Пептиды, ингибирующие нейронный экзоцитоз

Пептиды, ингибирующие нейронный экзоцитоз

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к пептидам, которые могут регулировать нейронный экзоцитоз, и к косметическим или фармацевтическим композициям, содержащим указанные пептиды, пригодным для лечения состояний, требующих регулирования нейронного экзоцитоза, таких как, например, мышечная спастичность, асимметрия лица и/или морщины на лице, предпочтительно мимические морщины.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Одними из самых видимых признаков человеческого старения являются изменения, затрагивающие кожу: сухость, появление пятен, вялость и морщины. Эти эффекты могут быть вызваны внешними агентами, такими как, например, постоянное воздействие солнца, атмосферное загрязнение или контакт с химическими агентами, присутствующими в очищающих продуктах, а также они являются результатом внутренних физиологических, биохимических и гистологических изменений человеческого организма, связанных с уменьшением синтеза белков, таких как коллаген или эластин, с увеличением протеолиза, и с общим разрушением кожного барьера, соединительной ткани и когезии.

Различные активные ингредиенты были описаны для предотвращения и уменьшения симптомов старения, такие как, например, ретиноиды, гидроксикислоты, флавоноиды или производные витаминов С и Е. Указанные соединения обычно действуют, улучшая гидратацию кожи, увеличивая обновление клеток или предотвращая дегенерацию ткани, образующей кожу;

однако их эффективность в предупреждении и лечении лицевых морщин, вызванных мышечным сокращением, ограничена. Основанием или механизмом появления мимических морщин на лице является напряжение эпидермальных мышц внутри кожи. Это мышечное напряжение представляет собой результат гиперактивности нервов, иннервирующих мимические мышцы. Гиперактивность нервов характеризуется неконтролируемым и избыточным высвобождением нейротрансмиттеров, возбуждающих мышечные волокна. С другой стороны, молекулы, регулирующие нейронный экзоцитоз, способствуют релаксации мышечного напряжения и, соответственно, элиминации лицевых морщин.

Поэтому существует потребность в разработке новых активных ингредиентов с доказанной эффективностью для изготовления косметической или фармацевтической композиции для регулирования нейронного экзоцитоза и, таким образом, для лечения мышечной спастичности и уменьшения и/или устранения асимметрии лица и/или лицевых морщин, особенно мимических морщин.

Мимические морщины представляют собой морщины, появляющиеся в результате напряжения мимических мышц, ответственных за мимику на коже лица. Мимические морщины обычно располагаются на лбу, в пространстве между бровями, вокруг рта и/или вокруг глаз. В зависимости от формы лица, частоты смены выражений и наличия тиков (конвульсивные часто повторяющиеся движения, вызванные непроизвольным сокращением одной или нескольких мышц, в данном случае мимических мышц), мимические морщины могут появиться даже во время пубертатного периода. Внешние факторы, такие как воздействие солнца, усиливают их глубину и проявление.

Токсины ботулизма широко используются для уменьшения и/или устранения мимических морщин, особенно серотипа А (косметический препарат ВОТОХ^®, Allergan Inc.) [Canvthers J.D. and Carruthers J.A. (1992) "Treatment of glabellar frown lines with C. botulinum-A exotoxin" J. Dermatol. Surg. Oncol. 18, IT-21; Mendez-Eastman S.K. (2003) "Botox: a review" Plast. Surg. Nurs. 23, 64-69J. Терапевтическое и косметическое лечение препаратом ВОТОХ^® состоит из локализованной инъекции разбавленных фармацевтических препаратов (комплекс ботулинический токсин типа А - гемагглютинин, 500 кДа) в участки, где локализовано мышечное напряжение. Паралитические эффекты токсина являются обратимыми со средней длительностью в 6 месяцев [Jankovic J. and Вrin F.М. (1991) "Therapeutic uses of botulinum toxin" New Engl. J. Med. 324, 1186-1194; Jankovic J. (1994) "Botulmum toxin in movement disorders" Curr. Opm. Neurol. 6, 358-366]. Лечение поэтому требует повторных инъекций ботулинического токсина. Основная проблема этого лечения состоит в возможности запуска иммунной реакции против фармацевтического препарата вследствие того, что его молекулы могут быть распознаны иммунной системой пациента. Появление антител против ботулинического токсина представляет собой серьезную проблему, поскольку оно заметно снижает эффективность лечения [Jankovic J. and Brin F.M. (1991) "Therapeutic uses of botulinum toxin" New Engl. J. Med. 324, 1186-1194; Jankovic J. (1994) "Botulinum toxin in movement disorders" Curr. Opin. Neurol. 6, 358-366; Jankovic J. and Brin M.F. (1997) "Botulinum toxin: historical perspective and potential new indications" Muscle Nerve Suppl. 6, S129-S145; Davis L.E. (1993) "Botulinum toxin-from poison to medicine" West J. Med. 128, 25-28; Hughes A.J. (1994) "Botulinum toxin in clinical practise" Drugs 48, 888-893; Hambleton P. (1992) "Clostridium botulinum toxins a general review of involvement in disease, structure, mode of action and preparation for clinical use" J. Neurol. 239, 16-20; Borodic G.E. and Pearces L.B. (1994) "New concepts in botulinum toxin therapy" Drug Safety 11, 145-152; Brin M.F., Blitzer A., Stewart C., Pine Z., Borg-Stein J., Miller J; Nagalapura N.S. and Rosenfeld D.B. (1993) "Disorders with excessive muscle contraction: Candidates for treatment with intramuscular botulinum toxin (BoTox^®)" Botulinum and Tetanus Neurotoxins (Ed. B.R. DasGupata), 559-576]. Такая потеря эффективности лечения с помощью BOTOX^® влечет за собой необходимость увеличения концентрации препарата при последующих обработках, что, в свою очередь, вызывает усиление иммунного ответа. В качестве альтернативы лечению ботулиническим токсином серотипа А рассматривается применение других серотипов ботулинических токсинов, таких как BoTox В, BoTox F и BoTox E. Однако использование фармацевтических препаратов с другими серотипами нельзя считать решением проблемы, потому что рано или поздно иммунная реакция может появиться снова. Кроме того, лечение ботулиническими токсинами является дорогим, главным образом из-за лабильности и нестабильности содержащих их фармацевтических препаратов.

Поэтому существует острая необходимость в разработке молекул, имитирующих паралитические эффекты ботулинических токсинов, но имеющих более простые и стабильные молекулярные структуры, которые не индуцируют иммунные реакции, и стоимость получения которых является рентабельной. Молекулы пептидной природы соответствуют этим требованиям.

На молекулярном уровне ботулинические токсины представляют собой протеазы, разрушающие нейронные белки, которые вовлечены в механизм активизируемого ионами кальция экзоцитоза [Schiavo G., Rossetto О. and Montecucco С. (1996) "Bases Moleculares del tetanos у del botulismo" Investigacion у Ciencia 234, 46-55; Montecucco С. and Schiavo G. (1994) "Mechanism of action of tetanus and botulinum neurotoxins" Mol. Microbiol. 13, 1-8; Schiavo G., Rosetto O., Benfenati F., Poulain B. and Montecucco, C. (1994) "Tetanus and botulinum neurotoxins are zinc proteases specific for components of the neuroexocytosis apparatus" Ann. NY Acad. Sci. 710, 65-75J. Например, ботулинический токсин А, наиболее часто используемый в клинической практике и косметике в плане его применения для устранения лицевых морщин и асимметрии лица и для того, чтобы ослабить симптоматологию бронхиальных заболеваний, укорачивает нейронный белок SNAP-25. Этот белок SNAP-25 играет важную роль в нейросекреции, поскольку он вовлечен в формирование белкового комплекса (известного как SNARE или комплекс слияния), направляющего и контролирующего высвобождение ацетилхолина, накопленного в везикулах. Ядро указанного слитого комлекса сформировано синтаксином и белками SNAP-25, расположенными в пресинаптической плазматической мембране, и синаптобревином или белком VAMP, локализованными в плазматической мембране везикул [Calakos N. and Scheller R.H. (1996) "Synaptic vesicle biogenesis, docking and fusion: a molecular description" Physiol. Rev. 76, 1-29; Sutton R.B., Fasshauer D., Jahn R. and Brunger A.T. (1998) "Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4Å resolution" Nature 395, 347-3537. Основная функция комплекса слияния заключается в перемещении везикулы, нагруженной нейротрансмиттером (ацетилхолином), к пресинаптической плазматической мембране и приведение ее в контакт с ней [Calakos N. and Scheller R.H. (1996) "Synaptic vesicle biogenesis, docking and fusion: a molecular description" Physiol. Rev. 76, 1-29; Sutton R.B., Fasshauer D., Jahn R. and Brunger A.T. (1998) "Crystal structure of a SNARE complex involved in synaptic exocytosis at 2.4Å resolution" Nature 395, 347-353]. В ответ на повышение концентрации кальция происходит слияние обеих плазматических мембран, вызывая высвобождение нейротрансмиттера. Указанное слияние везикул и заякоривающего белкового комплекса SNARE, таким образом, является главной мишенью для контролирования нейросекреции. Усечение любого из белков, формирующих комплекс слияния, предотвращает его сборку и тем самым ингибирует везикулярное высвобождение и регулирует нейронный экзоцитоз.

Аналогично, были также описаны синтетические пептиды, полученные в соответствии с рациональным дизайном или путем анализа синтетических химических библиотек, которые могут воздействовать на формирование комплекса SNARE, ингибируя нейронный экзоцитоз [Blanes-Mira С., Pastor M. Т., Valera E., Fernández-Ballester G., Merino J.M., Gutierrez L.M., Perez-Paya E. and Ferrer-Montiel A. (2003) "Identification of SNARE complex modulators that inhibit exocytosis form an α-helix-constrained combinatorial library" Biochem J. 375, 159-166].

Промышленное применение этого типа соединений было ограничено. В косметической промышленности были затрачены значительные усилия для разработки соединений, имитирующих воздействие ботулинических токсинов, с исключительным использованием в лечении и предупреждении образования мимических морщин [Blanes-Mira С., Clemente J., Jodas G., Gil A., Fernández-Ballester G., Ponsati В., Gutierrez L.M., Perez-Paya E. and Ferrer-Montiel, A. (2002) "A synthetic hexapeptide (Argireline^®) with anti-wrinkle activity" Int. J. Cosmetic Res. 24, 303-310]. Более конкретно, в патенте ЕР 1,180,524 Lipotec, S.A., описаны пептиды, полученные из амино-концевого фрагмента белка SNAP-25, обладающие действием против появления морщин, а в международной заявке на патент WO 97/34620 также описаны пептиды, полученные из аминокислотной последовательности белка SNAP-25, конкретно из его карбоксиконцевой области, или из синаптобревина, или из синтаксина, которые могут ингибировать нейронный экзоцитоз.

Ни один из патентов, описанных выше, не относится к необратимо химически модифицированным производными белка SNAP-25 в качестве регулирующих агентов нейронного экзоцитоза. Патент ЕР 1,180,524 описывает потенциально обратимые химические модификации пептидов аминоконцевого фрагмента белка SNAP-25 для целей увеличения его биодоступности и легкости проникновения через гематоэнцефалический барьер и эпителиальную ткань, такие как этерификация боковых цепей аспарагиновых и глутаминовых остатков, которые впоследствии будут разрушены in vivo внутриклеточными эстеразами с высвобождением немодифицированного пептида, отвечающего за биологическую активность. Неожиданно автор настоящего изобретения обнаружил, что химически необратимые модификации амино- и карбоксильных концов указанных пептидов не только придают им большую устойчивость против разрушения внутриклеточными протеазами, обеспечивая тем самым большую длительность их действия в качестве регуляторов нейронного экзоцитоза, но, что удивительно, они также могут увеличивать их эффективность in vitro в 2-30 раз относительно эффективности соответствующего немодифицированного пептида.

Модификация белков липидными цепями описана как необратимая модификация, когда она осуществлена на аминогруппах, присутствующих в их последовательностях, либо по их аминоконцу или в боковых цепях остатков лизина, и считается обратимой, когда она осуществлена на тиольных группах остатков цистеина, поскольку такой модифицированный пептид или белок гидролизуются in vivo соответствующими тиоэстеразами [Маgее A.I. (1990) "Lipid modification of proteins and its relevance to protein targeting" J. Cell Sci. 97, 581-584; Mumby S.M. (1997) "Reversible palmitoylation of signaling proteins" Curr. Opin. Cell Вiоl. 9, 148-154]. В уровне техники описаны примеры необратимых модификаций пептидов производными цепей жирных кислот с целью повышения их эффективности in vivo путем усиления их проникновения через кожу [Lintner К. and Peschard О. (2000) "Biologically active peptides: from a laboratory bench curiosity to a functional skin care product" Int. J. Cosmet. Sci. 22, 207-218] или достижения лучшего иммунологического ответа для их разработки в качестве потенциальных вакцин [Gahery H., Choppin J., Bourgault I., Fischer E., Maillere B. and Guillet J.G. (2005) "HIV preventive vaccine research at the ANRS: the lipopeptide vaccine approach" Therapie 60, 243-248], а также для того, чтобы индуцировать больший цитотоксический эффект в отношении бактерий [Eisenstein B.I. (2004) "Lipopeptides, focusing on daptomycin, for the treatment of Gram-positive infections" Expert Opin. Investig. Drugs 13, 1159-1169] или грибов [Avrahami D. and Shai Y. (2004) "A New Group of Antifungal and Antibacterial Lipopeptides Derived from Non-membrane Active Peptides Conjugated to Palmitic Acid" J. Biol. Chem. 279, 12277-12285]. Этот тип модификаций не всегда приводит к изменению эффективности in vitro указанных пептидов; например, пальмитоилирование трипептида GHK (глицил-L-гистидил-L-лизин) не изменяет его способность индуцировать синтез коллагена в фибробластах [Lintner К. and Peschard О. (2000) "Biologically active peptides: from a laboratory bench curiosity to a functional skin care product" Int. J. Cosmet. Sci. 22, 207-218], таким образом, специалист в данной области техники на момент создания настоящего изобретения не мог бы предсказать, увеличит, уменьшит или оставит без изменения эффективность in vitro модификация пептида группой углеводорода по сравнению с соответствующим немодифицированным пептидом.

Примеры, существующие в уровне техники, описывают модификации пептидов и белков с целью улучшения их фармакологических свойств распределения и элиминирования и, таким образом, улучшения их in vivo биологической активности без изменения их биологической активности in vitro, но никоим образом не предполагают, что потенциальное ПЭГлирование может увеличить биологическую активность белка in vitro, скорее напротив, описаны примеры, такие как в случае ПЭГлированного интерферона, где активность in vitro уменьшается по сравнению с активностью нативного интерферона [Rajender Reddy K., Modi M.W. and Redder S. (1992) "Use of peginterferon alfa-2a (40 KD) (Pegasys) for the treatment of hepatitis C" Adv. Drug Deliv. Rev. 54(4), 571-86].

Неожиданно настоящее изобретение показывает, что необратимая химическая модификация пептидных последовательностей, полученных из белка SNAP-25, может увеличить эффективность указанных последовательностей в отношении ингибирования нейронного экзоцитоза. Нет никакого указания в уровне техники, что указанные модификации должны увеличивать ингибиторный эффект указанных пептидов, поэтому специалист не мог бы сделать вывод относительно природы необходимых модификаций пептидов для увеличения их способности ингибировать нейронный экзоцитоз.

Настоящее изобретение, таким образом, представляет собой новое решение существующих потребностей, включая открытие необратимо химически модифицированных пептидных последовательностей, полученных из белка SNAP-25, которые могут ингибировать нейронный экзоцитоз более эффективным и длительным образом, чем соответствующие немодифицированные пептиды, которые уже известны в уровне техники.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет собой простое, эффективное и надежное решение для регулирования нейронного экзоцитоза, включающее использование в организме млекопитающего композиции, содержащей по меньшей мере один пептид, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности белка SNAP-25, и который необратимо химически модифицирован по его амино- и/или карбоксильному концам.

Таким образом, первый аспект изобретения относится к пептиду, который может регулировать нейронный экзоцитоз, согласно общей формуле (I):

R₁-AA-R₂

(I)

его стереоизомерам и его рацемическим или нерацемическим смесям, и его косметически или фармацевтически приемлемым солям, где

АА представляет собой последовательность 3-40 соседних

аминокислот, содержащихся в аминокислотной последовательности SEQ ID No.1;

R₁ выбран из группы, состоящей из Н или алкильной, арильной, аралкильной или ацильной группы;

и R₂ выбран из группы, состоящей из амино, гидроксила или тиола, незамещенных или замещенных алифатическими или циклическими группами;

при условии, что когда R₁ представляет собой Н или ацетил, тогда R₂ не представляет собой незамещенный амино, гидроксил или тиол.

Предпочтительными структурами пептидов, показанных в общей формуле (I), являются структуры, в которых

R₁ представляет собой Н или ацетил, либо насыщенную или ненасыщенную, линейную, разветвленную или циклическую С₃-С₂₄ацильную группу или полиэтиленгликолевый полимер;

R₂ представляет собой амино или гидроксил, возможно замещенный насыщенной или ненасыщенной, линейной, разветвленной или циклической C₁-C₂₄ алифатической группой;

при условии, что, когда R₁ представляет собой Н или ацетил, R₂ не является незамещенным амино или гидроксилом.

Более предпочтительными структурами являются структуры, в которых полиэтиленгликолевый полимер представляет собой

где n может варьировать от 1 до 100, и более предпочтительно он может варьировать между 1 и 5.

Дополнительно, предпочтительными являются структуры, в которых R₁ представляет собой ацильную группу формулы СН₃-(СН₂)_m-СО-, где m может варьировать между 1 и 22.

Пептиды по настоящему изобретению могут существовать в виде стереоизомеров или смесей стереоизомеров; например, образующие их аминокислоты могут иметь L-, D-конфигурацию или могут быть рацемическими независимыми друг от друга. Поэтому возможно получить смеси изомеров, а также рацематы или смеси диастереомеров, либо чистые диастереоизомеры или энантиомеры, в зависимости от числа асимметрических атомов углерода, где присутствуют изомеры или смеси изомеров. Предпочтительные структуры пептидов по изобретению представляют собой чистые изомеры, то есть энантиомеры или диастереоизомеры.

В контексте настоящего изобретения термин "алифатическая группа" относится к насыщенной или ненасыщенной, линейной или циклической группе.

Термин "углеводородная группа" использован в настоящем изобретении как охватывающий, например, алкильные, алкенильные или алкинильные группы.

Термин "алкильная группа" относится к насыщенной, линейной или разветвленной углеводородной группе, включая, например, метил, этил, изопропил, изобутил, mpem-бутил, гептил, додецил, гексадецил, октадецил, амил, 2-этилгексил, 2-метилбутил, 5-метилгексил и т.п..

Термин "алкенильная группа" относится к ненасыщенной, линейной или разветвленной углеводородной группе с одной или более углерод-углеродными двойными связями, такой как винильная группа.

Термин "алкинильная группа" относится к ненасыщенной, линейной или разветвленной углеводородной группе с одной или более углерод-углеродными тройными связями.

Термин "циклическая группа" относится к замкнутому углеводородному кольцу, которое может быть классифицировано как алициклическая, ароматическая или гетероциклическая группа.

Термин "алициклическая группа" относится к циклической углеводородной группе со свойствами, сходными с алифатическими группами.

Термин "ароматическая группа" или "арильная группа" относится к моно- или полициклической ароматической углеводородной группе.

Термин "гетероциклическая группа" относится к замкнутому углеводородному кольцу, в котором один или более атомов кольца представляет собой элемент, иной нежели углерод (например, азот, кислород, сера и т д.).

Термин "полиэтиленгликолевый полимер" относится к замещенным или незамещенным углеводородным цепям, содержащим повторяющиеся звенья группы -СН₂СН₂O-.

Как понимается в этой области техники, существование высокой степени замещения является не только допустимым, но рекомендованным. Поэтому в пептидах по настоящему изобретению могут присутствовать замещения. С целью упрощения настоящего описания изобретения термины "группа" и "блок" будут использованы для того, чтобы дифференцировать химические группировки, допускающие возможность замещения, либо которые могут быть замещены ("группа"), и те, которые не допускают возможность замещения, либо которые не могут быть замещены ("блок"). Таким образом, когда термин "группа" используют для описания химического заместителя, описанный химический материал включает как незамещенную группу, так и группу, содержащую атомы О, N или S.

С другой стороны, когда термин "блок" используют для описания химического соединения или заместителя, в него может быть включен только незамещенный химический материал. Например, выражение "алкильная группа" включает не только насыщенные алкильные заместители с открытой цепью, такие как метил, этил, пропил, изобутил и т.п., но также и алкильные заместители, содержащие другие заместители, известные в уровне техники, такие как гидроксил, алкоксил, амино, карбоксил, карбоксамид, атомы галогенов, циано, нитро, алкилсульфонил и другие. Таким образом, "алкильная группа" включает простую эфирную, галогеноалкильную, спиртовую, тиольную, карбоксильную, аминную, гидроксиалкильную, сульфоалкильную, гуанидиновую и другие группы. С другой стороны, выражение "алкильный блок" включает только насыщенные алкильные заместители с открытой цепью, такие как метил, этил, пропил, изобутил и т.п.

В контексте настоящего изобретения "аминокислотная последовательность, полученная из аминокислотной последовательности белка SNAP-25" означает любую аминокислотную последовательность или фрагмент, содержащийся в аминокислотной последовательности белка SNAP-25, определенной как SEQ ID No. 1, или любую аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности, содержащейся в SEQ ID No. 1, мутацией, вставкой, делецией или заменой по меньшей мере одной аминокислоты либо вырожденностью генетического кода, при условии, что она соответствует пептиду, имеющему активность белка SNAP-25. Мутации, вставки или замены могут быть осуществлены посредством генетически кодируемых аминокислот или посредством некодируемых аминокислот, природных или синтетических, таких как, например, но без ограничения ими, цитруллин, орнитин, саркозин, дезмозин, норвалин, 4-аминомасляная кислота, 2-аминомасляная кислота, 2-аминоизомасляная кислота, 6-аминогексановая кислота, 1-нафтилаланин, 2-нафтилаланин, 2-аминобензойная кислота, 4-аминобензойная кислота, 4-хлорфенилаланин, 2,3-диаминопропионовая кислота, 2,4-диаминомасляная кислота, циклосерин, карнитин, цистин, пеницилламин, пироглутаминовая кислота, тиенилаланин, гидроксипролин, алло-изолейцин, алло-треонин, изонипекотиновая кислота, изосерин, фенилглицин, статин, β-аланин, норлейцин, N-метиламинокислоты, β-аминокислоты или γ-аминокислоты, а также их производные. Список синтетических аминокислот может быть найден в статье "Unusual amino acids in peptide synthesis" by Roberts D.C. and Vellaccio F., in The Peptides, Vol.5 (1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds, Academic Press, New York, USA, или в коммерческих каталогах компаний, специализирующихся в этом секторе, таких как, например, NeoMPS, Bachem, Novabiochem, Sigma-Aldrich, Peptides International, Advanced ChemTech, Chem-lmpex, Maybridge Chemical, Chirotech Technology, Peninsula Laboratories или RSP Amino Acid Analogues, среди прочего.

Из числа пептидов по изобретению, полученных из аминокислотной последовательности SNAP-25, определенной SEQ ID No. 1 и химически модифицированной необратимым образом, предпочтительными являются последовательности, которые имеют аминокислотную последовательность, содержащуюся в последовательности аминоконцевой области белка SNAP-25, определенной SEQ ID No. 2, или карбоксиконцевой области белка SNAP-25, определенной SEQ ID No. 3, более предпочтительно содержащуюся в области, находящейся между остатками 10-22, определенной SEQ ID No. 4, или содержащуюся в области, находящейся между остатками 25-40, определенной SEQ ID No. 5, или содержащуюся в области, находящейся между остатками 65-81, определенной SEQ ID No. 6, или содержащуюся в области, находящейся между остатками 181-206, определенной SEQ ID No. 7, более конкретно содержащуюся в области, находящейся между остатками 12-19, определенной SEQ ID No. 8, или содержащуюся в области, находящейся между остатками 26-38, определенной SEQ ID No. 9, или содержащуюся в области, находящейся между остатками 68-79, определенной SEQ ID No. 10 SEQ, и, конкретно, содержащуюся в области, находящейся между остатками 12-17, определенной SEQ ID No. 11.

Изобретение также включает пептиды, которые являются по существу гомологичными необратимо химически модифицированным пептидам, полученным из аминокислотной последовательности белка SNAP-25. Под "по существу гомологичными пептидами" понимают аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 60%, предпочтительно на 80% и более предпочтительно на 95% идентичны последовательности SEQ ID No. 1. "Процент идентичности" относится к проценту аминокислот, которые идентичны между двумя аминокислотными последовательностями, которые сравниваются после оптимального выравнивания этих последовательностей, где указанный процент является лишь статистическим, и различия между двумя аминокислотными последовательностями случайным образом распределены по последовательности. Под "оптимальным выравниванием" понимают выравнивание аминокислотных последовательностей, дающее больший процент идентичности. Процент идентичности рассчитывается путем определения числа идентичных положений, в которых аминокислота идентична в двух сравниваемых последовательностях, деления числа идентичных положений на число сравниваемых положений и умножения полученного результата на 100 для получения процента идентичности между этими двумя последовательностями. Сравнение последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями может быть выполнено вручную или посредством компьютерных программ, таких как алгоритм BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), к которому можно получить доступ через Интернет на вебсайте http://www.ncbi nim nlm.gov/BLAST/.

Косметически или фармацевтически приемлемые соли пептидов, предложенных в соответствии с этим изобретением, включены в рамки настоящего изобретения. Термин "косметически или фармацевтически приемлемые соли" включает соли, обычно используемые для получения солей с металлами или солей присоединения кислот, либо солей присоединения органических кислот (таких как, например, ацетат, цитрат, олеат, трифторацетат, оксалат или глюконат) либо солей присоединения неорганических кислот (таких как, например, хлорид, сульфат, борат или карбонат). Природа соли не важна при условии, что она является косметически или фармацевтически приемлемой. Косметически или фармацевтически приемлемые соли пептидов по изобретению могут быть получены обычными способами, которые известны из уровня техники.

Синтез пептидов по изобретению может быть осуществлен обычными способами, известными из уровня техники, такими как, например, варианты способов твердофазного пептидного синтеза [Stewart J.M. and Young J.D. (1984) "Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition", Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois. Bodanzsky M. and Bodanzsky A. (1984) "The practice of Peptide Synthesis", Springer Verlag, New York; Lloyd-Williams, P., Albericio, F. and Giralt, E. (1997) "Chemical Approaches to the Synthesis ofPeptides and Proteins" CRC, Boca Raton (FL, USA)], синтез в растворе, комбинация твердофазного синтеза и методов синтеза в растворе или методов ферментативного синтеза [Kullmann W. (1980) "Proteases as catalysts for enzymic syntheses ofopioid peptides" J. Biol.Chem. 255, 8234-8238]. Пептиды могут также быть получены ферментацией бактериального штамма, который является немодифицированным или модифицирован методами генной инженерии для получения желательных последовательностей, или посредством контролируемого гидролиза белков животного или растительного происхождения, предпочтительно растительного происхождения, который высвобождает фрагменты пептида, содержащие по меньшей мере желательную последовательность.

Например, способ получения пептидов по изобретению представляет собой способ, при котором фрагмент пептида по изобретению, имеющий свободную карбоксильную группу или ее реакционноспособное производное, подвергают взаимодействию с дополнительным фрагментом, имеющим аминогруппу с по меньшей мере одним свободным атомом водорода с последующим образованием амидной связи, где функциональные группы указанных фрагментов, которые не принимают участия в образовании амидной связи, если они присутствуют, удобным образом защищены временными или перманентными защитными группами.

Другой пример способа получения пептидов по изобретению представляет собой способ, при котором фрагмент пептида по изобретению, содержащий уходящую группу, такую как, например, тозил, метилсульфонил и группы галогенов, подвергают взаимодействию с дополнительным фрагментом, имеющим аминогруппу с по меньшей мере одним свободным атомом водорода посредством реакции нуклеофильного замещения, где функциональные группы указанных фрагментов, которые не принимают участия в образовании связи N-С, если они присутствуют, удобным образом защищены временными или перманентными защитными группами. Примеры защитных групп, их введение и удаление описаны в литературе [Greene T.W. (1981) "Protective groups in organic synthesis" John Wiley & Sons, New Cork; Atherton B. and Sheppard R.C. (1989) "Solid Phase Peptide Synthesis: A practical approach" IRL Oxford University Press]. Термин "защитные группы" также включает полимерные подложки, используемые в твердофазном синтезе.

Пептиды по изобретению могут вводиться для регулирования нейронного экзоцитоза каким-либо образом, обеспечивающим контакт соединений с сайтом его действия в теле млекопитающего, предпочтительно человека, в форме, содержащей их композиции. В этом смысле изобретение предлагает косметическую или фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один пептид общей формулы (I) или его косметически или фармацевтически приемлемые соли. Указанные композиции могут быть получены посредством обычных способов, известных специалистам в данной области техники.

Пептиды по изобретению используют в косметической или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в косметически или фармацевтически эффективных концентрациях для достижения желательного эффекта; предпочтительно между 0,00000001% (по массе) и 20% (по массе); предпочтительно между 0,00001% (по массе) и 10% (по массе) и более конкретно между 0,0001% (по масе) и 5% (по массе).

Пептиды по настоящему изобретению имеют различную растворимость в воде в зависимости от природы их последовательности или имеющихся в них модификациях по амино- и карбокситерминальным концам. Пептиды, которые не растворимы в воде, могут быть солюбилизированы в обычных косметически или фармацевтически приемлемых растворителях, таких как, например, этанол, пропанол или изопропанол, пропиленгликоль, глицерин, бутиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Фармацевтически эффективное количество пептидов и/или фармацевтических композиций согласно изобретению, которое должно быть введено для лечения патологических состояний, так же как и их дозировка, будет зависеть от ряда факторов, включая возраст, состояние пациента, серьезность нарушения или заболевания, способ и частоту введения и от конкретных пептидов, которые будут применяться.

Фармацевтические композиции, содержащие пептиды по изобретению, могут иметь любую форму для введения, например, твердую или жидкую, и могут быть введены любым подходящим путем, например перорально, интраназально, парентерально, ректально, местно или трансдермально, для чего они будут включать необходимые фармацевтические эксципиенты для изготовления желательной формы введения. В контексте настоящего изобретения термин "перентеральный" включает подкожные, кожные, внутрисосудистые инъекции, такие как, например, внутривенные, внутримышечные, во внутримозговой канал, внутричерепные, внутрисуставные, внутриоболочковые и интраперитонеальные инъекции, так же как любые другие подобные методики инъекции или инфузии. Обзор различных фармацевтических форм введения лекарственных продуктов и необходимых эксципиентов для их изготовления может быть найден, например, в "Tratado de Farmacia Galenica", C. Fault i Trillo, 1993, Luzan 5, S.A. Ediciones, Madrid.

Пептиды по изобретению могут также быть включены в косметические или фармацевтические системы с замедленным высвобождением и/или системы носителей, такие как липосомы, милличастицы, микрочастицы и наночастицы, губки, везикулы, мицеллы, миллисферы, микросферы и наносферы, липосферы, милликапсулы, микрокапсулы и нанокапсулы, а также в микроэмульсии и наноэмульсии, с целью достижения лучшего проникновения активного ингредиента и/или улучшения его фармакокинетических и фармакодинамических свойств. Препараты с контролируемым высвобождением могут быть получены посредством способов, известных в уровне техники, и могут быть введены посредством, например, местного введения, включая адгезивные пластыри, или перорально, ректально или подкожной имплантацией, либо прямой имплантацией в конкретную часть тела, и должны предпочтительно высвобождать относительно постоянное количество пептидов по изобретению. Количество пептида, содержащегося в препарате с контролируемым высвобождением, будет зависеть от, например, сайта введения, кинетики и длительности высвобождения пептида по изобретению, а также от природы состояния, которое лечат или предупреждают.

Пептиды по настоящему изобретению могут также быть адсорбированы на твердых органических полимерных или минеральных подложках, таких как, например, тальк, бентонит, диоксид кремния, крахмал или мальтодекстрин.

Косметические или фармацевтические препараты, содержащие пептиды по настоящему изобретению, могут использоваться в различных типах препаратов для местного применения, таких как, например, без ограничения ими, крема, эмульсии масла и/или силикона в воде, эмульсии воды в масле и/или силиконе, масла, молочко, бальзамы, пена, лосьоны, гели, линименты, сыворотки, мыла, мази, пена, мази, муссы, помады, пластинки, карандаши и спреи, включая "закрепляемые" и "смываемые" препараты, и могут также быть включены посредством методик, известных специалистам в данной области техники, в различные типы твердых носителей, таких как тканые материалы, гидрогели, адгезивные (или неадгезивные) пластыри или маски для лица, или могут быть включены в различные косметические продукты, такие как, например, декоративная косметика, лосьоны, молочко для удаления макияжа, тональные кремы, тени для век и помады.

Пептиды могут также быть включены в материалы для изготовления покрытий, которые находятся в прямом контакте с кожей организма, так что пептиды по изобретению высвобождаются посредством биодеградации системы с закреплением на ткани или посредством трения покрытия с телом, под действием влаги тела, рН кожи или температуры тела. Примеры покрытий, материалов и средств для иммобилизации пептидов в тканях, включая микрокапсулирование, описаны в литературе и известны из уровня техники [Schaab C.K. (1986) "Impregnating Fabrics With Microcapsules", HAPPI May 1986; Nelson G. (2002) "Application of microencapsutation in textiles" Int. J. Pharm. 242, 55-62]. Предпочтительные покрытия представляют собой бандажи.

Косметическая или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть применена в участках тела, требующих лечения или ухода посредством подкожной инъекции, внутрикожной инъекции, паровых обертываний или посредством ионофореза с целью достижения лучшего проникновения активного ингредиента. Область применения определяется природой состояния, которое следует лечить. Предпочтительной областью нанесения является область лба, имеющая мимические морщины, а также пространство между бровями, морщины и тонкие линии вокруг рта и/или вокруг глаз.

Косметическая или фармацевтическая композиция, заявленная в настоящем изобретении, может содержать дополнительные ингредиенты, обычно используемые в композициях для того, чтобы ухаживать, очищать и обрабатывать кожу, такие как, например, без ограничения, эмульгирующие агенты, смягчающие средства, органические растворители, кондиционеры для ухода за кожей, такие как, например, увлажнители, альфа-гидроксикислоты, увлажнители, витамины, пигменты или красители, желирующие полимеры, загустители, пластификаторы, агенты против морщин, агенты, которые могут уменьшать или лечить мешки под глазами, отбеливающие или депигментирующие агенты, отшелушивающие агенты, агенты против старения, агенты, улавливающие свободные радикалы и/или атмосферные загрязнения, агенты, ингибирующие NO-синтазу, антиокислители, компоненты против гликирования, противомикробные агенты, противогрибковые агенты, агенты, стимулирующие синтез дермальных или эпидермальных макромолекул и/или способные ингибировать их разложение, такие как, например, агенты, стимулирующие синтез коллагена, агенты, стимулирующие синтез эластина, агенты, стимулирующие синтез декорина, агенты, стимулирующие синтез ламинина, агенты, ингибирующие разложение коллагена, агенты, ингибирующие разложение эластина, агенты, стимулирующие пролиферацию фибробластов, агенты, стимулирующие пролифер