Биоинженерный конструкт для имплантации ткани и способ изготовления названного биоинженерного конструкта (варианты)

Биоинженерный конструкт для имплантации ткани и способ изготовления названного биоинженерного конструкта (варианты)

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области тканевой инженерии. Настоящее изобретение направлено на способ изготовления биоинженерного конструкта. Указанные бионженерные конструкты биологически совместимы и способны к биоремоделированию, а также могут использоваться в клинических целях.

Уровень техники

Объект настоящего изобретения имеет отношение к дисциплинам тканевой инженерии, регенерации ткани и регенеративной медицины, объединяющей методы биоинженерии с принципами наук о жизни для понимания структурных и функциональных связей в нормальных и патологических тканях млекопитающих. Общая цель этих дисциплин - развитие и конечное применение биологических заместителей для восстановления, поддержания или улучшения функций ткани. Таким образом, возможно спроектировать и изготовить биоинженерную ткань в лаборатории. Биоинженерные ткани могут включать клетки, которые обычно связываются с природными тканями млекопитающих или человека и синтетическими или естественными матричными подложками. Новая биоинженерная ткань должна быть функциональной после трансплантации в организм и быть надолго инкорпорирована в организм или постепенно ремоделирована (сделана заново) клетками биоинженерной ткани или организма реципиента. Изготовление биоинженерных тканевых конструктов без инкорпорации или опоры на экзогенные опорные элементы или подложки приводит к научным проблемам, заключающимся в создании новых биоинженерных тканевых конструктов.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к биоинженерным конструктам ткани, продуцированным культивированными клетками и эндогенно продуцированным внеклеточным матричным компонентам без необходимости в экзогенных матричных компонентах или поддержки среды или компонентов подложки. Изобретение, таким образом, предпочтительно может быть сделанным полностью из клеток человека и человеческих матричных компонентов, продуцированных этими клетками, например, когда биоинженерный конструкт ткани разработан для использования у людей.

Изобретение также относится к способам производства конструктов ткани посредством стимуляции клеток в культуре, таких как фибробласты, для продуцирования внеклеточнах матричных компонентов без добавления экзогенных матричных компонентов, поддержки среды или элементов подложки.

Изобретение также относится к способам производства конструктов ткани посредством стимуляции клеток в культуре, таких как фибробласты, для производства внеклеточных матричных компонентов в системе среды определенного состава и/или без использования неопределенных или "полученных не из человека" биологических компонентов, таких как бычья сыворотка или экстракты органов.

Дополнительно, изобретение относится к биоинженерным конструктам, включающим девитализированный и/или децеллюляризированный слой внеклеточного матрикса, продуцированный и собранный культивированными клетками, продуцирующими внеклеточный матрикс.

Также дополнительно, изобретение относится к способу создания биоинженерного конструкта, включающему производство двух или более слоев эндогенно продуцированных внеклеточных матриксов и последующей девитализации и/или децеллюляризации клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс и объединения этих двух или более слоев посредством связывающих и/или биологически совместимых и способных к биологическому ремоделированию адгезивных растворов.

Биоинженерный конструкт ткани произведен и самособран культивированными клетками без необходимости в поддержке подложкой или дополнении экзогенными внеклеточными матричными компонентами.

Ранее сконструированные конструкты живой ткани были собраны не полностью из клеток и должны были поддерживаться или на дополнении или на инкорпорации экзогенных матричных компонентов или синтетических элементов для структурирования или поддержки, или и того и другого.

Биоинженерные конструкты ткани, описаные здесь, демонстрируют многие из врожденных особенностей ткани, из которой получены их клетки. Конструкты ткани, полученные таким образом, могут использоваться для трансплантации субъекту или для тестирования in vitro.

В одном предпочтительном воплощении изобретение представляет собой клеточно-матричный конструкт, включающий клетки первого типа и эндогенно продуцированный внеклеточный матрикс, где клетки первого типа способны к синтезу и секреции внеклеточного матрикса для получения клеточно-матричного конструкта.

В другом предпочтительном воплощении изобретение представляет собой двухслойный конструкт, включающий клетки первого типа и эндогенно продуцированный внеклеточный матрикс, и слой клеток второго типа, расположенного вслед за или внутри клеточно-матричного конструкта, сформированного первым типом клеток.

Более предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой клеточно-матричный конструкт, включающий фибробласты, такие как произведенные дермой, для формирования культивированного конструкта кожи.

Другое более предпочтительное воплощение представляет собой клеточно-матричный конструкт, включающий фибробласты, такие как полученные из дермы, для формирования выращиваемого конструкта кожи со слоем кератиноцитов, культивированных для последующего формирования эпидермального слоя, чтобы в результате получить культивированный двухслойный конструкт кожи. Культивированные конструкты кожи изобретения обладают многими физическими, морфологическими и биохимическими особенностями природной кожи.

В еще более предпочтительном воплощении клеточно-матричный конструкт представляет собой конструкт ткани, который подобен дерме кожи, конструкт человеческой кожи, который сформирован в определенной системе, включающей клетки, полученные от человека, без использования химически неопределенных компонентов во время их культивирования.

В наиболее предпочтительном воплощении изобретения конструкты ткани изобретения изготовлены в химически определенной системе, включающей клетки, полученные от человека, без химически неопределенных или отличных от человеческих биологических компонентов или клеток.

В одном предпочтительном воплощении изобретение включает структурный слой по крайней мере одного типа клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс, и эндогенно продуцированные внеклеточные матричные компоненты, для удобства названные "матрикс", где матрикс полностью синтезируется клеткой и собирается при культивировании клеток. Этот слой далее называют "клеточно-матричным конструктом", "клеточно-матричным слоем" или "клеточно-матричной пластиной", потому что клетки секретируют и сами находятся в пределах и по всему объему их матрикса. Культивированные конструкты ткани не нуждаются, и, таким образом, не содержат экзогенные матричные компоненты, то есть матричные компоненты, произведенные не культивированными клетками, а введенные другими способами. В более предпочтительном воплощении у клеточно-матричного конструкта, произведенного фибробластами кожи человека, как показано, имеется преобладающее содержание коллагена, подобного коллагену натуральной кожи. По данным электронной микроскопии матрикс является волокнистым по природе и включает коллаген, который показывает четвертной характер исчерченности с периодом 67 нм, также как и организацию упаковки фибрилл и связки фибрилл подобные натуральному коллагену. Отсроченная репозиция SDS-PAGE электрофореза показала наличие как типа I, так и типа III коллагена в этих конструктах, преобладающих типов коллагена, найденных в натуральной коже человека. Используя стандартные методы иммуногистохимии, клеточно-матричный конструкт кожи положительно окрашивается на присутствие декорина, дерматансульфатного протеогликана, ассоциированного, как известно, с фибриллами коллагена и, как предполагается, регулирующего диаметр фибрилл in vivo. Декорин может также визуализироваться в конструкте с помощью ТЭМ (туннельной элктронной микроскопии). Продуцированная ткань также окрашивается положительно на присутствие тенасцина, гликопротеида внеклеточного матрикса, найденного, например, в мезенхиме или тканях после репарации. Очень похожая на ткань после репарации in vivo ткань, произведенная в культуре, как было показано, увеличивала отношение содержания коллагена типа I к коллагену типа III по мере формирования матрикса. Не желая быть связанным теорией, считается, что клетки быстро заполняют открытое пространство между собой рыхлым матриксом, аналогичным гранулированной ткани, состоящей главным образом из коллагена III типа и фибронектина, и затем модифицируют этот рыхлый матрикс в более плотный матрикс, состоящий главным образом из коллагена I типа. Полученный клеточный матрикс, как показано, содержал глюкозаминогликаны (ГАГ), такие как гиалуроновая кислота, фибронектин, протеогликаны помимо декорина, такие как бигликан и верзикан и профиль сульфатированных глюкозаминогликанов, таких как дигиалуроновая кислота, ди-хондроитин-0-сульфат, ди-хондроитин-4-сульфат, ди-хондроитин-6-сульфат, ди-хондроитин-4,6-сульфат, ди-хондроитин-4-сульфат-UA-23; и дихондроитин-6-сульфат-UA-2S. Эти структурные и биохимические особенности проявляются, поскольку конструкт развивается в культуре и отчетливо видно, когда конструкт приближается к своей конечной форме. Наличие указанных компонентов в полностью сформированном культивированном клеточно-матричном конструкте кожи указывает, что конструкт обладает структурными и биохимическими особенностями, приближающимися к таковым особенностям нормальной дермы.

В то время как вышеупомянутый список является списком

биохимических и структурных особенностей культивируемого клеточно-матричного конструкта, сформированного из фибробластов кожи, должно быть понятно, что культивированные клеточно-матричные конструкты, сформированные из других типов фибробластов, воспроизведут многие из этих особенностей, а также другие фенотипические особенности типов ткани, из которых они получены. В некоторых случаях фибробласты могут быть индуцированы для экспрессии нефенотипических элементов посредством химического воздействия или контакта, физическим стрессом или трансгенными средствами. Другое предпочтительное воплощение изобретения представляет собой клеточно-матричный слой, имеющий второй слой клеток, расположенных вслед за первым. Второй слой клеток культивируется на клеточно-матричном слое для формирования биоинженерного двухслойного конструкта ткани. В более предпочтительном воплощении клетки второго слоя имеют эпителиальное происхождение. В наиболее предпочтительном воплощении второй слой клеток включает культивированные человеческие кератиноциты, которые находятся вместе с первым клеточно-матричным слоем, клеточно-матричный конструкт, сформированный из фибробластов кожи, и эндогенный матрикс для формирования слоя дермы включает конструкт живой кожи. После полного формирования эпидермальный слой является многослойным, стратифицированным и представляет собой высокодифференцированный слой кератиноцитов, которые формируют базальный слой, супрабазальный слой, зернистый слой и роговой слой. У конструкта кожи есть хорошо развитая базальная мембрана, представленная как дерма-эпидермальный переход как показала туннельная электронная микроскопия. Базальная мембрана является наиболее толстой вокруг гемидесмосом, отмеченных фиксирующими фибриллами, которые состоят из коллагена типа VII, как визуализируют с помощью ТЭМ. Фиксирующие фибриллы можно увидеть выходящими из базальной мембраны и переходящими в фибриллы коллагена в слое дермы. Эти фиксирующие фибриллы, так же как и другие компоненты базальной мембраны, секретируются кератиноцитами. Также известно, что, в то время как кератиноциты способны к самостоятельной секреции компонентов базальной мембраны, распознаваемая базальная мембрана не будет формироваться в отсутствие фибробластов. Иммуногистохимическое окрашивание конструкта кожи существующего изобретения также показало присутствие белка базальной мембраны ламинина.

В предпочтительном способе изобретения для формирования клеточно-матричного конструкта клетки первого типа (тип клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс) засеваются на подложку, культивируются и индуцируются для того, чтобы синтезировать и секретировать организованный внеклеточный матрикс вокруг себя для формирования клеточно-матричного конструкта. В другом предпочтительном способе изобретения поверхность клеточно-матричного конструкта засевается клетками второго типа и культивируется для формирования двухслойного конструкта ткани. В более предпочтительном способе конструкт, имеющий характеристики, подобные натуральной человеческой коже, сформирован на полную толщину кожи культивированными фибробластами, такими как фибробласты кожи человека в условиях, достаточных для индуцирования синтеза матрикса для формирования клеточно-матричного слоя кожи из клеток кожи и матрикса, на который засеваются и клуьтивируются человеческие эпителиоциты, такие как кератиноциты, в условиях, достаточных для формирования полностью дифференцированного, стратифицированного эпидермального слоя.

Таким образом, один из способов получения биоинженерных конструктов ткани существующего изобретения включает: (а) культивирование по крайней мере одного типа клеток, производящих внеклеточный матрикс в отсутствие экзогенных внеклеточных матричных компонентов или структурного элемента поддержки; (b) стимулирование клеток стадии (а) для синтеза, секреции и организации компонентов внеклеточного матрикса для формирования конструкта ткани, включающего клетки и матрикс, синтезированный этими клетками; в котором стадии (а) и (b) могут осуществляться одновременно или последовательно и, (с) девитализирование или децеллюляризация конструкта ткани, содержащего компоненты матрикса, для клинического использования. Два или более девитализированных или децеллюляризированных конструкта ткани могут быть соединены вместе и связаны вместе каждый посредством сшивания или с использованием биосовместимого или биорассасывающегося связующего вещества.

Приготовление питательных сред

Клеточно-матричные конструкты сформированы культивированными клетками в питательной среде, которая поддерживает жизнеспособность клеток, пролиферацию и синтез внеклеточных матричных компонентов клетками. Питательная среда состоит из питательной основы, обычно дополнительно подкрепленной другими компонентами. Квалифицированный специалист может подобрать соответствующие питательные основы в области культивирования клеток животных с приемлемыми ожиданиями успешного производства конструкта ткани по изобретению. Множество коммерчески доступных питательных сред могут использоваться в способах осуществления существующего изобретения. Они включают коммерчески доступные питательные источники, которые поставляют неорганические соли, источники энергии, аминокислоты и В-витамины, например питательная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), минимальная поддерживающая среда (MEM), M199, РПМИ 1640, среда Дульбекко в модификации Исков (EDMEM). Минимальная поддерживающая среда и M199 требуют дополнительного включения предшественников фосфолипидов и заменимых аминокислот. Коммерчески доступные богатые витаминами смеси, которые служат источником дополнительных аминокислот, нуклеиновых кислот, кофакторов ферментов, предшественников фосфолипидов и неорганических солей включают среды Хэма F-12 и F-10, NCTC 109 и NCTC 135. Хоть и в различных концентрациях, все базальные среды поставляют основные питательные вещества для клеток в форме глюкозы, аминокислот, витаминов и неорганических ионов вместе с другими основными компонентами питательных сред. Самая предпочтительная базальная питательная среда для изобретения включает питательную основу или без кальция или с низким содержанием кальция: питательную среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM) или, альтернативно, DMEM и среду Хэма F-12 при соотношении от 3:1 до 1:3 соответственно.

Базальная питательная среда дополняется такими компонентами, как аминокислоты, факторы роста и гормоны. Определенные питательные среды для культивирования клеток по изобретению описаны в патенте США №5712163, Международной публикации PCT № WO 95/31473 и публикации РСТ № WO 00/29553, содержание которых включены здесь посредством ссылки. Другие питательные среды известны в уровне техники, например раскрытые в статье Ham и McKeehan, Methods in Enzymology, 58:44-93 (1979), или другие подходящие среды определенного химического состава у Bottenstein et al., Methods in Enzymology, 58:94-109 (1979). В предпочтительном воплощении базальная питательная среда дополнена следующими компонентами, известными квалифицированному специалисту в области культивирования клеток животных: инсулин, трансферрин, трийодтиронин (ТЗ), и вместе или по отдельности этаноламин и о-фосфорил-этаноламин, где концентрации и замены добавок могут быть определены квалифицированным специалистом.

Составы питательных сред, подходящие для использования в существующем изобретении, выбираются в зависимости от типов клеток, которые будут культивироваться и в зависимости от структуры ткани, которая будет продуцирована. Используемая питательная среда и определенные условия культивирования должны поддерживать рост клеток, синтез матрикса, и их жизнеспособность будет зависеть от типа клеток или комбинаций типов клеток, которые должны быть выращены.

В некоторых случаях, таких как изготовление биоинженерных двухслойных конструктов кожи существующего изобретения, состав питательных сред меняется в зависимости от каждой стадии изготовления, поскольку различные добавки необходимы для различных задач. В предпочтительном способе клеточно-матричный слой сформирован в определенных условиях, то есть культивируется в средах определенного химического состава. В другом предпочтительном способе конструкт ткани включает клеточно-матричный слой, предусматривающий второй слой клеток, расположенных и культивируемых вслед за первым, где оба типа клеток культивируются в системе питательной среды с определенным химическим составом. Альтернативно, конструкт ткани включает клеточно-матричный слой, изготовленный в условиях среды определенного (химического) состава и второй слой, сформированный вслед за первым в условиях питательной среды неопределенного состава. С другой стороны конструкт ткани включает клеточно-матричный слой, который может быть изготовлен в условиях питательной среды неопределенного состава и второй слой, сформированный вслед за первым в условиях питательной среды определенного состава.

Использование питательных сред с определенным химическим составом предпочтительно, то есть питательные среды, свободные от неопределенных экстрактов органов и тканей животных, например, сыворотки, экстракта гипофиза, гипоталамического экстракта, плацентарного экстракта или зародышевого экстракта или белков и факторов, секретированных питающими клетками. В самом предпочтительном воплощении питательные среды свободны от неопределенных компонентов и биологических компонентов, полученных из животных источников, отличных от человека. Несмотря на то что добавление неопределенных компонентов нежелательно, они могут использоваться в соответствии с раскрытыми способами на любой стадии культивирования для успешного изготовления конструкта ткани. Когда изобретение выполнено, использующиеся скринированные клетки человека, культивируются с использованием химически определенных компонентов, полученных только из человеческих источников, с получением в результате конструкта ткани, который представляет собой конструкт определенной ткани человека. Синтетические или рекомбинантные функциональные эквиваленты могут также быть добавлены для поддержания среды определенного химического состава в пределах области определения химической определенности для использования в наиболее предпочтительном способе изготовления. В целом, любой квалифицированный в области клеточного культивирования специалист будет в состоянии определить подходящие натуральные человеческие, человеческие рекомбинантные или синтетические эквиваленты широко известным компонентам животных для поддержания питательной среды изобретения без неуместного исследования или экспериментирования. Преимущества в использовании такого конструкта в клинике состоят в том, что уменьшается риск адвентициального животного или межвидового вирусного загрязнения и инфекции. В сценарии тестирования преимущества химически определенного конструкта состоят в том, что при проведении тестирования нет никаких ошибок в результатах из-за наличия неопределенных компонентов.

Инсулин является полипептидным гормоном, который способствует поглощению глюкозы и аминокислот для обеспечения длительного благоприятного воздействия посредством многочисленных путей. Добавление инсулина или инсулиноподобного фактора роста (ИФР) необходимо для длительного культивирования, поскольку есть риск истощения способности клеток к поглощению глюкозы и аминокислот и возможен риск деградации фенотипа клеток. Инсулин может быть получен или из животных организмов, например бык и человеческие источники, или рекомбинантными средствами, например человеческий рекомбинантный инсулин. Таким образом, человеческий инсулин признавался бы как химически определенный компонент, не полученный из биологического источника, отличного от человека. Добавление инсулина желательно для последовательного культивирования и добавляется к питательным средам в широком диапазоне концентраций. Предпочтительный диапазон концентрации от приблизительно 0,1 мкг/мл до приблизительно 500 мкг/мл, более предпочтительно в концентрации от приблизительно 5 мкг/мл до приблизительно 400 мкг/мл и наиболее предпочтительно приблизительно 375 мкг/мл. Подходящие концентрации для добавления инсулиноподобного фактора роста, такого как ИФР-1 или ИФР-2 и т.п. могут быть легко определены любым из квалифицированных специалистов в области типов клеток, выбранных для культивирования.

Трансферрин добавляется в питательную среду для регуляции транспорта железа. Железо представляет собой важный микроэлемент, найденный в сыворотке. Поскольку железо в его свободной форме может быть токсичным для клеток, в сыворотке, из которой оно поставляется клеткам, железо связано с трансферрином в диапазоне концентраций предпочтительно от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мкг/мл, более предпочтительно приблизительно 5 мкг/мл.

Трийодтиронин (ТЗ) является основным компонентом и представляет собой активную форму гормона щитовидной железы, который включается в питательную среду для поддержания нормального метаболизма клеток. Трийодтиронин добавляется к питательной среде в диапазоне концентраций от приблизительно 0 до приблизительно 400 пМ, более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 200 пМ и наиболее предпочтительно приблизительно 20 пМ.

Этаноламин и/или о-фосфорил-этаноламин, которые являются фосфолипидами, добавляются из-за их функции - каждый из них является важным предшественником в пути инозитола и метаболизме жирных кислот. Добавление липидов, которые обычно находятся в сыворотке, необходимо в бессывороточной питательной среде. Этаноламин и о-фосфорил-этаноламин добавляются к питательным средам в диапазоне концентраций от приблизительно 10^-6 до приблизительно 10^-2 М, более предпочтительно приблизительно 1×10^-4 М.

В течение всего процесса культивирования базальная питательная среда дополнительно подкрепляется другими компонентами для индуцирования синтеза или дифференцирования или улучшения роста клеток, такими как гидрокортизон, селен и L-глютамин.

Гидрокортизон, как было показано, при культивировании кератиноцитов индуцировал фенотип кератиноцита и поэтому увеличивал характеристики дифференцирования, такие как содержание инволюкрина и трансглютаминазы кератиноцитов (Rubin et al., J. Cell Physiol., 138:208-214 (1986)). Таким образом, гидрокортизон представляет собой желательную добавку в случаях, когда необходимы указанные характеристики, например при формировании пластинчатых кератиноцитовых трансплантатов или конструктов кожи. Гидрокортизон может быть представлен в среде в диапазоне концентраций от приблизительно 0,01 мкг/мл до приблизительно 4,0 мкг/мл, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,4 мкг/мл до 16 мкг/мл.

Селенистая кислота добавляется к бессывороточным питательным средам для дополнения микроэлементами селена, обычно обеспечиваемого сывороткой. Селенистая кислота может быть представлена в диапазоне концентрации от приблизительно 10^-9 М до приблизительно 10^-7 М, наиболее предпочтительно приблизительно 5,3×10^-8 М.

Аминокислота L-глютамин присутствует в некоторых питательных основах и может быть добавлена в случаях, когда отсутствует или представлено недостаточное количество аминокислоты. L-глютамин также может добавляться в устойчивой форме, такой как продающейся под маркой GlutaMAX-1™ (Gibco BRL, Grand Island, NY). GlutaMAX-1™ является устойчивой формой дипептида L-аланил-L-глутамин и может использоваться попеременно с L-глютамином или добавляться в эквимолярных концентрациях как замена L-глютамину. Дипептид обеспечивает стабильность L-глютамину от деградации в течение долгого времени при хранении и во время инкубации, которая может привести к неуверенности в эффективной концентрации L-глютамина в питательной среде. Как правило, базальная питательная среда обогащена предпочтительно от приблизительно 1 мМ до приблизительно 6 мМ, более предпочтительно от приблизительно 2 мМ до приблизительно 5 мМ и наиболее предпочтительно 4-мМ L-глютамином или GlutaMAX-1™.

Факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЭФР), также могут быть добавлены к питательной среде, чтобы помочь в приживаемости культур посредством роста и отбора клеток. ЭФР может использоваться в нативной или рекомбинантной формах. Человеческие формы ЭФР, природные или рекомбинантные, предпочтительны для использования в питательной среде, в случае когда изготовляют эквивалент кожи, не содержащий биологических компонентов, отличных от человеческих. ЭФР представляет собой дополнительный компонент и может быть представлен в концентрации от приблизительно 1 до 15 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 5 до 10 нг/мл.

Другие добавки также могут быть добавлены к питательной среде, такие как один или более простагландинов, трансформирующие факторы роста (включая трансформирующий фактор роста α или β), фактор роста кератиноцитов (ФРК), фактор роста соединительной ткани (ФРСТ) или манноза-6-фосфат (М6Ф) или их комбинации.

Простагландин Е₂ (ПГЕ₂) генерируется воздействием синтазы простагландина Е на простагландин Н₂ (ПГН₂). Было обнаружено несколько синтаз простагландинов Е. На сегодняшний день синтаза-1 микросомального простагландина Е выступает в качестве ключевого фермента в формировании ПГЕ₂. ПГЕ₂ добавляется к питательной среде предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,000038 мкг/мл до приблизительно 0,760 мкг/мл, более предпочтительно от приблизительно 0,00038 мкг/мл до приблизительно 0,076 мкг/мл, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,0038 мкг/мл до приблизительно 0,038 мкг/мл. 16,16 форма ПГЕ₂ может также быть добавлена в указанных диапазонах концентрации.

Альфа-трансформирующий фактора роста (ТФР-α) производится в макрофагах, клетках мозга и кератиноцитах и индуцирует развитие эпителия. Эти свойтва тесно связаны с ЭФР и также могут быть связаны с рецептором ЭФР, обладающими подобными эффектами. В изобретении предпочтительно используется длинная форма цепи ТФР-α. ТФР-α представляет собой маленький (около 50 остатков) белок, который обладает 30% структурной гомологией с ЭФР и конкурирует с ним за один и тот же поверхностно-связывающий сайт рецептора. Указанные процессы вовлечены в заживление ран и вызывают фенотипические изменения в определенных клетках. ТФР-α или длинная цепь ТФР-α добавляются к питательной среде предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,0005 мкг/мл до приблизительно 0,30 мкг/мл, более предпочтительно от приблизительно 0,0050 мкг/мл до приблизительно 0,03 мкг/мл, наиболее предпочтительно от приблизительно 0,01 мкг/мл до приблизительно 0,02 мкг/мл.

Дополнение базовой питательной среды фактором роста кератиноцитов в концентрации 5 мкг/мл может использоваться для поддержания эпидермализации (роста кожи). Фактор роста кератиноцитов добавляется к питательной среде предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,001 мкг/мл до приблизительно 0,150 мкг/мл, более предпочтительно от приблизительно 0,0025 мкг/мл до приблизительно 0,100 мкг/мл, наиболее предпочтительно приблизительно от 0,005 мкг/мл до приблизительно 0,015 мкг/мл.

Добавление к базовой питательной среде манноза-6-фосфата (М6Ф) может использоваться для поддержки эпидермализации (образования кожи). Манноза-6-фосфат добавляется к питательной среде предпочтительно в диапазоне от приблизительно 0,0005 мг/мл до приблизительно 0,0500 мг/мл.

ФРСТ (фактор роста соединительной ткани) является богатым цистеином, матрикс-ассоциированным, гепарин-связывающим белком. In vitro, ФРСТ повторяет некоторые из эффектов ТФР-β на фибробластах кожи, такие как стимуляция продукции внеклеточного матрикса, хемотаксиса, пролиферации и экспрессии интегринов. ФРСТ может вызвать рост эндотелиальных клеток, миграцию, адгезию и выживание и таким образом участвует в функции эндотелиальных клеток и ангиогенезе. ФРСТ связывается с перлеканом - протеогликаном, который был найден в синовиальной оболочке, хряще и многочисленных других тканях. ФРСТ участвует во внеклеточном ремоделировании матрикса в процессе заживления ран, склеродермии и других фиброзных процессах, благодаря своей способности к активированию матричных металлопротеиназ (ММП) и их ингибиторов. Таким образом, у ФРСТ есть потенциал для активирования как синтеза, так и деградации внеклеточного матрикса.

Питательные среды, описанные выше, обычно готовятся как показано далее. Однако нужно понимать, что компоненты существующего изобретения могут быть получены и собраны с использованием обычных способов, совместимых с их физическими свойствами. В уровне техники известна замена определенных компонентов подходящими аналогами или функционально эквивалентными действующими средствами с целью доступности или экономики и получением аналогичных результатов. Естественные факторы роста можно заменить рекомбинантными или синтетическими факторами роста, у которых есть аналогичные качества и результаты при использовании в исполнении изобретения.

Питательные среды в соответствии с существующим изобретением стерильны. Стерильные компоненты были куплены стерильными или стерилизовались обычными процедурами, такими как фильтрация, после получения. Надлежащие асептические процедуры использовались в каждом из следующих примеров. DMЕМ и среда Хэма F-12 были сначала объединены, и затем к ним добавили отдельные компоненты для получения готовой питательной среды. Основные (стоковые) растворы всех компонентов могут храниться при -20°С, за исключением источника питательных веществ, который может храниться при 4°С. Все основные растворы, упомянутые выше, были получены в 500Х конечной концентрации. Основные растворы инсулина, трансферрина и трийодтиронина (все куплены у Sigma) получали следующим образом: трийодтиронин первоначально растворяли в абсолютном этаноле в 1 н. соляной кислоте (HCl) при соотношении 2:1. Инсулин был растворен в разбавленной HCl (приблизительно 0,1 н.), и трансферрин был растворен в воде. Указанные три белка затем смешали и разбавили водой до 500Х концентрации. Этаноламин и о-фосфорил-этаноламин были растворены в воде до 500Х концентрации и были стерилизованы фильтрацией. Прогестерон растворили в абсолютном этаноле и разбавили водой. Гидрокортизон был растворен в абсолютном этаноле и разбавлен фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ). Селен был растворен в воде до 500Х концентрации и стерилизован фильтрацией. ЭФР был куплен стерильным и разводился в ФСБ. Аденин является малорастворимым, но может быть растворен любым из способов, известных квалифицированным в области техники специалистам. Сывороточный альбумин может добавляться к определенным компонентам для их стабилизации в растворах и может быть получен или от человека или из животных источников. Например, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) или бычий сывороточный альбумин (БСА) могут быть добавлены, чтобы поддержать активность прогестерона и основных растворов ЭФР при длительном хранении. Были разработаны рекомбинантные формы альбумина, такие как человеческий рекомбинантный альбумин, и предпочтительно их использование вместо форм, полученных из сыворотки человека или быка. Питательная среда может использоваться или сразу после приготовления или храниться при температуре 4°С. Если питательная среда находится на хранении, ЭФР не должен быть добавлен до времени использования.

Для формирования клеточно-матричного слоя посредством культивирования производящих матрикс клеток в питательную среду добавляются дополнительные средства, которые вызывают синтез матрикса и депонирование клетками. Эти дополнительные средства совместимы с клетками, определены с высокой степенью чистоты и свободны от примесей. Питательную среду, используемую, чтобы произвести клеточно-матричный слой, называют "средой продукции матрикса".

Чтобы приготовить среду продукции матрикса, базовая питательная среда дополняется производными аскорбата, такими как аскорбат натрия, аскорбиновая кислота или одна из ее более химически устойчивых производных, таких как n-гидрат магниевой соли фосфат L-аскорбиновой кислоты. Аскорбат добавляется для гидроксилирования пролина и секреции проколлагена, растворимого предшественника депонированных молекул коллагена. Аскорбат, как было показано, является важным кофактором для пост-трансляционного процессинга других ферментов также как он является активатором синтеза коллагена типа I и III типа.

Не связывая себя никакими теориями, добавление в питательную среду аминокислот, вовлеченных в синтез белка, сохраняет клеточную энергию, не требуя непосредственного производства аминокислот самими клетками. Добавление пролина и глицина предпочтительно, поскольку они, также как и гидроксилированная форма пролина, гидроксипролин, являются основными аминокислотами, которые формируют структуру коллагена.

Хотя и необязательно, среда продукции матрикса дополнительно содержит нейтральный полимер. Клеточно-матричные конструкты изобретения могут быть произведены без нейтрального полимера, но, не связывая никакой теорией, его наличие в среде продукции матрикса может сделать процессинг и депонирование коллагена между образцами более согласованным. Одним из предпочтительных нейтральных полимером является полиэтиленгликоль (ПЭГ), который показал активирование in vitro процессинга растворимого предшественника проколлагена, произведенного культивированными клетками в депонированный коллаген матрикса. Питательные среды по изобретению предпочтительно содержат ПЭГ тканевых культур в диапазоне от приблизительно 1000 до приблизительно 4000 Да (молекулярная масса), более предпочтительно от приблизительно 3400 до приблизительно 3700 Да. Предпочтительные концентрации ПЭГ для использования в способе по изобретению может быть приблизительно 5 мас./об.% или менее, предпочтительно от приблизительно 0,01 мас./об.% до приблизительно 0,5 мас./об.%, более предпочтительно от приблизительно 0,025 мас./об.% до приблизительно 0,2 мас./об.%, наиболее предпочтительно приблизительно 0,05 мас./об.%. Другой класс нейтрального полимера для культивирования представляет собой подобный декстрану, предпочтительно декстран Т-40, или поливинилпирролидон (ПВП), предпочтительно с молекулярной массой в диапазоне 30000-40000 Да, может также использоваться в концентрациях приблизительно 5 мас./об.% или м