и CCR3, если он по существу не активирует CCR1 или CCR3. Наиболее предпочтительно, агенты по настоящему изобретению по существу не связываются, не активируют CCR1 и CCR3. В контексте настоящего изобретения агент считается по существу не связывающимся с CCR1 и/или CCR3, если величина IC50 агента в отношении связывания с CCR1 и/или CCR3 составляет более чем 50 нМ, предпочтительно, более чем 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 нМ, по данным измерения с использованием анализа различительного связывания с CCR1 и/или анализа различительного связывания с CCR3 (см. раздел «Материалы и методы»). Избирательность активации CCR5 относительно активации CCR1 и/или CCR3 можно оценить посредством анализа тока кальция, как описано в разделе «Материалы и методы». В контексте настоящего изобретения агент считается по существу не активирующим CCR1 и/или CCR3, если его активность передачи сигналов меньше чем 30%, предпочтительно, меньше чем 26%, 22%, 20%, 18%, 16%, 14%, 12%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% E_max, вызываемой на этом рецепторе нативным RANTES/CCL5, по данным измерения анализом тока кальция.

Пептидные агенты по изобретению предпочтительно имеют высокую активность секвестрации рецепторов, т.е. введение и/или связывание с CCR5 вызывает высокую степень секвестрации рецепторов. Указанная секвестрация представляет собой предпочтительно интернализацию, подавляющую регуляцию или подавляющую модуляцию рецепторов. Пептидные агенты с «высокой активностью секвестрации рецепторов», в соответствии с настоящим изобретением, ведут к секвестрации по меньшей мере 50% контрольного уровня поверхностных молекул CCR5 при испытании в анализе поверхностной подавляющей модуляции/секвестрации рецепторов CCR5 (см. раздел «Материалы и методы»). Предпочтительно, пептидные агенты по изобретению имеют величины активности секвестрации рецепторов более чем 50% контрольного уровня поверхностного CCR5, например, по меньшей мере 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% или 95% контрольного уровня поверхностного CCR5.

Предпочтительно, агенты по изобретению сочетают в себе высокую активность против ВИЧ с низкой активностью передачи сигналов или сочетают в себе высокую активность против ВИЧ с высокой активностью секвестрации рецепторов. Предпочтительно, агенты по изобретению сочетают в себе высокую активность против ВИЧ как с низкой активностью передачи сигналов, так и с высокой активностью секвестрации рецепторов. Кроме того, агенты по изобретению предпочтительно сочетают в себе по меньшей мере одно свойство, выбранное из группы, состоящей из высокой активности против ВИЧ, высокой активности секвестрации рецепторов и низкой активности передачи сигналов, с избирательностью к CCR5. В соответствии с определенными предпочтительными вариантами осуществления изобретения агенты по изобретению характеризуются комбинацией промежуточных уровней активности против ВИЧ (уровни IC50, по данным измерения в анализе слияния клеток, например, от 0,15 до 1 нМ, от 0,15 до 0,7 нМ, от 0,3 до 1 нМ или от 0,5 до 1 нМ) с промежуточными уровнями активности передачи сигналов (например, от 30% до 50% или от 30% до 45%, по данным измерения анализом тока кальция) и промежуточными уровнями активности секвестрации рецепторов (например, от 20% до 60%, от 30% до 50%, от 20% до 50% или от 30% до 60%) по данным измерения в анализе подавляющей модуляции поверхностного CCR5. Анализы описаны ниже в разделе «Материалы и методы».

Термины «белок», «пептид» или «полипептид» используются взаимозаменяемо и относятся к аминокислотным полимерам любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты, и он может прерываться неаминокислотами. Данные термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован природно или путем вмешательства, например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидированием, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как сопряженное связывание с метящим компонентом. В определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Полипептиды могут встречаться в виде одиночных цепей или ассоциированных цепей. Полипептиды по изобретению могут быть природно или неприродно гликозилированы (т.е. полипептид имеет тип гликозилирования, который отличается от типа гликозилирования, обнаруживаемого в соответствующем природном полипептиде).

Получение пептидных агентов

Пептидные агенты по изобретению можно получить многими путями, например, с использованием известных методик молекулярной биологии (т.е. генной инженерии и ферментации - в целом, биотехнологией) или белковой химии (например, химическим пептидным синтезом).

Пептидные агенты и агенты в виде нуклеиновых кислот предпочтительно получают с использованием известных методик генной инженерии, как описано, например, в ссылке [13]. Таким образом, изобретение относится к способу получения пептидных агентов или полипептидов по изобретению, включающему стадию культивирования клетки-хозяина в условиях, которые вызывают экспрессию полипептида.

Например, пептидные агенты по настоящему изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме путем экспрессии в клетке-хозяине. Такие способы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области и многие из них подробно описаны в ссылке [13]. Подходящий вектор экспрессии можно выбрать для хозяина выбора. Вектор может содержать молекулу рекомбинантной ДНК, кодирующую пептидный агент, связанный с контрольной последовательностью экспрессии, которая распознается механизмом транскрипции хозяина. Когда пептидный агент по изобретению получен таким образом рекомбинантной экспрессией, агент извлекается очисткой из культуры клеток-хозяев.

Предпочтительный способ включает химический синтез in vitro [8, 9]. Таким образом, изобретение относится к способу получения пептидного агента, где пептидный агент синтезирован частично или в целом с использованием химических средств. Особенно предпочтителен твердофазный пептидный синтез, такой как способы на основе химии tBoc или Fmoc [10]. Можно также частично или полностью использовать ферментативный синтез [11].

Можно использовать биологический синтез, отличный от экспрессии у хозяина, например, полипептиды могут быть получены трансляцией из РНК in vitro. Пептидные агенты по изобретения могут быть также получены, например, расщеплением более длинных полипептидов с использованием протеаз.

Биологические способы, включающие генную инженерию, ферментацию и экспрессию, как правило, ограничены получением полипептидов на основе L-аминокислот, но можно использовать манипулирование механизмом трансляции in vivo или in vitro для обеспечения возможности (например, молекул аминоацил тРНК) введения D-аминокислот (или других неприродных аминокислот, таких как йодтирозин или метилфенилаланин, азидогомоаланин и т.д.) [12]. Однако, когда включены D-аминокислоты, предпочтительно использовать химический синтез. Полипептиды по изобретению могут иметь ковалентные модификации на С-конце и/или на N-конце.

Клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением.

В соответствии с одним аспектом изобретения клетка-хозяин подходит для биотехнологического получения агентов по настоящему изобретению. Подходящие хозяева для биотехнологического получения агентов по настоящему изобретению включают обычно используемые прокариотические виды, такие как E. coli, или эукариотические дрожжи, которые могут быть получены для экспрессии высоких уровней рекомбинантных белков и которые можно легко вырастить в больших количествах. Подходят также линии клеток, выращенные in vitro, в частности, при использовании запускаемых вирусом систем экспрессии, таких как система экспрессии бакуловируса, которая включает использование клеток насекомых в качестве хозяев. Пептидные агенты могут быть также экспрессированы in vivo, например в личинках насекомых или в тканях млекопитающих. Предпочтительно, пептидный агент экспрессирован в E. coli; например, подходит штамм BLR(DE3), хотя специалисту в данной области понятно, что эквивалентные системы равным образом целесообразны.

В соответствии с еще одним аспектом изобретения предоставляется клетка-хозяин, которая способна выживать и размножаться в кишечнике (желудочно-кишечном тракте) или влагалище человека или животного и предпочтительно экспрессировать в них пептидный агент, кодируемый указанной нуклеиновой кислотой. Предпочтительно, клетка-хозяин в соответствии с данным аспектом изобретения также секретирует указанный пептидный агент в периплазму или среду. Далее термин «агент», кроме того, включает описанные в настоящем описании клетки-хозяева.

Предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой обладающий высокой способностью к расселению и непатогенный микроорганизм. Обладающие высокой способностью к расселению микроорганизмы, в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой штаммы, которые способны конкурировать с местными микробами за длительное заселение внутренних поверхностей слизистых оболочек. Клетка-хозяин представляет собой предпочтительно микроорганизм, который относится к флоре кишечника или влагалища человека, предпочтительно, микроорганизм, который обычно обнаруживается во флоре просвета кишечника или влагалища. Более предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой пробиотик и/или микроорганизм-комменсал, т.е. род, вид или штамм, который благоприятен по меньшей мере для человека-хозяина. Предпочтительно, клетка-хозяин, в соответствии с настоящим изобретением, является частью кишечной или влагалищной флоры нормального или здорового человека или животного. В соответствии с одним вариантом осуществления клетка-хозяин относится к роду, выбранному из группы, состоящей из Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Streptococcus, Escherichia и Lactobacillus. Клетка-хозяин представляет собой предпочтительно вид, выбранный из группы, состоящей из Escherichia coli, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus GG, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum и Streptococcus gordonii. Предпочтительно, обладающий высокой способностью к расселению микроорганизм, в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой Escherichia coli Nissle 1917. Однако любой другой, обладающий высокой способностью к расселению штамм или Escherichia coli, или другой из указанных выше видов, также представляет собой предпочтительный штамм, в соответствии с настоящим изобретением. В другом варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой дрожжевой грибок. Предпочтительно, дрожжевой грибок представляет собой дрожжевой грибок-комменсал, такой как Pichia guelliermondii или Saccharomyces boulardii. В еще одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку человека.

Специалисту в данной области хорошо известны способы трансформации микроорганизмов чужеродными нуклеиновыми кислотами и последующего использования трансформированных микроорганизмов для экспрессии полипептида, кодируемого указанными нуклеиновыми кислотами, во внутриклеточной, периплазматической или секретируемой форме [см. ссылки 13, 15, 16, 17].

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим агент, в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтически приемлемый носитель. Таким образом, агенты по настоящему изобретению или фармацевтически приемлемая соль пептидных агентов или соответствующих нуклеиновых кислот предоставлен для применения в качестве лекарственного средства. Композиции по настоящему изобретению могут содержать любой агент по настоящему изобретению, т.е. здесь и далее пептидный агент, его фармацевтически приемлемую соль, нуклеиновую кислоту, ее фармацевтически приемлемую соль или клетку-хозяин в соответствии с настоящим изобретением. Получение фармацевтических композиций хорошо известно специалисту в данной области.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут, в частности, содержать более одного агента (несколько) по настоящему изобретению, например, два или более агентов. Изобретение также относится к фармацевтическому препарату или системе, содержащей (а) первый агент, который представляет собой агент по изобретению; и (b) второй фармацевтический агент. В соответствии с определенными вариантами осуществления второй фармацевтический агент может включать ингибиторы обратной транскриптазы (RTI), ингибиторы протеазы (PI), ингибиторы интегразы и ингибиторы вирусной сборки. В соответствии с другими вариантами осуществления второй фармацевтический агент может включать ингибиторы проникновения, отличные от ингибиторов проникновения по настоящему изобретению, например, полианионные вещества (например, сульфат целлюлозы), агенты, связывающие гликаны, или лектины, агенты, связывающие рецепторы гликанов (например, растворимый маннан), антитела, ингибиторы проникновения мелких молекул, ингибиторы проникновения пептидов или агенты, связывающие CXCR4 (блокирующие CXCR4). В соответствии с еще одними вариантами осуществления второй фармацевтический агент может включать детергент или агент, который модифицирует рН, например, кислоту или агент, забуферивающий рН. В соответствии с еще дополнительными вариантами осуществления второй фармацевтический агент может включать ингибиторную РНК (siPHK), где siPHK может быть химически модифицирована.

В соответствии с другими аспектами изобретения указанный второй агент может также представлять собой противовоспалительное лекарственное средство или иммуносупрессант. Указанные множественные агенты по изобретению или указанные первый и второй агенты составлены или в смеси, или в виде отдельных композиций, например, для одновременного, хотя раздельного, или последовательного введения (см. ниже).

Фармацевтически приемлемые соли агентов по изобретению, конечно, могут быть получены обычными методиками, такими как взаимодействие свободного основания и/или кислоты агента по меньшей мере со стойхиометрическим количеством желаемой образующей соль кислоты или основания.

Фармацевтически приемлемые соли агентов по изобретению включают соли с неорганическими катионами, такими как натрий, калий, кальций, магний, цинк и аммоний, и соли с органическими основаниями. Подходящие органические основания включают N-метил-D-глюкамин, аргинин, бензатин, диоламин, оламин, прокаин и трометамин. Фармацевтически приемлемые соли агентов по изобретению также включают соли, полученные из органических или неорганических кислот. Подходящие анионы включают ацетат, адипат, бесилат, бромид, камсилат, хлорид, цитрат, эдисилат, эстолат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкауронат, гиппурат, гиклат, гидробромид, гидрохлорид, йодид, изетионат, лактат, лактобионат, малеат, месилат, метилбромид, метилсульфат, напсилат, нитрат, олеат, памоат, фосфат, полигалактуронат, стеарат, сукцинат, сульфат, сульфосалицилат, таннат, тартрат, терефталат, тосилат и триэтйодид.

Фармацевтические дозированные формы агента по изобретению могут быть предоставлены в системе немедленного высвобождения, контролируемого высвобождения, непрерывного высвобождения или целевой доставки лекарственного средства.

Обычно применяемые дозированные формы включают, например, растворы и суспензии, (микро)эмульсии, мази, гели, кремы, пасты, пены, суппозитории, яйцевидные влагалищн